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流式细胞技术基本原理及应用 PPT

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流式细胞术简介及应用进展课件

流式细胞术简介及应用进展课件

流式细胞术简介及应用进展
15
▪高速度：分析细胞数：1000个/s→60000个/s ▪高灵敏度：荧光分子数/细胞：3000→100个FITC； ▪高准确度：区分两个细胞：参数：相差5% →1%； ▪高精度：CV值：7% →< 1%; ▪多参数：荧光：1个 →12个参数； ▪高纯度：分选细胞：80-90% →99.9%; ▪其 它：荧光信号：线性检测→对数检测
电子程序化单细胞分选仪——Electronically programmable individual cell sorter, EPICS (Coulter公司）
流式细胞术简介及应用进展
5
BD FACSCalibur型 FCM （单L，3F）
流式细胞术简介及应用进展
6
Coulter EPICS XL/XL-MCL （单L，4F）
流式细胞术简介及应用进展
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BD FACSAria
BD FACSCount
CD3\4\8 专为HIV监测设计的经济普及型流式细胞仪
流式细胞术简介及应用进展
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BD FACSCanto 2L 6C
流式细胞术简介及应用进展
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BD FACS Calibur 1L 4C
流式细胞术简介及应用进展
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三、流式细胞术应用的新进展
流式细胞术简介及应用进展
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2、cytometric bead array (CBA)
微球流式芯片技术(CBA)是一种微球多参数检测分析技 术，它用一系列的微球组合来捕获并结合流式细胞术检 测溶液中被检测物质的量，其采用夹心法分析策略。用 已知的标准品和对照标准曲线就可得出被测样品的浓度。 这种检测方法，既不受样品量的限制，也可同时检测多 项指标参数；客观、省时、人为因素影响小。

流式细胞术及其应用PPT

流式细胞术及其应用PPT

Identify Th1 Cells human IL-2
producing cells
PerCP/Cy5.5 Anti-human IL-2 PE Anti-human CD3
PMA + ionomycin-stimulated (6 hours) human peripheral blood lymphocytes intracellular stained with MQ1-17H12 PerCP/Cy5.5 and CD3 (UCHT1) PE
Anti-human IL-17 Alexa Fuor® 647/CD3 FITC/CD4 PE cocktail
CD3 FITC
PMA/ionomycin-stimulated (6hr) human peripheral blood lymphocytes stained with Human Th17 flow(TM) (one-step) kit. Dot plot analysis is derived from gated in CD3+ cell population.
SSC
Forward Light Detector Cell Surface Area
FSC
前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC, Side Scatter） 细胞粒度及细胞内相对复杂性
外周全血细胞散射光双参数点图 （红细胞溶解后）
研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人 工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并 加以定量


光学系统
散射光信号
Right Angle Light Detector Cellensor

流式细胞术实验技巧及数据分析ppt课件

流式细胞术实验技巧及数据分析ppt课件

FITC+T red
488
568
FITC+PeCy5 488
FITC+ ECD
488
F+P +PeCy5
488
F+ ECD +PeCy5 488
F+P +PeCy5 +APC 488
633
525 、575
绿色、橙色
525
绿色
615
红色
525、 675
绿色、 红色
525、 625
绿色、橙红色
525、575、675
17
流式细胞术操作流程：
培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋
单细胞悬液 制备
荧光抗体标记
上机检测
表型测定 细胞分选
统 计 学 分 析
FISH PCR
继 续 培 养
18
单 分 散 细 胞
19
FSC
FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关
20
SSC
SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关
21
细胞散色光信号
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排除双联体细胞
27
细胞阻滞在G2M期
28
双 克 隆 细 胞 周 期 分 析
29
BrdUrd和DNA双标记染色
溴脱氧尿嘧啶核苷( Bromodeoxyuridine， BrdUrd )是胸苷的一种类似物。它可以替代
胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNA分子中，成为S 期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUrd 单克隆抗体免疫荧光和PI双参数检测细胞，不仅 可检测一个细胞群体的动力学参数和DNA含量，同
层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层流 的形成要满足雷诺数

《流式细胞技术》PPT课件

《流式细胞技术》PPT课件

完整版ppt
34
CBA(Cytometric Bead Array)
完整版ppt
35
Traditional Analysis -- Percent positive
Po s i t i v e Ce l l
Ne g a ti v e Ce l l
CDX PE
TraditionalAnalysis— PercentPositives
43
3）DNA倍体：主要比较G0/G1期细胞DNA含量 的变化。用DNA指数（DI）表示。
DNA指数=测量样本G0/G1期DNA含量/正常人 淋巴细胞G0/G1期DNA含量
以正常人淋巴细胞作为对照。
正常细胞DNA指数为1.00，DNA指数＞1，为超 2倍体，＜1为亚2倍体，两者可统称为非整倍 体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志，实体 肿瘤中出现频率较高。
完整版ppt
42
2）利用DNA的荧光染料，如PI （Propidium iodide碘化丙啶），与细胞 内的DNA结合，可反映细胞内DNA含量。 采用DNA直方图显示。具有2C DNA含量 细胞为G0/G1期细胞，4C DNA含量细胞 为G2/M期细胞，DNA含量介于两者之间 的细胞为S期细胞。
完整版ppt
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作者：笛风
1
基本概念
1、流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物 理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗 技术为一体的高科技细胞分析仪。
2、流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞 仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参 数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分 析和分选（纯度可达99%以上）的技术。
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《流式细胞术的原理》PPT课件

《流式细胞术的原理》PPT课件
补偿不好调。 4. 尽量选择应用广、亮度高的荧光素 5. — 荧光素的强弱用Stain Index染色指数来表示，
数值越大，信噪比越高。 6. 多色实验中，亮度高的荧光素搭配表达量低的目
标抗原 7. — 例如，PE， APC这类大分子蛋白相对亮度高。 8. 关注F/P比值
BD网站提供每一种荧
光素的激发以及发射光 谱
流式细胞仪的根本构造 以及原理
流式细胞仪的根本构造 以及工作原理
•虽然每款流式细胞仪有各自的特征性构造，但是其 内部构造根本组成一样。
•根本构造一共分三局部： •液流系统 •光学系统 •电子系统
液流系统
液流系统包括
•流动室 flow chamber
Injector
Tip Sheath
fluid
•液流驱动系统
Fluorescence signals
Focused laser beam
鞘液三大作用： 防止堵塞喷孔 约束样本位于喷嘴中心、提高测量精度 保持细胞活性
液流系统
对灵敏度要求不是很苛刻的实验，可调高样本进样速率，从而 提高采样分析速度。
光学系统
主要由激发光源、光束成形及收集系统组成
数据显示
•二维点图 〔Dot Plot〕 •直方图〔Histogram〕 •等高线图 〔Contour Plot〕 •密度图 〔Density〕 •三维图〔3D Plot〕等·
流式细胞术操作流程
样本收集及 处理
制备单细胞 悬液
免疫荧光 染色
表型测定
统计学分 析
1.样本制备
样本来源
•血液 •骨髓 •淋巴结 •体液 〔尿液、脑脊液、胸腹腔积液〕 •灌洗液〔肺泡支气管〕 •加抗凝剂〔EDTA〕，室温保存，24h内

流式细胞术原理及应用 ppt课件

流式细胞术原理及应用 ppt课件
• 荧光染料/荧光化合物 PI、7-AAD等插入核酸链中； CFSE和蛋白质共价结合；
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
ppt课件
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常用荧光素
ppt课件
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常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
ppt课件
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• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
ppt课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
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• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
ppt课件
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细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
ppt课件
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三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体

流式细胞术原理及与肿瘤学的相关应用-PPT文档

• 1、新鲜或冰冻实体组织：酶消化法、机械法、化 学试剂处理法等。
• 剪碎法：取新鲜或冰冻（浸泡于生理盐水中）实 体组织0.5cm3，眼科手术剪剪碎，加入生理盐水 ，300目尼龙膜过滤，200ml离心5min，生理盐水 洗涤二次。
• 注意事项：由于各种实体组织成份、特性各不相 同，对不同的实体组织必须采用不同的单细胞分 散方法，才能使单细胞产量高，细胞损伤小。
• 1、散射光信号：FSC和SSC
前向散射光信号(FSC)：与激光束方向同轴的称前向散射光 信号，反映细胞大小
激光器
大颗粒
激光器
小颗粒
接收器
侧向散射光信号(SSC)：与激光束方向垂直的称为侧 向散射光信号，主要反映了细胞的内部结构，内 部结构越复杂，SSC信号越强，反映细胞内颗粒性 。
激光器
接收器
MDR是由多药耐药基因编码的P糖蛋白（Pgp）亲脂化合物，包括多种抗癌药物和荧光染料 的跨膜性排出泵。从人淋巴细胞排除荧光染料与 细胞内P-gp的含量直接相关。当淋巴细胞出现 MDR阳性细胞时，患者对化疗药物开始出现耐药 性，需要考虑其他治疗方式。
• FCM可精确定量DNA含量,评估做出判断
正常二倍体标准细胞G0/G1期细胞峰平均荧光道数
DNA倍体的判定标准
• 二倍体的DI为1.0，四倍体的DI为2.0。 • 变异系数（CV）：标准细胞CV ≤3%，新鲜组织
标本CV≤5%。 • 对于一个正常人体的二倍体细胞群，G0/G1期占
85-90%以上，S+G2M细胞占10-15%以下。
• 以二倍体参考细胞G0/G1期细胞DNA含 量定为2C值DI=1.0，基于标准二倍体 细胞的CV在5%以下，即判定标准： DNA二倍体=2C+2CV，DNA异倍体不 等于2C+2CV。
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流路： 流动室
鞘液 sheath 样本流 sample
光路： 光源
光学收集系统
电路：
光电倍增管(PMT)、光电二极 管、 放大器（线性、对数） A/D 转换（光信号转换为电信 号之后的处理分析 道数和电信 号的脉冲转换 ）
统计：计算机 软件
流路
• 样品管、鞘液管和流动室等
流动室 鞘液
激光
侧向及荧光信号
流式细胞技术基本原理及应用
提纲
Beckman Coulter 公司介绍 流式细胞技术基本原理 FC500全自动分析型流式细胞仪介绍 Gallios 十色分析型流式细胞仪 流式细胞技术科研应用
Beckman Coulter 公司介绍
Dr. Beckman于1935年创立Beckman公司 Coulter兄弟于1958年创立Coulter公司 1997年两大公司合并为Beckman Coulter 一直致力于为生命科学研究提供全套的解决方案，产品涵盖临床诊断和生 物医学的多个领域，包括临床生化、血凝/血球、实验室自动化、离心机、 流式细胞产品、基因组学、蛋白质组学、颗粒特性分析等 20多万台仪器设备在全球130多个国家地区的医院和科研院所高效运转 年销售额超40亿美金，被财富杂志评为 “最值得钦佩的公司”之一 名列全球福布斯500强
Beckman Coulter：世界上最主要的高端流式细胞仪技术制造商
贝克曼库尔特细胞组学产品线
Gallios™科研型 CyAn ADP（科研型）
临床型Navios
2009年12月份上市
MoFlo Astrios 高端分选
5色数字化分析型流式 FC500
4 色数字化分析型流式 Epcis XL
Z1/Z2细胞分析计数仪
大家学习辛苦了，还是要坚持 继续保持安静
What Can a Flow Cytometer Tell Us About a Cell?
细胞的相对大小（FSC-Forward Scatter） 细胞的相对颗粒度和内部复杂度（SSC-Side Scatter） 细胞的相对荧光强度
FC500流式细胞仪的检测范围
荧光信号检测原理 Laser
FSC Sensor
520nm
Fluorescence Sensor PMT(FL)
荧光素及荧光发生机理简介
ENERGY
excited electron
EMITS ENERGY AS LIGHT
ATOM
FITC荧光素的激发和发射光谱
Ex 488nm
Em 520nm
异硫氰酸荧光素（FITC）
每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会有发 射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长.
利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学 信号
FC500流式常用荧光染料
荧光素的使用： 选择正确的激光器 确定正确的滤光片 确定所需荧光探测器（PMT）
LASER FITC PE
全自动5色流式细胞仪Cytomics ™ FC500 Flow Cytometer
先进的光路设计 高分辨20Bit数字化电子系统 丰富灵活的进样系统 基于Windows界面的高度人性化软件
荣获国际工业设计大奖和质量最高奖，得到国际公认 获得FDA和中国SDA认证，安全性和结果可靠性得到肯定
FC500 Flow cytometry的基本结构
1990
Vicell 全自动 细胞活力分析系统
2009
2005
MoFlo XDP高端分选 Quanta SC（2007）
EPICS ALTRA™分选
流式细胞技术基本原理
What is Flow Cytometry？
流式细胞技术(Flow Cytometry,FCM)是利用流式细胞仪对处于 快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析及 分选的技术。
前向散射光信号
由于鞘液的作用，待测细胞被限制在液流的轴线上——流体动力学聚 焦
FC500的光源和光路 先进的单激光激发5色系统
单激光 就能激发5色荧光 20mW @ 488 nm Blue air-cooled argon (氩离子激光)
单激光同时激发5色荧光，确保信号来源于 同一个细胞，结果准确可靠
它结合了单克隆抗体技术、激光技术ห้องสมุดไป่ตู้计算机技术、细胞化 学和免疫化学技术。
FCM的技术特点
测量速度快 以单一细胞为分析基础 多参数测量 统计学意义 高分辨率(CV<2%)、高灵敏度(荧光检测灵敏度≤100MESF（ Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome），前向角散射 光检测灵敏度(0.2∼0.5µm) 分选纯度可达99%以上
细胞结构 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量
细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异
性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体
流式细胞仪是细胞组学的定量工具
可以做以下定量： 细胞相对定量（％） 细胞绝对定量（细胞/µl） 细胞膜蛋白表达定量（蛋白分子/细胞） 可溶性蛋白绝对定量（g/ml）
其它公司同档机器单激光只能激发4色，第5色需要 安装第二根激光激发。由于有两个检测点，在鞘液 压力变化、样品浓度、样品大小不均、转换采样速 度时不能确保信号来源于同一个细胞而是两个细胞 ，信号收集发生错误
FC500的光源和光路
双激光排列方式：共线性排列（只有一个检测点）
双激光共线性：
488nm激光
信号来源于一个 检测点
633nm激光
散射光测量原理
Laser
FSC Sensor
SSC Sensor
Incident Light
Source
Right Angle Light Detector Cell Complexity
SSC
Forward Light Detector
Cell Surface Area
FSC
散射光的性质
波长与入射光一致，为细胞固有的物理及生理特性，可依此对未染色的 细胞进行分析 -- 前向散射光(FSC):与细胞大小有关 -- 侧向散射光(SSC):与细胞内部的结构及颗粒性有关。 外周全血细胞散射光双参数点图 （红细胞溶解后）
SC
FS
FC500 提供两种检测角度的前向角散射光，更好通过大小区分 不同细胞