石蜡包埋切片方法

组织石蜡包埋和切片技术包埋剂embedding agent在制作切片或超薄切片时，由于组织是柔软的，或局部的软硬不均，这样制作厚薄均匀的切片是困难的。

所以有必要用一定物质浸透组织内部，整个组织一样硬化，以利于切成薄片，这种物质叫做包埋剂。

一股用光学显微镜观察的切片，用石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等作包埋剂；电子显微镜则用环氧树脂、聚苯乙烯树脂、异丁烯树脂及水溶性树脂。

石蜡制片法是将材料经固定、脱水、透明、浸蜡后包埋在石蜡里面进行切片的方法。

此法适用范围，制片手段完备，能将材料切成极薄的片子（可切至2-8微米左右），并能制成连续的片子，这是其它制片法难以达到的，因此在光学显微镜的制片技术上它是最常用的一种方法。

除了一些经不住石蜡切片法中所应用的各种药剂处理的材料不能应用石蜡切片以外，一般的材料都可以用此法制片，但有制作时间较长，操作过程复杂以及材料易发硬或发脆等缺点。

该法多采用旋转式切片机进行切片。

石蜡制片操作程序如下：（一）材料的采集与分割采集材料应根据制片的目的和要求而定，材料要有代表性，无病虫害或其它损伤，如要观察病理解剖，则要取病斑、病症部位。

采下的材料应立即放在标本箱或湿布包起来带回实验室进行分割固定（如有条件也可在试验地采集后进行分割固定）。

为使固定液能迅速的渗透材料，材料要进行分割。

分割时动作要迅速，以防材料萎蔫。

分割块的大小，宜小不宜大，一般不超过1cm3，分割后立即杀死固定。

（二）杀死与固定利用药剂迅速把细胞杀死，以保持材料本来的状态和结构。

常用的固定有F.A.A固定液、卡诺固定液等。

将固定液放在具塞小瓶中，投入材料，盖好瓶盖。

用F.A.A 固定液固定，时间至少24小时。

F.A.A固定液既是良好的固定剂，也是保存剂，因此材料可长期保存在固定液中备用。

卡诺固定液穿透力强，固定较小材料一般1~6小时即可，最多不超过24小时。

因卡诺固定液不能做保存剂，所以固定后要用95%、85%酒精浸洗，每级约20min.，然后保存在70%的酒精中备用。

石蜡切片基本步骤（一）取材和固定根据实验目的选择材料。

将整个虫体或虫体的内部器官（如肠道、马氏管、唾液腺等）取出后，立即投入固定液。

取材大小：0.5cm>0.5 cm迥.2或者1.0 cm X.0 cm迥.2，厚度不宜超过3mm。

固定液：2.5%的戊二醛固定液，Bouin 氏液，10%甲醛等。

固定时间：4oC 固定24 小时。

注意事项：取材：1．勿使组织块受挤压切取组织块所用刀、剪要锋利，切割时不可来回切割。

夹取组织时，镊子要轻，切勿挤压，以免损伤组织。

取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。

2. 选好组织块的切面应熟悉器官组织的组成，并根据观察目的来确定纵切或横切。

3．保持材料的清洁组织块上如有血液、污物、粘液、食物等，先用生理盐水冲洗干净，再入固定液。

4．切除（清除）不需要的部分特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，以免影响以后的程序和观察。

固定：1．材料新鲜取出组织后须立即固定。

否则时间相隔过久，体积就要收缩变形或发生自溶现象。

2．抽气生物组织常有气体的存在，使材料不能沉入固定液中，抽气使得固定液有效渗入。

真空泵抽气或者用空针管抽气。

昆虫整体固定，固定前用解剖针刺数个小孔，以利用固定液渗透。

3．固定剂用量一般为组织体积的10~20倍。

勿使组织贴于瓶底或瓶壁，以免影响固定剂的渗入。

4．避免阳光尽可能避免接触阳光以免失去固定作用。

5．加速固定轻轻摇动盛器使组织移动有利于固定液渗入，对长期固定的标本可经常更换固定液。

（二）洗涤2.5%戊二醛固定液固定的组织：0.2M, pH7.2 磷酸缓冲液漂洗三次，每次10minBouin氏固定液固定的组织：直接入70%酒精更换数次即可脱水，注意苦味酸。

甲醛固定的组织：直接投入50%或70%酒精脱水，不经水洗。

但如果在甲醛中时间过长，则仍应当用流水冲洗。

陈旧性标本和混合性固定液应及时洗涤，有利于脱水、切片和染色。

否则会影响以后的染色效果。

石蜡包埋技术制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。

而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。

由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。

最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。

常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋，前一章中已述过固定。

第一节脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。

此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。

一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。

但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。

因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。

第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。

如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。

但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。

经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。

用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。

用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。

一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。

但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。

1.取材固定:离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散。

固定就是加入一些可以让蛋白质变性的物质(比如说甲醛)，使得蛋白质的结构被固定住，不再发生变化，同时也不会再发生一些活性反应，这样才好做后续的染色步骤。

常见固定液是4%的多聚甲醛和饱和苦味酸。

根据不同目的、组织特征代表性取材。

取的材料应该小而薄。

便于固定剂迅速渗入内部，一般厚度不超过2mm，大小不超过5X 5mm"。

每个组织最好多切几块。

新鲜组织固定(组织块不宜太大太厚，这样固定液很难进入里面，可能会导致在较短的时间内脱水不完全，引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。

导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败。

组织块也不能太小，否则不能保证切片数量，且透明时间和浸蜡时间不能很好的把握。

)固定时间因固定剂种类而异，大多6-12 小时，一般不超过12小时。

视组织固定的难易程度而定。

后续如果做免疫组化，不应超过12小时;后续如果做HE染色，不应超过24小时。

固定完之后用水洗(目的:洗去渗入组织的固定液，终止固定以免影响对组织的内结构的观察，分析。

换液两次，一次半小时。

) 之后可直接脱水包埋或放入75%的乙醇4度可长期保存。

2.脱水从75%的乙醇中取出，分别放到80%，90%，100%( I )的乙醇中30min，再放入100%乙醇中。

固定完直接水洗包埋的，应从70%乙醇开始，易碎组织从50%乙醇开始。

组织脱水时间不应过长，尤其是高浓度乙醇，要特别注意控制时间。

3.透明透明的目的是置换组织内的脱水剂，为下一步浸蜡起到桥梁作用，二甲苯可以去除脂肪。

乙醇+-二甲苯(1:1) 2h；二甲苯(I )，二甲苯(II)各10min(根据组织的大小和透明的难易程度不同，透明的时间可以根据具体情况调整。

颜色浅的组织表面油亮，可以透过光时效果较好，颜色较深的组织至少边缘可以透光。

)4.浸蜡浸蜡目的是置换组织中的透明剂，为包埋作准备。

二甲苯+石蜡(1:1)2h；石蜡(I)1h;石蜡(II)2h.(浸蜡的时间也可以长一些)5.包埋在冰盒上进行，将融好的纯蜡(最好提前4小时以上开始融蜡，新蜡更难融)，倒入蜡盒(可以浸没组织就行，大约蜡盒的三分之一)由于蜡盒底部与冰盒接触，底部的蜡会先凝固，这样就可以把组织用镊子夹住立在底部。

常规的石蜡‎包埋过程包‎括五个基本‎步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋‎制作石蜡切‎片，切片前须将‎石蜡渗透组‎织包埋于石‎蜡中，而水与石蜡‎又是不相混‎合的，所以在浸蜡‎，包埋前必须‎将组织内所‎含的水分脱‎去。

而大多数的‎组织固定剂‎是水溶液，随后的水冲‎洗也使其含‎有大量水分‎，因此必须先‎行脱水，一般是浸入‎逐级增加浓‎度的酒精来‎完成。

由于酒精和‎石蜡不能混‎合，须再用一种‎石蜡的溶剂‎来置换酒精‎，因大多数石‎蜡溶剂有使‎组织的折光‎率增高并表‎现为透明或‎半透明状，所以此步骤‎又称透明。

最后用石蜡‎浸渍组织并‎铸制成坚实‎的蜡块。

常规的石蜡‎包埋过程包‎括五个基本‎步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋‎，前一章中已‎述过固定。

第一节脱水脱水就是用‎脱水剂完全‎除去组织内‎的水分，为下一步透‎明及浸蜡创‎造条件。

此外，脱水还可以‎使组织再次‎发生一定的‎硬化，脱水剂必须‎是与水在任‎何比例下均‎能混合的液‎体。

一．常用的脱水‎剂1．酒精：是制片最常‎用的试剂，可与水在任‎何比例下相‎混合，酒精的脱水‎能力比较强‎，又能硬化组‎织。

但是酒精的‎船头速度很‎快，对于组织会‎有明显的收‎缩作用。

因此在以酒‎精作为脱水‎剂时，应该先从浓‎度较低的酒‎精开始，然后递增其‎浓度，这样可以避‎免组织过度‎收缩。

第一瓶酒精‎浓度随固定‎剂，脱水组织的‎大小和种类‎而异，经水溶性固‎定剂固定的‎细柔组织需‎要慢慢脱水‎，从50％酒精开始。

如眼球，组胚组织等‎大多数组织‎标本则是从‎70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒‎精。

但是有时为‎了某种特殊‎要求，例如要做糖‎元的切片标‎本或是要做‎尿酸结晶染‎色切片标本‎，为了防止糖‎元和尿酸结‎晶在水中消‎失却要直接‎投入无水酒‎精中固定，而不需要经‎过水洗和低‎浓度酒精的‎脱水过程。

经无水酒精‎固定后的组‎织只需要再‎经过换一次‎无水酒精脱‎水即可。

石蜡包埋组织切片制作过程石蜡包埋组织切片制作是组织学研究中常用的一种技术，它可以将组织样本固定、包埋、切片、染色等一系列步骤完成，以便于观察和分析组织结构和功能。

下面将详细介绍石蜡包埋组织切片制作的过程。

1. 组织固定需要将待研究的组织样本进行固定，以保持其形态和结构。

常用的固定剂有福尔马林、乙醛、甲醛等。

固定时间和温度根据不同的组织类型和固定剂而异，一般需要固定4-24小时。

2. 组织脱水固定后的组织需要进行脱水处理，以去除其中的水分，使其能够与石蜡相容。

脱水一般采用乙醇逐渐升级浓度的方法，如70%、80%、95%、100%乙醇，每个浓度的时间一般为1-2小时。

3. 组织清洁脱水后的组织需要进行清洁处理，以去除其中的脂肪和其他杂质。

清洁一般采用苯、甲苯、氯仿等有机溶剂，每个溶剂的时间一般为1-2小时。

4. 组织浸渍清洁后的组织需要进行浸渍处理，以使其与石蜡相容。

浸渍一般采用苯、甲苯、氯仿等有机溶剂，每个溶剂的时间一般为1-2小时。

5. 组织包埋浸渍后的组织需要进行包埋处理，以使其能够被切片机切割。

包埋一般采用石蜡，将组织样本浸泡在石蜡中，然后在石蜡中进行固化。

固化时间和温度根据不同的组织类型和石蜡而异，一般需要固化4-24小时。

6. 组织切片包埋后的组织需要进行切片处理，以便于观察和分析组织结构和功能。

切片一般采用微型切片机，将石蜡包埋的组织样本切成薄片，厚度一般为4-6微米。

7. 组织染色切片后的组织需要进行染色处理，以便于观察和分析组织结构和功能。

常用的染色剂有血液学染色剂、组织学染色剂等。

染色时间和方法根据不同的染色剂而异，一般需要染色5-30分钟。

石蜡包埋组织切片制作过程是一个复杂的过程，需要进行多个步骤的处理，以保证组织样本的完整性和可观察性。

这种技术在组织学研究中具有重要的应用价值，可以为疾病的诊断和治疗提供重要的参考依据。

石蜡包埋切片技术实验目的：1、学习石蜡包埋切片技术的基本原理和基本步骤；2、掌握石蜡包埋切片技术。

实验原理：大家在生物学实验时，曾经观察过动物组织和植物组织的切片。

通过光学显微镜，我们可以观察到细胞内部的结构（例如细胞核、细胞质、肌肉组织的横纹等）、细胞相互间的联系以及组织的构成等。

那么，如何来制作这种切片呢？其过程是比较复杂的，我们利用3—4次实验来学习组织切片的制作。

大家知道，我们要在显微镜下研究生物体的内部结构，在自然状态下是无法观察的，因为整个动、植物体大部分都是不透明的，不能直接在显微镜下观察，一定要经过特殊的处理，使要观察的材料先减少它的厚度和体积，使光线能透过才能用显微镜观察。

通常应用的有两种方法：一种是非切片法，即用物理或化学的方法将生物体组织分离成为单个细胞或薄片，例如我们在生物学实验曾做过口腔上皮的观察、洋葱鳞茎表皮的观察。

这种方法的不足之处在于细胞彼此间相互的联系不一定观察到。

另外一种为切片法，即用刀将标本切成薄片。

非切片法比较简单，一学就会，我们这里不作介绍。

切片法也分徒手切片法和切片机切片法。

最简单的切片法是将新鲜植物材料直接用刀切成薄片，称之为徒手切片法。

切片机切片法是用特殊的切片机来切片，切片的厚度可薄到几个微米。

因此，切片机的发明与应用也是细胞学诞生的重要因素。

切片机切组织用的也是刀（切片刀），所要切的组织要有一定的软硬度，如刀切肉（新鲜、冷冻）。

但大部分生物材料比较柔软，所以为了能切出薄片，必须先使所切材料有一定的软硬度。

一些包埋剂可以达到这个目的，如石蜡，它融化时可渗入到组织内部；凝固时，使整个组织有一定的软硬度，正好能切出很薄的切片，故称为石蜡包埋切片法。

另外还有火棉胶包埋切片法（火棉胶做包埋剂）、冰冻切片法（使组织冷冻到一定的硬度）等。

其中最常用的切片方法还是石蜡包埋切片法，我们这里重点学习石蜡包埋切片技术。

实验器材：（一）小鼠、小广口瓶、标签、量筒、烧杯、95%酒精、无水酒精、蒸馏水、手术刀、剪刀、镊子、平皿、石蜡块、滤纸、甲醛液、苦味酸、冰醋酸、移液管、洗耳球。