石蜡切片的制片方法

四、实验结果
包埋后的石蜡快应为均匀的半透明状，蜡块中没有 气泡。
包埋材料摆放的位置是否符合要求？
修块效果：每个蜡边与材料平行，蜡边的上下左右摇 平行。
切片效果：得到厚薄均匀的蜡带，蜡带无破损。 展片效果：展片后蜡带或蜡片平整，无气泡、粘附牢 固，蜡带略呈透明状，后续制片不易脱落。
五、作业
实验完毕，每人交包埋块一个，在纸盒上写
上材料名称及自己的姓名和日期；
实验完毕，每人交玻片两张，用铅笔在载玻
片上写上材料名称及自己的姓名和日期；
实验报告（姓名和日期）。
苦味酸液（波茵氏液）
甲液： 1％铬酸 10％醋酸 乙液： 甲醛 苦味酸饱和水溶液 50ml 20ml 25ml 75ml
包埋过程中易出现的问题及解决办法
问题：包埋后的石蜡块应为均匀半透明状，有时出现白色浑浊 结晶（像雪花一样）部分，这样在切片时就有妨碍，不易切出 薄的切片。 原因：①组织内部或石蜡中混有透明剂；②脱水不干净；③石 蜡本身品质不良；④组织块移入纸盒时动作太慢，周围的石蜡 已成凝固状态；⑤冷却用水温度不够低，石蜡凝固太慢。 解决办法：属于前三个原因者应在包埋之前就须注意；属于后 二个原因者，可将包埋块再投入Ⅲ蜡中熔化后重新包埋，但必 须注意熔化包埋过的石蜡块的时间不宜过久。
实验六 石蜡切片法
—— 包埋、切片和贴片
石蜡切片法
石蜡切片法是显微制片技术中最常用的一种方法，除了
藻类、菌类、木材和骨骼外一般的材料均可以使用，既 可制成较薄的切片，使材料各部分都清晰可见，同时也
可制成连续切片，观察材料的动态发生及层次，所以，
它在显微制片技术中占有非常重要的地位，必须掌握， 同时也是进行透射电镜观察超薄切片的基础。

石蜡切片的制作石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。

石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法，它有很多优点，例如，比较省时间，容易操作，可切成极薄的切片，能制作连续切片，组织块可包埋在石蜡中永久保存等。

缺点是只能用于较小的组织块，较大的组织块不易切好容易破碎，组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆，制片时间太长。

一、石蜡切片的制作过程石蜡切片的制作过程主要是：取材→水洗→固定→水洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→染色。

（一）取材及水洗根据实验要求选取材料来源及部位，取要求部位的小块组织成为组织块，组织块的大小以不超过0.5立方厘米为宜。

切去组织块时动作要轻，切忌用力牵引或挟持，以免组织内部发生变化。

由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24小时，因此一般情况下，将动物处死后立即取需要的材料。

组织块取下后，先用相应的生理盐水漂洗以洗去血液、污渍以及粘液等。

如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。

（二）固定材料由动物体取下后应当迅速固定，固定的目的是尽快使固定液渗入组织内部，将组织固定以保持其原有的结构。

不同的组织应选用适当的固定液。

固定液的用量与组织块体积之比一般在20:1，不应使组织块贴于容器壁上。

材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。

固定的时间长短依据材料大小而定。

固定液有许多种，在固定的过程中应该根据需要选取合适的固定液，一般固定液都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化而失去固定作用。

有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早固定时就没有作用了。

（三）水洗固定后的组织块在进行脱水前必须用流水洗去固定液。

，主要目的是洗去固定液的颜色以便后续的染色。

石蜡切片制备基本步骤一、准备工作（一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗）1、用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷2、将器皿在自来水下冲洗干净3、将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12~24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3次烘干备用。

（二）配制：硫酸洗液的配制清洁液（洗液）的配制：成分强酸液次强酸液弱酸液浓硫酸（ml）1000 200 100重铬酸钾（mg）63 120 100蒸馏水（ml）200 200 1000重铬酸钾1200g蒸馏水2000ml将2000ml浓硫酸缓缓倒入上述溶液中，边倒边用木棒轻轻搅拌（三）载玻片与盖玻片的处理1. 将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24小时2. 流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍3. 95%~100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用注：在将载玻片与盖玻片放入清洁液中时，要一片片地投入，使其不致重叠。

二、常用液体的配制（一）缓冲溶液：1．磷酸盐缓冲液A液：0.1mol/L磷酸二氢钠B液：0.1mol/L磷酸氢二钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（3：7≈PH7.0）2．枸椽酸缓冲溶液A液：0.1mol/L枸椽酸B液：0.1mol/L枸椽酸钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（6.2：42.8≈PH6.2）（二）固定剂：1．甲醛：10%甲醛福尔马林100ml蒸馏水900ml注：实际甲醛含量只有3.6~4.0%但习惯上都将其视为10%。

2．10％中性福尔马林钙固定液甲醛液10ml蒸馏水90ml加碳酸钙至过饱和(以容器底部碳酸钙沉淀1~2cm厚为适度)充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。

3．4%多聚甲醛：8%多聚甲醛多聚甲醛8g蒸馏水100ml加温至60℃左右，不时搅拌，成为乳白色溶液。

滴加1N NaOH，并不停搅动至液体清明。

石蜡切片的主要制备程序
石蜡切片的主要制备程序可以概括为以下几个步骤：
1. 准备样品：选择需要切片的样品，如组织样本、细胞样品等，并采取相应的固定、处理和染色等预处理步骤，以保证样品的稳定性、可观察性和对比度。

2. 材料准备：准备好所需的石蜡、切片盒、切片刀、载玻片等材料，并进行清洁和消毒处理，以避免污染和交叉感染。

3. 石蜡浸透：将处理好的样品转移到石蜡中进行浸透。

首先将样品置于温度逐渐升高的浸透剂（如正己烷）中，以去除组织内水分和其他溶质，然后置于石蜡中进行浸透。

4. 切片制备：将石蜡浸透的样品固定于切片盒中，将石蜡块剪碎成适当大小，并放置在切片刀的刀脊上。

调整切片机参数（如温度、角度、速度等），并逐个切割出薄片。

5. 切片贴片：将切好的薄片浮于温水中或使用其他方法，如电离子器、热平台等，以使切片展平并附着于载玻片上。

6. 干燥固定：将切片连同载玻片一起进行干燥固定处理，以去除水分并保持切片的形态稳定。

7. 切片染色：根据实验需求，对切片进行适当的染色处理（如组织学染色、免疫组化染色等），以增强样品的可视化效果和区分感兴趣的结构。

8. 封片封装：将切片封装至封片盖玻片上，使用透明化导电胶或其他封片剂固定切片，并尽量排除气泡、保证封片质量。

9. 切片质控：对制备好的切片进行质量控制，使用显微镜观察和评估切片的清晰度、结构完整性、染色效果等。

最后，制备完成的石蜡切片可以用于显微镜观察、组织形态分析、病理学研究等应用。

需要注意的是，在整个制备过程中，应遵循标准实验操作规程、注意安全，以及依据实验要求进行相应的优化和调整。

病理制片技术――组织石蜡切片组织经石蜡包埋后制成的蜡块，用切片机制成切片的过程为石蜡切片法。

石蜡切片法现使用的切片机有平推式切片机、轮转式切片机两种。

一、平推式切片机石蜡切片法1．切片前的准备：清洗过的载物片(或免清洗的)，毛笔，铅笔，小竹片，水槽，雾化器，摊片器，切片刀，刀架。

2．切片制作步骤：刀架的粗削部放在头端，在切片机刀架部夹紧。

组织蜡块装在切片机蜡块固定器上夹紧。

右手握切片机刀头运动手柄，左手转动切片机蜡块运动旋钮。

先转动此钮，后平拉刀架运动手柄，进行粗削，直至组织切全。

停止，将刀架移到细削部，轻轻转动蜡块运动旋钮，后拉刀架手柄进行细削。

削至组织光滑发亮，右手拿毛笔扫净刀架及蜡块上的蜡屑，组织屑，放下毛笔，再用右手握住刀架运动手柄。

左手拿小竹片，用竹片头蘸一下水槽中的水。

左手中指搬动薄切钮，雾化器的喷头对准蜡块。

右手拉刀架运动手柄。

左手中的小竹片在蜡块空白处等待切片刀切起蜡片一端挑起粘住，随切片刀移动，完整的蜡片切出后，粘在竹片上，移入水槽中，捞片，放在摊片器上摊片5 min后，装在染色篮上，放入75℃烤箱烤片。

3．注意事项(1)无冷台的病理科可以将包埋好的组织蜡块放到冰箱内，但如放置时间过久温度太低切片时蜡块会产生热涨，切片会厚，要多切几张，后面的片子就会薄一些。

(2)雾化器是去除静电的，但也有增加切片厚度的缺陷。

尤其雾气大时，使蜡块热涨，厚度增加更明显。

为了保证切片厚度，一定要控制好风力、雾力。

雾化器使用自来水，水位控制在30刻度。

(3)切片机使用前一定要检查各部位情况。

先检查固定器是否固定在你所要的厚度上。

切片机刀架角度与蜡块呈90。

从蜡块右上角进刀。

二、轮转式切片机石蜡切片法1．切片前的准备：清洗过的载玻片、毛笔、铅笔、盛有30％乙醇的小烧杯、牙科镊、展片槽、切片机、一次性刀片及刀架。

检查轮转式切片机切片厚度的钮是否固定于你所要切的厚度刻度上。

2．切片制作步骤：将放在－5℃冷台上的组织蜡块装在切片机固定器上夹紧，空白蜡多的一端在上。

石蜡切片流程范文石蜡切片是一种常见的组织学技术，用于制备生物组织薄片，使其可以在显微镜下观察和分析。

下面是石蜡切片制备的详细流程。

1.组织固定：首先，需要选择适当的方法将生物组织进行固定，以保持其形状和结构。

最常用的方法是使用福尔马林溶液进行组织固定。

将组织样品置于福尔马林溶液中，通常需要固定24至48小时。

2.去水：固定完毕后，需要将组织中的水分除去，以便进行后续的处理。

通过逐渐提高样品中酒精浓度（例如70％、80％、95％和100％构成的酒精梯度）来逐步去除水分，通常每次浸泡20至30分钟。

3.清洁：去水后，通常需要对样品进行清洁，以去除可能存在的污物和其他杂质。

可以用清洁的醇溶液（例如100％酒精）浸泡样品数分钟，然后用去福尔马林等溶液洗涤样品。

4.浸渍：在石蜡切片制备过程中，需要将组织样品浸泡在石蜡中，以使其渗透并得到支撑。

选择适当的石蜡类型和温度很重要。

通常使用低熔点石蜡（例如58℃石蜡），在60至65℃的恒温水浴中加热并溶解石蜡。

5.渗透：将组织样品从酒精中转移到融化的石蜡中，通常需要经历多个步骤的渗透过程。

首先将样品浸泡在75％酒精中，然后再依次转移到浓缩的酒精溶液中（例如85％、95％和100％）和石蜡中，每次浸泡时间约为1小时。

6.包埋：当样品完成渗透后，需要进行包埋，即将渗透后的组织样品放置在切片模型中，并用石蜡封住。

将切片模型倒置，将溶解的石蜡缓慢倒入模型直到完全覆盖组织样品。

然后将切片模型固定在冷却装置中，等待石蜡冷却和固化。

7.切片：当石蜡块完全固化后，可以将其切割成所需的薄片。

通常使用旋转切片机或手动切片机进行切片。

将切片机的刀片调整到所需厚度（通常为3至5微米），将石蜡块放置在切片机上，并逐渐将刀片与石蜡块接触，以制备薄片。

8.制片：将切好的石蜡薄片静置在温水中，让其自然展开，并将其转移到预涂有胶水的载玻片上。

轻轻将玻片压在石蜡薄片上，以确保两者之间有良好的接触。

然后将载片放置在恒温台上，以便胶水干燥。

怎样制作石蜡切片制作石蜡切片需要一系列的步骤和材料。

以下是一种常见的制作石蜡切片的方法：1.准备材料和设备：-石蜡块：石蜡是一种透明且易于切片的材料，可以在化学试剂供应商或实验室设备供应商处购买。

-刀片：使用一把锋利的微创刀片来切割石蜡。

确保刀片是干净的，滴一滴乙醇或其他清洁溶液在刀片上擦拭，然后用干净的纸巾擦干。

-切片盒：选择适合的切片盒来放置切割好的石蜡切片。

-石蜡模具：这是一个用于制作石蜡块的模具，可以在实验室设备供应商处购买。

2.制备石蜡块：-首先，将石蜡块加热至约60-70°C，直到完全融化。

-将石蜡块从加热器中取出，小心地倒入石蜡模具中。

-等待石蜡冷却和凝固。

你可以将石蜡模具放入冷却台上以加快冷却过程。

3.切割石蜡块：-将已冷却和凝固的石蜡块从模具中取出。

-使用清洁干燥的刀片将石蜡块切成适当的大小。

你可以根据实验需求来确定切割的尺寸。

4.制备石蜡切片：-准备一张玻璃载玻片。

-小心地将切割好的石蜡片放在玻璃载玻片上。

5.烘干石蜡切片：-将玻璃载玻片连同石蜡切片放入干燥炉。

-设置炉温为50-60°C，保持1个小时以消除任何残留的水分。

6.染色和封片：-如果需要，可以将石蜡切片进行染色以便更好地观察。

- 使用适当的染色剂，如伊红（Eosin）或伊红-兰红（Eosin-Methylene Blue）来染色石蜡切片。

-染色后，将石蜡切片放入一盒有封盖的容器中，以便保存和保护切片。

制作石蜡切片需要一定的实验室技巧和经验，同时注意安全，避免烫伤和刀片伤害。

在操作过程中，务必佩戴手套和护目镜，确保实验室处于通风良好的环境中进行操作。

石蜡切片的主要制备程序石蜡切片是一种常见的制备生物样品的工艺，广泛应用于医学、生物学、病理学等领域。

石蜡切片的主要制备程序包括固定、脱水、浸渍和切片等过程。

本文将从深度和广度两个角度对石蜡切片的主要制备程序进行全面评估，并探讨其在实际应用中的价值。

一、固定固定是石蜡切片制备的第一步，其目的是使生物样品中的细胞和组织结构固定在原位，防止其在后续处理过程中变形或失去形态。

常见的固定剂包括福尔马林、乙醛等。

固定的方法主要有浸渍法、注射法和灌注法等。

浸渍法将固定剂直接浸泡在样品中；注射法将固定剂注入样品内部；灌注法则使用压力灌注固定剂进入样品组织。

选择合适的固定方法取决于样品的性质和研究目的。

二、脱水固定后的样品中仍存在大量的水分，需要通过脱水处理将水分逐渐替换成有机溶剂，如乙醇或异丙醇。

脱水的目的是使样品适应后续的浸渍和渗透操作。

脱水可以采用逐步脱水法或直接脱水法。

逐步脱水法是将样品从低浓度有机溶剂逐渐过渡到高浓度有机溶剂；直接脱水法则是使用高浓度的有机溶剂直接将水分蒸发掉。

在脱水过程中，要注意控制处理时间和控制脱水剂的对样品的渗透力，以避免破坏样品结构。

三、浸渍脱水后的样品中已经没有水分，需要进一步进行浸渍处理，使组织结构与石蜡亲和力增强，以便在后续切片过程中组织块的稳定性。

浸渍的目的是用石蜡浸透样品，并使样品与石蜡变得相容。

浸渍可以采用逐渐浸渍法或直接浸渍法。

逐渐浸渍法是将样品从低熔点的石蜡逐渐过渡到高熔点的石蜡；直接浸渍法则是使用高熔点的石蜡直接浸渍样品。

在浸渍过程中，要注意控制温度和时间，以保证样品完全浸透。

四、切片浸渍后的样品已经与石蜡融为一体，可以进行切片操作。

切片是将浸渍的样品切割成薄片的过程，以便于后续的染色和显微观察。

切片可以采用手工切片法或机械切片法。

手工切片法是使用手持刀片将样品切割成薄片；机械切片法则是使用专用的切片机进行切片。

在切片过程中，要注意操作的轻重和刀片的锋利度，以保证切割的质量和样品的完整性。

材料自二甲苯中取出后,先移入二甲苯和石 蜡等量的 混合液中约30分钟，然后进入纯石蜡中约40—60分 钟，再换纯石蜡一次约40—60分钟。
三、包埋
是把被石蜡浸透的材料连同熔化的石蜡一起 倒入一定形状的容器内，并立即投入冷水中， 使它凝固成含材料的蜡块，以备切片。
从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋 用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯，用温镊 子夹取材料平放于纸盒底部，使之排列整齐。 将纸盒两侧的把手提起，慢慢地平放在面盆 的水面，待石蜡的表面凝固，将 纸盒慢慢 浸入水中，待石蜡完全凝固（约30分钟） 后即可取出备用。
包埋前应先把必需的用具（恒温箱、温台、纸盒） 准备好。 包埋用的镊子要先放在温箱中预热。
第五节 切片、展片和贴片
一、切 片 是把包埋好的材料块用切片机切成所需厚度的切片带。 实验程序 1. 切片前的准备工作 （1）整修：用单面刀片将蜡块四周修整平行。 （2 ）石蜡块的固着：先将蜡块用刀片切成方形或长
四、注意事项
1 透明的注意事项
使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中水 分进入； 更换透明剂，动作要迅速； 材料周围 出现白色雾状，应退回纯酒精中重新脱水。
2 透蜡的注意事项
动物材料常用的石蜡熔点为52-56ºC；植物材料 为54-60ºC。 透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；
3 包埋的注意事项
第一节 动物的选择、杀死和取材
一、动物的选择 根据实验目的选择合适的动物和组织 如：健康状况的选择 观察不同组织、器官选择不同的动物（如：
肥大细胞、肝小叶、环层小体等）
二、动物致死法 根据动物的大小、种类和观察目的不同，进
行适当的选择。 1、麻醉法 2、空气栓塞法 3、断头法 4、击头法 5、股动脉放血法 要求动作迅速、及时取材、迅速固定

取材
用锋利的刀片切取新鲜的植物材料，选定适宜的材料，立即固定。 取材的注意事项如下： （1）取材料要新鲜。动作要迅速，以免挤压损坏组织；取病理材料时，应设置
对照材料。 （2）所取材料大小要适当：根和茎一般直径≤5mm，切取成5-10mm小段；叶
片一般取过中脉处，切成2-5mm宽、5-8mm长。在切材料时，必须注意 刀片与中轴成直角，两切面平行，否则制成的切片细胞是斜的。 雌、雄 蕊一般不需分割。 （3）取材时间可根据切片要求有所区别。如：在进行植物发育的研究过程时， 需要找到细胞分裂相，一般在晴天的早晨9：00-10：00时取材，此时植 物细胞分裂活动较明显。 （4）取材不易过老，否则制片有难度（过老的材料须在滑走切片机上进行）； 对纵切的材料适当多取材，如根尖、茎尖等，因为切到材料正中的概率 较低。
（五）脱水
• 材料经洗涤后含有部分水分，会使材料分 解。而且透明剂与水是不相混合的，不利 于材料的透明和包埋等后期处理。因此需 用脱水剂逐渐除去材料中的水分，以便让 石蜡渗透进细胞。所以，脱水是制片的关 键环节。脱水剂要求能与水混合，而且能 与其他有机溶剂互相替代。
• 脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行，防止 吸收空气中的水分；在更换高一级的脱水 剂时，最好不要移动材料，以免损坏材料。
• 浸蜡是一个渐进的过程，常用的正丁醇。
• 每次浸蜡的时间，视材料大小而调节。
（八）包埋
• 材料经过足够时间的浸蜡后，需包入蜡 块，以备切片。
• 操作方法：根据切片材料大小，确定所 需纸盒的尺寸，用表面光滑的磅纸预先 叠好纸盒。
（九）切片
• 即（二）固定
• 将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固 定液中。借助固定液的作用，使细胞的新陈代谢瞬时停止， 并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变 化。从而达到使组织变硬从而便于切片、增强内含物的折 光度、令细胞易于着色的目的，同时具有防腐作用。以新 鲜配制固定液效果较好。固定的时间依材料的种类、性质、 大小等而定。材料固定完毕，保存于加盖的容器内，贴上 标签。

山西中学组织学石蜡切片制作过程一、前期准备工作1.2保存组织标本：取得组织标本后，应及时将其放入含有固定剂（如福尔马林）的容器中。

目的是阻止组织中的生物活动，保持组织的完整性，并且避免其腐烂。

1.3固定组织标本：将标本浸泡在福尔马林等固定剂中，时间根据组织的大小和性质而定，一般为24-48小时。

固定后，将固定剂倒掉，并用80%乙醇代替，以除去固定剂残留。

二、石蜡包埋2.1脱水处理：为了去除组织中的水分，使其逐渐转变为可以被石蜡所取代的有机物质，需要使用一系列递增浓度的酒精溶液浸泡标本。

一般步骤为70%酒精浸泡2小时，85%酒精浸泡2小时，95%酒精浸泡1小时，绝对酒精浸泡1小时，每次浸泡30分钟。

2.2渗透处理：将标本放入石蜡浸泡器中，利用负压吸取空气，将石蜡通过负压使其渗透到组织内部。

首先使用浓度为70%的石蜡浸泡1小时，然后逐渐转移到90%、100%的石蜡浸泡器中，每次浸泡时间为30分钟。

2.3包埋处理：取出石蜡浸泡器中的标本，将其放入石蜡中央的切底模具中。

使用石蜡将标本完全覆盖，并且与切底模具紧密贴合。

然后将模具放入冷却器中，待石蜡冷却凝固。

三、切片制作3.1准备切片机：将切片机的刀刃和刀脊擦拭干净，然后固定标本架在切片机上。

调整刀刃角度和切片厚度，一般切片厚度为3-5微米。

3.2开始切片：启动切片机，使刀刃快速向下移动，与固定的石蜡标本接触。

切割完毕后，将得到的石蜡切片放入温水中，使其浮起来。

3.3过片处理：使用刷子将切片从水中捞出，并悬挂在热面层上。

用热力将切片展平，然后放入烘箱中进行烘干。

四、切片染色4.1染料溶液准备：准备需要的染色溶液，常用的染色剂有伊红、苏木精、淡甲酸溶液等。

根据实验需求和组织特性选择合适的染料。

4.2开始染色：将石蜡切片依次放入每种染料溶液中，染色时间根据组织特性和染料浓度来确定。

一般染色时间不宜过长，以免影响染色质量。

4.3染色过程控制：对于希望获得不同颜色的组织结构，可以通过控制染色时间来实现。

一、实验目的1. 熟悉石蜡切片的制作过程。

2. 掌握石蜡切片的染色技术。

3. 了解石蜡切片在组织学研究和病理诊断中的应用。

二、实验原理石蜡切片技术是一种常用的组织学制片方法，其原理是将组织标本进行脱水、浸渍、浸蜡等处理，使其在石蜡中充分浸渍，然后用微型切片机将其切成薄片，最终制成组织学切片。

石蜡切片具有切片厚薄均匀、染色效果好、保存时间长等优点，是组织学研究和病理诊断的重要工具。

三、实验材料1. 实验动物：小白鼠2. 实验器材：石蜡切片机、显微镜、载玻片、盖玻片、染色缸、酒精灯、剪刀、镊子等3. 实验试剂：卡诺氏固定液、FAA固定液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡、埃利希苏木精染液、1%伊红酒精溶液、1%盐酸酒精溶液等四、实验步骤1. 取材：取小白鼠肝脏组织，用剪刀剪成小块。

2. 固定：将剪好的组织块放入卡诺氏固定液中固定24小时。

3. 脱水：将固定好的组织块依次放入70%、80%、90%、95%、100%酒精溶液中，每级酒精溶液浸泡1小时，使组织逐渐脱水。

4. 透明：将脱水的组织块依次放入三个二甲苯溶液中，每缸浸泡1小时，使组织逐渐透明。

5. 浸蜡：将透明的组织块依次放入三个石蜡溶液中，每缸浸泡1小时，使组织完全浸渍在石蜡中。

6. 包埋：将浸好蜡的组织块放入熔蜡中，待石蜡凝固后取出，用剪刀修整蜡块。

7. 切片：将修整好的蜡块固定在石蜡切片机上，调整切片厚度为4微米，制成石蜡切片。

8. 展片：将切好的石蜡切片展平在载玻片上。

9. 脱蜡：将展平的石蜡切片依次放入二甲苯、无水乙醇中，使切片脱蜡。

10. 染色：将脱蜡后的切片放入苏木精染液中染色5-10分钟，然后放入1%盐酸酒精溶液中分化，最后放入伊红染液中复染30秒。

11. 封片：将染好的切片放入封片液中封片。

五、实验结果制作完成的石蜡切片在显微镜下观察，可见到肝脏组织的细胞结构，如细胞核、细胞质、血管等。

六、实验讨论1. 石蜡切片技术是组织学研究和病理诊断的重要工具，具有切片厚薄均匀、染色效果好、保存时间长等优点。

石蜡切片的制作过程（一）花药切片制片法1．取材2．固定：FAA液中固定24h，并保存在其中。

3．脱水：经70％乙醇、85%乙醇，每级3~4h，含1%伊红的95％乙醇中3~4h（可以过夜），无水乙醇2次，每次1~2h。

4．透明、加蜡：5级氯仿透明，每级3~4h，纯氯仿2次，每次2h，加碎蜡，然后置36℃温箱中1~2d5．浸渗、包埋：50%、70%蜡各3h，再经纯蜡A、纯蜡B、纯蜡C三杯，每杯1h，包埋。

6．修蜡块、切片：粘蜡块时组织块直立于台木上，并用单面刀片切除先端石蜡，浸水软化后放在切片机上坐横切片，切片厚12μm。

7．展片、粘片、烘片：蜡片先镜检，每张载玻片上放2个蜡片，展片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃温箱中烘干。

8．脱蜡、透明：二甲苯脱蜡、透明各1次。

9．染色（番红-固绿双重染色）：在已脱蜡的材料上滴注无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、蒸馏水各4~5s，苯胺番红染色5~10min，用蒸馏水洗去浮色。

10．脱水、透明：各级乙醇脱水（30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇），苯胺固绿复染30~40s，再经95%乙醇，无水乙醇，1/2无水乙醇+1/2二甲苯、二甲苯2次，各约4~5s，最后置二甲苯缸中。

11．封片、烘片：加拿大树胶封片。

封片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃左右的温箱内烤数天即可烤干。

最后，将干燥好的切片上的浮色擦净，并在玻片的左端粘上标签，注明组织切片的名称、染色方法、固定方法、年月日。

制片日程（二）花芽纵切片制片法1．取材2．固定：FAA液中固定24h，并保存在其中。

3．整染：经70％乙醇、50%乙醇各2~4h，转入爱氏苏木精稀释液（爱氏苏木精原液1份，加入50%乙醇及乙醇各半的混合液1份）中整染2~3d。

4．水洗、反蓝：蒸馏水浸洗，勤换水至无浮色渗出，再转入自来水中，换1~2次水，至样品由紫色变深蓝色为止，共需时约1d。

石蜡切片制片流程（番红固绿滴染）1.鲜样FAA（18：1：1）抽气固定24h以上。

2.易碎的材料可用甘油酒精软化剂（1：1）软化1周以上（乙二胺软化剂容易导致颜色变深）。

3.70%酒精浸泡1h。

4.80%酒精浸泡1h。

5.95%酒精浸泡1h。

6.吸水纸迅速吸干，100%酒精浸泡1h。

7.100%酒精浸泡1h。

8.含1/2酒精+二甲苯的溶液浸泡1h。

（若有浑浊，即脱水不完全，需要重新从95%酒精再脱水一次）。

9.纯二甲苯浸泡1h。

10.纯二甲苯浸泡1h。

11.加入约1/4二甲苯体积的碎蜡，放置约半小时，再加入1/4体积碎蜡（也可一步到位）。

12.视混合物熔点而定，40-50℃液体状态渗蜡1-2d。

13.视石蜡熔点而定，50-65℃（高于熔点3-5℃），含1/2二甲苯+石蜡的蜡锅浸蜡2h。

14.含1/3二甲苯+2/3石蜡的蜡锅浸蜡2h。

15.纯石蜡锅浸蜡2d以上。

16.包埋（若材料大、中间有空气可调高温度再抽气）（新蜡不易凝固，可在新蜡锅抽气再用老蜡包埋）。

17.空气中冷却（急剧冷却容易收缩不均而变形），削块成棱台形蜡块。

18.切片（8-20µm，若太薄易碎则调高厚度）。

19.40℃水中展片，用涂有粘片剂的载玻片捞片（展片时间不宜太短，易产生褶皱）（捞片的展片效果优于滴水展片，气泡少），40℃烘干。

20.40-50℃烤片2-3d（比石蜡熔点低5℃左右），让蜡带充分贴在玻片表面。

21.铅笔做好标记，二甲苯浸泡脱蜡20-30min。

22.二甲苯透明10-20min。

23.取出，滴加含1/2酒精+二甲苯的溶液，放置数秒，倾去。

（需要过渡酒精至与染色剂的酒精含量相同的浓度，染色）（以50%番红酒精溶液和95%固绿为例）。

24.滴加100%酒精，放置数秒，倾去。

25.滴加95%酒精，放置数秒，倾去。

26.滴加80%酒精，放置数秒，倾去。

27.滴加70%酒精，放置数秒，倾去。

28.滴加50%酒精，放置数秒，倾去。

石蜡切片的制作的实验指导石蜡制片法是将材料经过固定、脱水、透明、浸蜡后包埋在石蜡里面进行切片的方法，是永久制片法。

是光学显微镜的制片技术中最常用的一种方法。

（一）材料的采集与分割•采集材料应根据制片的目的和要求而定，材料要有代表性，无病虫害或其它损伤，如要观察病理解剖，则要取病斑、病症部位。

为使固定液能迅速的渗透材料，材料要进行分割。

分割时动作要迅速，以防材料萎蔫。

分割块的大小，宜小不宜大，一般不超过1cm3，分割后立即杀死固定。

•操作：取来桐花叶子数片，用刀片将其切割成小于1cm3大小的小块取材原则：•植物材料的取材（注意季节；横切面，纵切面）•动物组织的取材（各器脏的全部组织结构或重要结构，如消化管包括粘膜、粘膜下层、肌肉和外膜四层结构；切割方向，取材大小）注意事项：•遵循准确、典型、完整、适时原则•固定剂的选择•刀须锐利•详细记录时期、采集地点、标本名称、年龄、性别、取材部位、断面和所用固定剂等（二）杀死与固定•利用药剂迅速把细胞杀死，以保持材料本来的状态和结构。

•将F.A.A固定液放在具塞小瓶中，投入材料，盖好瓶盖，时间为24小时。

说明：F.A.A固定液既是良好的固定剂，也是保存剂，因此材料可长期保存在固定液中备用。

卡诺固定液穿透力强，固定较小材料一般1~6小时即可，最多不超过24小时。

因卡诺固定液不能做保存剂，所以固定后要用95%、85%酒精浸洗，每级约20min.，然后保存在70%的酒精中备用。

（乙醇+醋酸：F.A.A，也称卡诺氏固定液）固定和固定剂•固定的概念和目的••将所要观察的新鲜组织割取后立即投入某种固定剂中，通过化学药品的作用保存组织、细胞的形态结构，不使其改变形态和变质的一种措施•固定的作用和目的••防止组织自溶和腐败，保存细胞内蛋白质、脂肪、糖、酶等成分••使细胞成分沉淀和凝固，因而产生不同折射率，造成光学上的差异，使某些看不清的结构变得清晰，而且有些固定剂可使细胞各部分容易染色••固定剂兼有硬化作用，使组织硬化不易变形，利于后续操作••固定的主要目的是保持材料生活时的状态。

常规石蜡切片制片方法组织经系列酒精的脱水，经透明剂的作用，经熔化的石蜡的浸渍，包埋后所切成的切片称为石蜡切片。

组织脱水把含于组织内或细胞内的水份用脱水剂把其置换出来的过程称组织脱水。

不管是正常的组织，还是有病变的组织，都含有不同程度量的水分。

据测定，人体的物质组成约含水55~67%，蛋白质15~18%，脂类10~15%，无机盐3~4%及糖类1~2%[14]。

如果不把这些水分脱去，石蜡切片将无法进行，因为石蜡和水不能混合在一起，所以除去组织中的水分成为制片中的关键，用什么物质才能担当起这个重任呢，至今为止，国内所用的都是酒精。

因它不管在什么样比例的情况下都能和水混合，所以它可以慢慢地将水从组织中置换出来。

酒精脱水力强，对组织又有硬化和易脆的不良影响。

在使用时，通常是从低浓度至高浓度，浓度系列通常是70%、80%、90%、95%和100%，组织经过这一系列处理后，基本可达到脱水的目的。

临床上如使用含酒精的固定液固定组织时，(Carnoy氏、AAF液)组织不需要经过低浓度的酒精，可直接进入95%酒精脱水。

组织脱水，目前常用的有两种方法1.人工组织脱水法该法经济实惠，灵活度高，可根据不同的组织及其大小来确定脱水时间，也可根据不同组织及大小分批进行脱水，其优点是：①可根据不同的组织及大小，任意增减脱水时间，达到脱水目的。

②可随时观察组织的变化，随时中断组织的脱水，不使组织过度硬脆。

③可以多层次地进行脱水。

缺点：①需耗费人力，每个步骤的递增都需要人工完成。

②不能大批量的进行脱水。

③必须在上班完成脱水或者定点于某一浓度的酒精中过夜，晚上无法进行梯度递增。

2.自动组织脱水机脱水法自动组织脱水机的机型品种繁多，大小不一，国内生产的轨道式和圆盘式两种，国外生产的有圆盘式和柜式两种，上述国内外四种型号的机子，我们都使用过，根据使用的效果做一简单介绍。

①轨道式自动组织脱水机。

这种机子容量小，脱水用的试剂不足一千毫升，组织块脱水用的提篮小，每次只能容纳40块组织左右，它适合于较小的单位，但不适合于大单位。

石蜡切片操作步骤植物组织石蜡切片的制作方法：（1）固定：用50%或70% FAA固定液（50%或70%酒精：甲醛：冰乙酸=16:1:1; 幼嫩材料用50 % FAA；老的材料用70%的FAA），置于4℃固定24 h。

（2）脱水：将固定液倒去，加入50%乙醇，室温静置30 min ；重复一次，室温静置20 min。

换成1%番红溶液(用70%酒精配制)，室温脱水染色过夜。

次日继续脱水，酒精浓度梯度和时间依次为：80% 乙醇1h、95% 乙醇1h、无水乙醇1h、40min（2次）。

（3）透明：1/2无水乙醇+二甲苯混合液1h，纯二甲苯1h、40 min（2次）。

最后加入少量二甲苯（浸没材料即可）和碎蜡，放入38℃温箱中过夜。

（4）浸蜡：将温箱温度调至56℃，计时1h；换成二级蜡1h；三级蜡（3次）各1h、1h、40min（从温度上升到56℃开始计时）。

（5）包埋：将带有材料的液体蜡倒入叠好的纸槽中，迅速放入冰水中使蜡凝固，防止气泡产生，以及凝蜡不匀。

（6）切片：修整蜡块，用Lica RM2126切片机切片，厚度5-10 μm。

（7）贴片: 在载玻片上涂少许粘片剂，将切好的蜡带放入温水中，捞至载玻片上，最后置于37℃恒温箱过夜烤片。

（8）脱蜡及染色：①番红-固绿对染ⅰ脱蜡：二甲苯60min，二甲苯5 min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5 min、无水乙醇5 min、无水乙醇5 min、95%乙醇5 min、80%乙醇5 min、1%番红室温过夜。

ⅱ染色：80%乙醇5 min，1%固绿（用95%酒精配制）迅速蘸一下，大约10s，直接放到95%乙醇5min 、无水乙醇5min、无水乙醇5min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5min、二甲苯5 min（2次）。

②甲苯胺蓝染色ⅰ脱蜡：二甲苯60 min、二甲苯5 min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5 min、无水乙醇5 min、无水乙醇5 min、95%乙醇5 min、80%乙醇5 min、70%乙醇5 min、50%乙醇5 min 、30%乙醇5 min、蒸馏水5 min。