关于质粒抽提的杂菌污染问题解决方案

分⼦⽣物学实验中常见的问题与对策-9⼀、质粒提取常见问题分析与策略1.⽤试剂盒未提出质粒或质粒得率低有哪些原因？1）细菌⽼化请凃布平板培养后，重新挑选新菌落进⾏液体培养。

2）细菌培养物⽣长过度或不新鲜不要于37℃培养超过16⼩时，分离质粒前长时间存放培养物是不利的。

3）质粒拷贝数低由于使⽤低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的⾼拷贝数载体。

4）菌体中⽆质粒有些菌体本⾝不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。

例如柯斯质粒在⼤肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应该接种单菌落。

另外检查筛选⽤抗⽣素使⽤浓度是否正确。

5）菌体过量，碱裂解不充分取样时菌液过多，导致菌体裂解不充分，可减少菌体⽤量或增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的⽤量。

对低拷贝数质粒，提取时可加⼤菌体⽤量并加倍增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的⽤量（应保持1：1：1.4⽐例）。

6）溶液使⽤不当溶液裂解液、中和液在温度较低时容易出现盐析，如出现，应将其放⼊37℃⽔浴⾄完全溶解、澄清，⽅可使⽤。

7）质粒未全部溶解（尤其质粒较⼤时）洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

8）⼄醇残留洗涤液Ⅱ洗涤后应离⼼并静置数分钟尽量去除残留⼄醇后，再加⼊洗脱液洗脱回收。

9）洗脱液加⼊位置不正确洗脱液应加⼊吸附柱中膜的中央以确保洗脱液完全覆盖吸附膜的表⾯达到最⼤洗脱效率。

10）洗脱效率：洗脱效率与洗脱液PH值、洗脱液⽤量、洗脱次数、加⼊洗脱液后的静置时间和是否预热等因素有关。

PH7.0－8.5之间，洗脱液⽤量不得⼩于50µl，重复洗脱2-3次，增加室温静置时间及65℃⽔浴预热可以有效提⾼得率30%。

2.试剂盒提取质粒纯度不⾼，如何解决？1）有蛋⽩质污染应在加⼊去蛋⽩液后，以⾜够⾼的转速离⼼，使沉淀紧密，并⼩⼼地吸取上清液，避免吸⼊沉淀。

另外，不要使⽤过多菌体。

经悬浮液、裂解液、中和液处理，离⼼后溶液应为澄清的，如果还混有微⼩蛋⽩悬浮物可再次离⼼去除后再进⾏下⼀步骤。

《防止杂菌污染的技术》讲义一、引言在各种生产和实验环境中，防止杂菌污染是至关重要的。

杂菌的污染不仅会影响产品的质量和产量，还可能导致严重的安全问题。

因此，掌握有效的防止杂菌污染的技术是必不可少的。

二、杂菌污染的来源（一）空气传播空气中存在着大量的微生物，如细菌、真菌孢子等。

在通风不良的环境中，这些微生物容易随着空气流动进入工作区域，造成污染。

（二）人员带入操作人员自身可能携带杂菌，如皮肤表面、衣物上的微生物。

在操作过程中，如果不遵循严格的卫生规范，就容易将杂菌引入到工作环境中。

（三）原材料污染原材料在采集、运输和储存过程中，如果受到污染，也会成为杂菌的来源。

（四）设备和器具未经过彻底清洁和消毒的设备、器具表面可能附着有杂菌。

三、防止杂菌污染的技术措施（一）环境控制1、清洁和消毒定期对工作环境进行彻底的清洁，包括地面、墙壁、天花板等。

使用有效的消毒剂，如含氯消毒剂、过氧乙酸等，按照规定的浓度和作用时间进行消毒处理。

2、通风系统安装良好的通风系统，保证空气的流通和新鲜。

可以采用过滤装置，如高效空气过滤器（HEPA），过滤空气中的微生物。

3、温度和湿度控制保持适宜的温度和湿度条件，不同的生产或实验环境可能有不同的要求，但一般来说，较低的温度和湿度不利于微生物的生长繁殖。

（二）人员管理1、培训对操作人员进行严格的培训，使其了解杂菌污染的危害和预防措施，掌握正确的操作方法和卫生规范。

2、着装要求操作人员应穿着专门的工作服、帽子、口罩和手套，进入工作区域前要进行清洁和消毒。

3、洗手和消毒在操作前后，操作人员要严格洗手，并使用消毒剂进行消毒。

（三）原材料控制1、采购选择质量可靠的原材料供应商，确保原材料在采集和运输过程中不受污染。

2、检验对原材料进行严格的检验，检测是否存在杂菌污染。

对于有污染风险的原材料，要进行预处理，如消毒、灭菌等。

3、储存原材料应储存在适宜的环境中，避免受潮、受污染。

（四）设备和器具的清洁与消毒1、定期清洁制定设备和器具的清洁计划，定期进行拆卸、清洗和消毒。

质粒提取实验注意事项质粒提取是分子生物学中常用的实验技术之一，它能够从细菌中提取目标质粒，用于后续的转染、定量PCR、序列测定等实验。

质粒提取实验虽然操作简单，但是仍然需要遵循一定的注意事项，才能确保实验的顺利进行和结果的准确性。

下面将介绍质粒提取实验的注意事项。

1. 实验前的准备工作：在进行质粒提取实验之前，首先要做好实验室的准备工作。

要确保实验室中的工作台、仪器和试剂瓶都是干净整洁的，避免污染影响实验结果。

另外，要准备好所需的耗材和试剂，如离心管、离心管架、洗涤缓冲液、溶解缓冲液等。

并根据实验计划，提前准备好质粒所在的宿主菌培养液，提取缓冲液等相关材料。

2. 操作过程中的注意事项：在进行质粒提取实验的操作过程中，需要严格遵守操作规程，确保实验操作的准确性和稳定性。

在进行菌培养和离心等步骤时，要避免振荡或剧烈振动，以免对菌体和质粒的完整性产生影响。

另外，在使用洗涤缓冲液、溶解缓冲液和纯化缓冲液时，要注意溶液的pH值和温度是否符合要求，以及是否在有效期内。

同时要注意防止留下DNA和蛋白质残留，避免污染影响后续实验。

3. 质粒提取后的保存和处理：在完成质粒提取实验后，提取得到的质粒需进行适当的保存和处理。

一般情况下，提取得到的质粒可以用无菌的ddH2O或TE缓冲液溶解后，分装成适量的小份，然后在-20或更低的温度下保存。

另外要注意标记好每份提取得到的质粒，以免混淆。

在进行保存和后续实验过程中，要避免频繁的冻融，以免对质粒的完整性产生影响。

4. 实验后的清洁和记录工作：在完成质粒提取实验后，要及时清理实验台和操作工具，保持实验室的整洁。

同时要详细记录实验过程中的操作步骤、使用的试剂和仪器，以及实验结果等相关信息。

这些记录对于实验结果的分析和后续实验的开展都是十分重要的。

总之，质粒提取实验是一项重要的实验技术，在进行实验时需要严格遵循操作规程，注意操作细节，确保实验结果的准确性和可靠性。

希本通过本文介绍的注意事项，能够帮助实验人员顺利进行质粒提取实验，并获得高质量的实验数据。

质粒提取中常见的问题质粒DNA提取常见问题分析1.加入solution.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，有的漂浮在液面，有的贴在离心管壁上，一摇晃即破碎脱落下来？细菌的用量太少，导致产生的沉淀主要是盐分的沉淀，因为缺少变性的细菌蛋白和细菌基因组DNA 的缠绕，沉淀就显得不结实。

解决方法：将细菌的用量增加。

2.加入soln.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，呈大块的水泡状，上清较少？（1）使用了过多的细菌，导致菌体未被有效裂解。

解决方法：将细菌用量减半。

（2）细菌悬浮不充分,存留小菌块, 导致菌体未被有效裂解。

解决方法：注意将细菌悬浮充分。

（3）加Solution III后中和不充分。

解决方法：如果细菌用量较多，请注意多翻转几次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花状(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花状)。

（4）Solution II出现沉淀。

解决方法：如果实验室内温度低于15℃，使用试剂盒前请注意观察Solution II中是否出现沉淀。

如果出现沉淀，请于37℃水浴溶解沉淀后再使用。

（5）Solution II 长时间暴露于空气中被CO2中和，导致菌体未能被有效裂解。

解决方法：可用经典碱裂解法抽提质粒DNA方法中的II液替代Solution II使用。

3.出现严重的RNA污染？（1）未在Solution I中事先加入RNase A1。

解决方法：补加RNase A1。

（2）加入RNase A1的Solution I长期保存于室温，导致RNase A1活性下降。

（3）细菌过量,RNase A1不能有效降解RNA。

解决方法：将细菌用量减半或增加RNase A1在Solution I中的浓度。

4.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现切口.断裂或降解现象？（1）使用的是收集后冷冻保藏的细菌。

解决方法：使用新鲜培养的细菌。

（2）宿主菌富含核酸内切酶。

解决方法：增加一步Rinse A洗涤步骤以彻底去除残留的核酸内切酶。

《防止杂菌污染的技术》讲义一、引言在各种生产和实验过程中，杂菌污染是一个经常面临的问题。

杂菌的存在不仅会影响产品的质量和产量，还可能导致严重的经济损失和安全隐患。

因此，掌握有效的防止杂菌污染的技术至关重要。

本讲义将详细介绍防止杂菌污染的相关技术，希望能为大家提供有益的参考。

二、杂菌污染的来源与危害（一）杂菌污染的来源1、空气传播空气中存在着大量的微生物，如细菌、真菌孢子等。

在通风不良的环境中，这些微生物容易进入生产区域，造成污染。

2、人员操作操作人员的手部、衣物、头发等可能携带杂菌。

如果操作不规范，如未进行严格的消毒、未遵循无菌操作流程等，就容易将杂菌引入。

3、原材料原材料本身可能带有杂菌，如果在使用前未进行有效的处理和检测，就会成为污染源。

4、设备和器具生产设备、容器、工具等如果清洁消毒不彻底，也会滋生和传播杂菌。

（二）杂菌污染的危害1、降低产品质量杂菌的生长和代谢可能会改变产品的成分、结构和性能，导致产品质量下降，不符合标准要求。

2、影响生产效率杂菌的存在可能会消耗营养物质，干扰正常的生产过程，从而降低生产效率，增加生产成本。

3、引发安全问题某些杂菌可能会产生毒素或有害物质，对人体健康造成威胁。

在食品、药品等行业，杂菌污染更是可能引发严重的安全事故。

三、防止杂菌污染的基本原则（一）清洁卫生保持生产环境、设备、器具等的清洁是防止杂菌污染的基础。

定期进行清洁、消毒，去除污垢和微生物滋生的条件。

（二）无菌操作在涉及微生物培养、药品生产等对无菌要求较高的操作中，必须严格遵循无菌操作规范，如使用无菌器具、在无菌环境中操作等。

（三）控制污染源对可能的污染源进行有效控制，如对原材料进行严格检测和处理，加强人员培训和管理，确保操作规范。

（四）监测与检测建立有效的监测和检测机制，及时发现杂菌污染的迹象，采取措施进行处理，防止污染扩散。

四、防止杂菌污染的具体技术（一）环境控制技术1、空气净化采用高效空气过滤器（HEPA）等设备，对进入生产区域的空气进行过滤，去除空气中的微生物。

质粒提取常见问题解析质粒, 解析本帖引用网址：/thread-29246-1-1.html涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。

蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。

建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。

同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。

原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。

解决办法：1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。

2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。

3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：1、利用你的嗅觉。

只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。

而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。

2、肉眼观察活化菌株。

对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。

】未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？参考见解：1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。

2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。

3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。

例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。

另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

质粒提取问题与心得质粒提取是分子生物学实验中常见的操作，用于从细菌中提取质粒DNA。

质粒是细菌细胞内的环状DNA分子，通常用于在细菌中传递外源基因。

质粒提取的过程涉及细胞破裂、DNA纯化和浓缩等步骤，下面我将从几个方面来谈谈质粒提取的问题与心得。

首先，质粒提取的关键步骤包括细胞破裂、DNA纯化和浓缩。

在细胞破裂过程中，使用适当的细胞破裂缓冲液和方法对细菌进行破裂，释放质粒DNA。

在DNA纯化过程中，通过离心、溶液添加和酚/氯仿提取等方法，将质粒DNA与蛋白质、RNA等杂质分离。

最后，通过乙醇沉淀等方法对DNA进行浓缩，得到纯净的质粒DNA。

其次，质粒提取过程中可能遇到的问题包括DNA污染、纯化不彻底、DNA浓度不足等。

为了解决这些问题，可以在细胞破裂缓冲液中添加蛋白酶等物质，提高DNA的纯化效果；在DNA纯化过程中，可以多次进行酚/氯仿提取和乙醇沉淀，提高纯化的彻底性；在最后的浓缩过程中，可以根据实际情况调整乙醇的浓度，以获得所需浓度的质粒DNA。

此外，质粒提取的心得体会包括操作技巧、实验条件和耐心。

在进行质粒提取实验时，需要熟练掌握各个步骤的操作技巧，尤其是在细胞破裂和DNA纯化过程中需要细心操作；实验条件也很重要，包括细菌培养的状态、破裂缓冲液的配制和储存等；此外，需要有耐心，因为质粒提取是一个细致而耗时的过程，需要耐心等待和细心操作。

综上所述，质粒提取是分子生物学实验中常见的操作，需要注意细节、耐心等。

在实际操作中，我们需要不断总结经验，积累心得，以期获得更好的实验结果。

希望以上内容能够对你有所帮助。