大珠母贝金属硫蛋白cDNA克隆与序列特征分析

合浦珠母贝几丁质酶基因与章鱼胺受体基因的克隆、表达与功能分析合浦珠母贝(Pinctada fucata),是我国海水珍珠养殖的主要贝类,著名“南珠”即为其所产。

近年来,由于养殖环境恶化、疾病虫害以及种质退化等原因导致合浦珠母贝珍珠产量及质量下降。

几丁质是贝壳形成的的三大重要成分之一,而几丁质酶又是几丁质的调控蛋白。

章鱼胺受体广泛存在于无脊椎动物中,具有调节神经肌源性节奏收缩、调节cAMP水平、参与磷酸化途径等多种重要功能。

为探究几丁质酶基因与章鱼胺受体基因在合浦珠母贝生长发育及贝壳形成过程中的作用,本研究根据合浦珠母贝的高通量测序获得的转录组数据,克隆了合浦珠母贝几丁质酶-1基因与章鱼胺受体基因,并通过不同组织的表达分析、不同发育时期的表达分析、破壳诱导表达分析和原位杂交实验推测了这两个基因的表达特性及生理功能。

初步探讨了它们在合浦珠母贝生长、发育以及贝壳修复过程中的作用,为进一步开展合浦珠母贝的繁育与育珠工作提供了理论基础。

研究结果如下:1.合浦珠母贝Pf-Chi1基因的克隆与表达分析本研究根据合浦珠母贝的转录组数据,筛选到一个几丁质酶基因片段,通过5’-RACE和3’-RACE 技术得到了合浦珠母贝几丁质酶-1基因的cDNA全长,命名为Pf-Chi1(GenBank 登录号:KT956975)。

Pf-Chi1基因cDNA序列全长为2743bp,5’非翻译区(5’-UTR)为47bp,开放阅读框为2187bp,3’非翻译区(3’-UTR)为509bp,具有一个加尾信号(AATAAA)。

该基因编码728个氨基酸,蛋白的预测分子量为78.41kDa,理论等电点(PI)为5.57,包含一个长度为19个氨基酸的信号肽。

功能结构域预测发现该蛋白具有4个保守结构域:1个N端催化结构域(GH18糖水解结构域)和3个几丁质结合结构域(CBM14结构域);几丁质酶-1氨基酸序列比对结果显示,Pf-Chi1与其他物种Chi1具有同源性,相似度为22.43-31.4%,其中与太平洋牡蛎的相似性最高为31.4%;系统进化树结果显示,Pf-Chi1归类于双壳纲且与太平洋牡蛎Chi1聚为一支,说明Pf-Chi1属于双壳纲Chi1家族。

大珠母贝金属硫蛋白cDNA序列克隆与表达研究的开题报告一、研究背景和意义:大珠母贝(Pinctada maxima)是一种极具经济价值的贝类，其翠绿色珍珠因色泽鲜艳、光泽度高，成为了珠宝市场上的热门商品。

大珠母贝产生珍珠的过程中，需要大量的金属硫蛋白参与，因此研究大珠母贝金属硫蛋白的作用、分布、表达等方面的信息，对于了解珍珠形成的机理、提高珍珠产量和质量具有重要的意义。

二、研究内容和目标:本研究旨在克隆大珠母贝金属硫蛋白基因的cDNA序列，分析其基因组结构和编码蛋白的理化性质，并通过RT-PCR等分子生物学技术对其在不同组织、不同发育阶段的表达情况进行分析，以期了解大珠母贝金属硫蛋白的功能特点及其与珍珠形成之间的关系。

三、研究方法和步骤:1. 从大珠母贝组织中提取总RNA，利用逆转录转录为cDNA。

2. 根据已知的任意一段金属硫蛋白基因序列的保守区域设计引物，通过PCR扩增出目标基因的cDNA序列，进行基因克隆。

3. 对所得基因进行生物信息学分析，包括基因组结构分析，编码蛋白理化性质预测等。

4. 通过RT-PCR检测大珠母贝金属硫蛋白的表达情况，包括在不同组织、不同发育阶段的表达水平变化。

5. 结合研究结果对大珠母贝金属硫蛋白的生物学功能和与珍珠形成之间的关系进行探讨。

四、研究预期成果:本研究预期可以获得大珠母贝金属硫蛋白的完整cDNA序列，并通过基因结构分析和编码蛋白预测得出该基因的理化特性，同时还能够了解该基因在大珠母贝不同组织、不同发育阶段的表达情况，揭示其生物学功能与珍珠形成之间的关系。

这些成果可以为深入探究珠母贝珍珠形成的机理、提高珠母贝珍珠产量和质量等方面提供理论基础。

大珠母贝组织蛋白酶B基因克隆及其表达分析作者：徐扬王姿曼李俊辉梁飞龙邓岳文杨创业来源：《南方农业学报》2021年第05期摘要：【目的】分析组织蛋白酶B基因（CatB）在大珠母贝（Pinctada maxima）不同组织中的表达模式，明确CatB在大珠母贝中的功能作用，为培育生长快且抗逆性强的大珠母贝提供基础资料。

【方法】利用RACE克隆大珠母贝CatB基因，利用ExPASy ProtParam、ExPASy ProtScale、NPS@SOPMA、SWISS-MODEL及SignalP 4.1等在线软件进行生物信息学分析，并以实时荧光定量PCR检测CatB基因在大珠母贝外套膜（套膜区、边缘膜区和中央膜区）、肝胰腺、鳃、足和闭壳肌等组织中的表达情况。

【结果】大珠母贝CatB基因cDNA序列全长1365 bp，其开放阅读框（ORF）1026 bp，5'非编码区（5'-UTR）长度81 bp，3'非编码区（3'-UTR）长度258 bp，共编码341个氨基酸残基。

大珠母贝CatB蛋白分子量为37.73 kD，理論等电点（pI）为6.66，脂溶性系数为67.48，不稳定指数为31.18，亲水性平均系数（GRAVY）为-0.451，为稳定的亲水性蛋白;在第89～337位氨基酸存在一个Pept-C1结构域。

大珠母贝CatB蛋白二级结构以无规则卷曲为主，占51.03%，α-螺旋占26.98%，β-转角占9.09%，延伸链占12.90%;三级结构与马氏珠母贝（P. fucata martensii）CatB蛋白结构相似。

大珠母贝CatB氨基酸序列与马氏珠母贝CatB氨基酸序列（ADX32985.1）的相似性高达90.91%;与长牡蛎（Crassostrea gigas，XP_011428258.1）、海湾扇贝（Argopecten irradians，ANG56311.1）、褶纹冠蚌（Cristaria plicata，AEF32260.1）的CatB氨基酸序列相似性分别为79.47%、65.38%和62.18%。

第35卷第8期东　北　林　业　大　学　学　报Vol.35No.8 2007年8月JOURNAL OF NORT HE AST F ORESTRY UN I V ERSI TY Aug.2007二色补血草中2个金属硫蛋白基因的克隆及分析1)李红艳　杨传平　王玉成　王丙锋(林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040) 摘　要　从二色补血草中分离出2个金属硫蛋白基因的c DNA全序列,分别命名为Lb M T1和Lb M T2。

Lb M T1全长为569bp,其中5′非编码区23bp,3′非编码区300bp,开放读码框(ORF)长246bp,编码含81个氨基酸的蛋白,相对分子质量为8070,等电点为4.7;Lb M T2全长为523bp,其中5′非编码区61bp,3′非编码区216bp,开放读码框长246bp,编码81个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量为8000,等电点为5.0。

这2个基因编码的氨基酸都含有14个半胱氨酸Cys,分布在蛋白质的N端和C端,呈CC、CXC和CXXC形式排列。

疏水性分析表明:这2个蛋白都存在35～48个氨基酸之间较强的疏水区。

通过对多种植物的MT蛋白序列比对分析表明,金属硫蛋白家族在氨基酸数目上保守性差,但半胱氨酸残基(Cys)的位置和数目保守性达到100%,揭示了Cys对金属硫蛋白的功能十分重要。

这2个基因已经在Genbank上注册,Lb M T1基因的登录号为EF103574,Lb M T2基因的Genbank登录号为EF103575。

关键词　二色补血草;基因克隆;金属硫蛋白分类号　Q785C lon i n g and Sequence Ana lysis of Two M et a lloth i one i n Genes fro m L i m on ium bicolor/L i Hongyan,Yang Chuan2p ing,W ang Yucheng,W ang B ingfeng(School of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin150040,P.R.Chi2na)//Journal of Northeast Forestry University.-2007,35(8).-1～5T wo metall othi onein(MT)genes were cl oned fr om L i m onium bicolor,na med Lb M T1and Lb M T2,res pectively.The Lb M T1gene is569bp in length,including23bp of5′untranslated regi on and300bp of3′untranslated regi on.It has anopen reading fra me(ORF)of246bp,encoding a p r otein of81a mino acid residues,with p r otein molecular weight of8070and is oelectric point of4.7.The Lb M T2gene is523bp in length,including61bp of5′untranslated regi on and216bp of3′untranslated regi on.The open reading fra me(ORF)of Lb M T2is246bp,encoding81a m ino acid residues.The mo2lecular weight of encoding p r otein is8000with the is oelectric point of5.0.Both Lb M T1and Lb M T2have14Cysresidues(cys)that have conserved sequence positi on at N ter m inal and C ter m inal of p r otein,ranking in the for m s of CXC andCXXC.Hydr ophobicity analysis showed that there was a high hydr ophobic regi on bet w een35and48residue positi ons.M ulti p le sequence align ment of M T p r oteins fr om s ome p lants revealed that the M T gene fa m ily shared l ow identities in se2quence,but were conserved in Cys residue positi ons and the nu mber of Cys residues,i m p lying that Cys residues may p layvery i m portant r oles in the functi on of MT p r oteins.These t w o genes were accep ted by Genbank,the accessi on nu mber ofLb M T1is EF103574and Lb M T2is EF103575.Key words　L i m onium bicolor;Gene cl oning;Metall othi onein 金属硫蛋白(metall othi oneins,M T)是一类低分子量、富含金属和巯基的非酶蛋白,广泛存在于生物界。

中华补血草金属硫蛋白基因的克隆及高盐处理下的表达模式分析刘瑜;陈世华;尹海波;李丽霞;赵吉强;张莹;韩会玲;郭善利【期刊名称】《烟台大学学报（自然科学与工程版）》【年(卷),期】2011(024)002【摘要】以中华补血草叶片为材料,提取其总RNA并反转录cDNA,并以cDNA为模板,克隆得到包含该基因完整开放阅读框的cDNA序列,序列分析表明,该基因开放阅读框长249 bp,编码82个氨基酸;该蛋白含有14个半胱氨酸,主要分布在蛋白质的N端和C端,呈CC,CX,CXXC形式排列.预测该蛋白分子质量为8 133.1 D;等电点为4.72;35～48位和52～68位氨基酸间有2个较强的疏水区.用3% NaCl处理补血草植株0、12、24、48、72h,利用半定量-PCR技术对该基因在盐胁迫下表达模式的分析表明,在3%NaCl处理条件下,随着盐处理处理时间的延长该基因的表达量逐渐升高,在盐处理48 h时表达量最高,之后其表达量出现下降.%The metallothionein gene, with an open reading frame of 249bp and encodes a protein of 82 amino rnacid residues, is cloned from Limonium sinense Kuntze. This protein has 14 Cys residues (Cys) and a conrnserved sequence of C -C , C -X -C ,C -X -X -C at the end of both C -and N-terminal. There are two strong hydrophornbic areas at 35 -48 and 52 - 68 amino acid residues. Expression analysis of MT by semi-quantitative-PCR rntechnology showes the expression level is increasing gradually when Limonium sinense Kuntze is treated with rn3％ NaCI for 0,12,24,48 ,72 h. It reaches the highest levels at 48 h, then decreases. This study lays afounrndation for the deep research of MT from Limonium sinense Kuntze in response to salt stress.【总页数】5页(P121-125)【作者】刘瑜;陈世华;尹海波;李丽霞;赵吉强;张莹;韩会玲;郭善利【作者单位】烟台大学化学生物理工学院,山东烟台264005;烟台大学化学生物理工学院,山东烟台264005;烟台大学化学生物理工学院,山东烟台264005;烟台大学化学生物理工学院,山东烟台264005;烟台大学化学生物理工学院,山东烟台264005;烟台大学化学生物理工学院,山东烟台264005;烟台大学化学生物理工学院,山东烟台264005;烟台大学化学生物理工学院,山东烟台264005【正文语种】中文【中图分类】Q945【相关文献】1.二色补血草中2个金属硫蛋白基因的克隆及分析 [J], 李红艳;杨传平;王玉成;王丙锋2.中华补血草Syntaxin基因的克隆 [J], 张莹;陈世华;韩会玲;窦伟红;尹海波;赵吉强;郭善利3.中华补血草Syntaxin基因的克隆（英文） [J], 张莹;陈世华;韩会玲;窦伟红;尹海波;赵吉强;郭善利4.一个新的二色补血草金属硫蛋白基因LbMT2的克隆及其表达分析 [J], 班巧英;刘桂丰;王玉成;张大伟;蒋丽丽5.中华补血草LsRab7基因的克隆及盐、干旱胁迫下表达分析 [J], 艾丽花;姜夕雷;贾冰晨;王宇;陈世华;尹海波;郭善利因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。