提高O-糖基化水平对CHO—K1细胞突变型tau蛋白过度磷酸化的影响

氧化应激与阿尔茨海默病阿尔茨海默病( Alzheimer disease.AD )是一种多病因神经系统退行性疾病。

临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。

阿尔茨海默病(AD的致病过程是一个多因素、多机制、渐进性的复杂过程，其发生与多种基因突变和遗传相关，如淀粉前体蛋白(amyloid pre-cursor protein ，APP)，早老素蛋白 (PSEN1和PSEN2和口载脂蛋白 E £ 4 (APOE E 4)。

病理学上，阿尔茨海默病(AD表现为来源于APP生成的B -淀粉样蛋白(B -Amyloid , A p )聚集沉积引起的老年斑 (senile plaque , SP,聚集的磷酸化微管稳定蛋白质(tau )弓|起的细胞内神经原纤维缠结fneurofibril-lary tangle ，NFT)。

氧化应激( oxidative stress )是指体内的自由基或其他产物超过机体抗氧化能力的一种病理状态，由于体内氧化还原的平衡失调，从而产生过多的活性氧(ROS和活性氮(RNS，在金属离子的作用下发生Fenton 反应，形成羟基自由基f 。

OH 。

小脑颗粒细胞、大脑皮质神经元和星形胶质细胞等多种细胞在病理条件下，可以产生过量的一氧化氮(NO , NO与超氧阴离子反应生成活性更强的过氧亚硝基(ONOO-及.OH,进而使得机体面临着潜在损伤。

氧化应激反应的特征表现在ROS和RNS的产生和抗氧化防御的不平衡，强有力的证据表明ROS^n RNS的增加引起的氧化应激和许多抗氧化防御酶功能丧失和阿尔茨海默病（AD有着重要关系。

A p和金属离子动态平衡紊乱等因素诱导产生的氧化应激是阿尔茨海默病（AD形成的关键因素。

重点综述了阿尔茨海默病（AD中的生物大分子氧化；A p和金属离子动态平衡紊乱诱导氧化应激与阿尔茨海默病（AD的关系；同时介绍了阿尔茨海默病（AD中氧化应激相关的信号转导。

ʌ实验研究ɔ电针对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗大鼠下丘脑β淀粉样蛋白㊁Tau 蛋白磷酸化水平与糖原合成酶激酶-3的影响❋王静芝1,杜艳军1ә,陈㊀丽1,黄浏娇2,瞿㊀涛1,周焕娇1,陈㊀茜1(1.湖北中医药大学针灸骨伤学院/针灸治未病湖北省协同创新中心,武汉㊀430061;2.湖北中医药大学中医临床学院,武汉㊀430061)㊀㊀摘要:目的:观察电针对IR 大鼠下丘脑β淀粉样蛋白(Aβ42)㊁Tau 蛋白磷酸化(p-Tau )水平表达与糖原合成酶激酶-3(GSK-3)蛋白表达的影响㊂方法:70只Wistar 大鼠随机分为正常组㊁模型组㊁预防组㊁电针组㊁预防+阻滞剂组㊁电针+阻滞剂组和脑脊液组各10只,电针治疗后ELISA 法检测各组空腹血糖(FPG )㊁胰岛素(FINS )与胰岛素抵抗指数(IRI )水平变化,免疫组织化学检测下丘脑Aβ42㊁p-Tau 阳性表达,Western blot 检测GSK-3α和GSK-3β蛋白表达㊂结果:(1)较模型组大鼠,预防组和电针组大鼠FPG ㊁FIN ㊁IRI 降低(P <0.01),下丘脑Aβ42和p-Tau 阳性表达减少(P <0.05或P <0.01),下丘脑GSK-3α和GSK-3β蛋白表达降低(P <0.05或P <0.01);(2)较电针组大鼠,预防组大鼠FPG ㊁FIN ㊁IRI 降低(P <0.05),下丘脑GSK-3α和GSK-3β蛋白表达降低(P <0.05);(3)较电针+阻滞剂组,预防+阻滞剂组大鼠FPG ㊁FINS 与IRI 均降低(P <0.01),GSK-3β蛋白表达增加(P <0.05)㊂结论:电针改善IR 大鼠FPG ㊁FINS 及IRI 水平,其作用机制可能与电针抑制GSK-3α和GSK-3β蛋白表达㊁降低Aβ42和p-Tau 阳性表达相关㊂㊀㊀关键词:电针治疗;胰岛素抵抗;Aβ42;p-Tau ;GSK-3α;GSK-3β㊀㊀中图分类号:R245.9+7㊀㊀文献标识码:B㊀㊀文章编号:1006-3250(2021)05-0760-05❋基金项目:国家自然科学基金面上项目(81473786)-基于针灸抗炎作用防治阿尔茨海默病星形胶质细胞介导的β-淀粉样蛋白代谢机制研究;国家自然科学基金青年基金项目(81804170)-电针通过SIRT1/ATG7介导的自噬途径调节肝脏脂质代谢改善胰岛素抵抗的机制研究;国家自然科学基金青年基金项目(81904276)-电针通过mTORC1/S6K1自噬途径改善胰岛素抵抗大鼠认知功能损害的机制研究作者简介:王静芝(1983-),女,讲师,博士研究生,从事腧穴配伍及其效应机制研究㊂ә通讯作者:杜艳军(1975-),女,江苏连云港人,教授,博士研究生,博士研究生导师,从事针灸防治神经系统疾病的临床与实验研究,Tel :136****4878,E-mail :1051700031@ ㊂Effects of Electro-acupuncture on The Amyloid Protein βand Phosphorylation Levelsof Tau Protein and GSK-3in Hypothalamus of Insulin ResistanceRats Induced by High-fat DietWANG Jing-zhi 1,DU Yan-jun 1ә,CHEN li 1,HUANG Liu-jiao 2,QU Tao 1,ZHOU Huan-jiao 1,CHEN Qian 1(1.College of Acupuncture Moxibustion and Orthopaedics,Hubei University of Chinese Medicine /Hubei Provincial Collaborative Innovation Center of Preventive Treatment by Acupuncture and Moxibustion,Wuhan 430061,China,2.Clinical College of Chinese Medicine,Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430061,China)㊀㊀Abstract :Objective :To observe the electro-acupuncture effect on the hypothalamic expression levels of Aβ42,phosphorylated Tau protein ,GSK-3αand GSK-3βin insulin resistance model rats.Method :70Wistar rats were divided into 7groups ,10rats in each group.Fasting plasma glucose and FINs will detect after the treatment by Elisa method ,expression levels of hypothalamic Aβ42,phosphorylated Tau protein will detected via immunohistochemistry method ;expression levels of hypothalamic GSK-3αand GSK-3βwill detected via western-blotting.Result :(1)Compared with model group ,FPG ,FINS ,ISI reduced (P <0.01),expression levels of hypothalamic Aβ42,phosphorylated Tau protein decreased (P <0.05or P <0.01),expression levels of hypothalamic GSK-3αand GSK-3βdecreased (P <0.05or P <0.01)in pre-EA group and EA group ;(2)Compared with EA group ,FPG ,FINS ,ISI reduced (P <0.05),expression levels of hypothalamic GSK-3αand GSK-3βdecreased (P <0.05)in pre-EA group ;(3)Compared with electro-acupuncture plus blocker LY294002group ,FPG ,FINS ,ISI reduced (P <0.05),expression levels of hypothalamic GSK-3βincreased (P <0.05)in pre-EA plus blocker LY294002group ;Conclusion :The mechanism of electro-acupuncture improvement on peripheral blood levels of FPG ,FINS and IRI in insulin resistance model rats ,is pertaining to the regulation of inhibiting the expression of GSK-3αand GSK-3β,and reduces the positive expression of Aβ42and p-Tau.㊀㊀Key words :Electro-Acupuncture ;Insulin Resistance ;Aβ42;p-Tau ;GSK-3α;GSK-3β㊀㊀随着人口老龄化日益严重,老年期痴呆的发病率呈上升趋势㊂轻度认知功能损害(mild cognitive impairment,MCI)是介于正常老化和痴呆之间的一种不稳定的认知损伤状态,每3~4年有20%~66%的MCI患者认知功能持续恶化,最终导致痴呆的发生,其中大部分为阿尔茨海默型痴呆(alzheimer disease,AD),MCI是AD的重要危险因素[1-2]㊂胰岛素对中枢神经系统的影响包括摄食行为㊁能量储存㊁记忆认知功能[3],中枢胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)可以引起轻度认知功能损害,轻㊁中度认知功能下降[4]㊂Aβ是由淀粉样前体蛋白(APP)经β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用产生,Aβ的増加与沉积可通过生成具有神经毒性的老年斑诱发神经元变性与死亡㊂神经元微管相关蛋白(Tau蛋白)过度磷酸化则是认知功能损害的又一发病机制[5-6]㊂胰岛素信号转导通路PKB/Akt的生理底物糖原合成酶激酶-3 (glucogen synthase kinase-3,GSK3),具有GSK-3α和GSK-3β2种形式的异构体,其活性与Aβ沉积㊁tau 蛋白过度磷酸化密切相关[7]㊂本研究在造模同时给予受试动物电针预防性治疗,与造模成功后的电针治疗组作为对照,旨在观察电针预防性治疗对胰岛素抵抗大鼠认知功能的保护作用㊂并通过观察各组大鼠下丘脑Aβ42㊁p-tau㊁GSK-3α与GSK-3β表达变化与差异,探讨电针治疗在防治胰岛素抵抗大鼠轻度认知功能损害的效应机制㊂1　材料与方法1.1㊀实验动物选用清洁级雄性Wistar大鼠70只,8周龄,体质量(180ʃ20)g,购自湖北省实验动物研究中心,实验动物许可证号SCXK(鄂)2015-0018㊂饲养于湖北中医药大学实验动物中心,饲养环境温度18~ 25ħ,湿度45%~55%㊂1.2㊀主要试剂与仪器高脂饲料(上海斯莱克实验动物有限责任公司),Aβ42㊁p-Tau(美国abcam,b10148㊁ab109390), Dako REAL EnVision Detection System(安捷伦(Dako),K5007)㊂小鼠单抗β-actin(42KD)(武汉博士德生物工程有限公司,BM0627),兔多抗GSK3α(51KD)㊁兔多抗GSK3β(48KD)(武汉三鹰生物技术有限公司,13419-1-AP㊁22104-1-AP), HRP标记羊抗小鼠二抗㊁HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司,BA1051㊁BA1054),磷酸酶抑制剂㊁PMSF㊁RIPA裂解液㊁BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天,S1873㊁ST506㊁P0013B㊁P0010), TEMED㊁Trise-Base(Amresco,Amresc00761㊁Exp2017/12),HCl(信阳市化学试剂厂,GB622-89),Tris-base(西格玛奥的(上海)贸易有限公司,v900483)㊂RM2016轮转式病理切片机(德国Leica公司);JK-6生物组织摊烤片机(武汉俊杰电子有限公司);SKG抗原修复用电陶炉;电泳仪(Bio-Rad);转膜仪(Bio-Rad);凝胶扫描成像系统(Bio-Rad); BX53型显微镜(奥林巴斯生物显微镜),LP115pH 计(德国Metter-Toledo GmbH公司);酶标仪(Thermo,mμLISKANMK3);HI650离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);华佗牌毫针(苏州医疗用品厂有限公司)㊂1.3㊀分组与造模适应性喂养3d后按随机数字表法分为正常组(normal,N)㊁模型组(model,M)㊁预防组(preventing electro-acupuncture,p-EA)㊁电针组(electro-acupuncture,EA)㊁预防+阻滞剂组(p-EA+ blocker LY294002,p-EA+b)㊁电针+阻滞剂组(EA+ blocker LY294002,EA+b)㊁脑脊液组(cerebrospinal fluid,CSF)各10只㊂正常组(N)给予标准饮食(3.8kcal/g,含70%碳水化合物,20%蛋白质,10%脂肪),其余各组采用高脂饲料(5.4kcal/g,含38.5%碳水化合物,15%蛋白质,46.5%脂肪)㊂喂养8周后大鼠尾静脉采血检测FPG㊁FINS,IRI=[FPG (mmol/L)ˑFINS(mIU/L)]/22.5,模型大鼠IRI与正常大鼠比较明显升高时(P<0.001)为造模成功[8]㊂1.4㊀电针干预1.4.1㊀EA组㊀大鼠于造模成功后,使用0.30ˑ25mm不锈钢毫针,参照李忠仁主编‘实验针灸学“[9],以标本配穴电针方法选择关元㊁足三里(后三里)㊁丰隆和百会进行毫针针刺㊂足三里和丰隆穴直刺5~10mm,关元穴向剑突方向斜刺5~7mm,百会向后方平刺5mm㊂采用电针治疗仪(HANS-100 A型)连续波㊁频率(2Hz)㊁强度(1mA)㊁通电(10 min),同侧足三里穴和丰隆穴连接同一输出的2个电极,刺激强度根据局部肌肉收缩情况决定㊂每日电针10min,每周5次治疗,总疗程为8周㊂以上采取的刺激频率和电针时间㊁疗程综合文献报道决定[10]㊂1.4.2㊀p-EA组㊀从造模开始进行电针治疗,电针方法同EA组,持续16周㊂1.4.3㊀p-EA+b组㊀大鼠称重后以10%水合氯醛(30mg/kg)腹腔麻醉㊂将大鼠固定于脑立体定位仪,头顶局部常规备皮㊁消毒,依照立体定位图谱进行定位,于前囟后0.8mm在中位颅盖骨处用牙科钻钻一直径2mm的孔[11-12],以不锈钢导管插入(长18.0mm,外径0.64mm,内径0.39mm)留置(如图1);用带帽的不锈钢制导丝插入导管内封闭导管㊂手术后预防感染,将大鼠置于空笼内待6~8 h可清醒㊂术后2d起取LY294002(10μm, 10μL;1μL/min)缓慢注射,留针8~10min,以防药物沿针道返流颅外㊂电针治疗同p-EA 组,共计16周㊂1.4.4㊀EA +b 组㊀造模成功后,每日电针干预前1h ,大鼠称重后进行脑室灌注LY294002㊂脑室灌注同p-EA +b 组㊂电针治疗同EA 组,持续8周㊂1.4.5㊀CSF 组㊀大鼠称重后脑室留管同EA +b 组㊂脑脊液:Na +145.5ml /L ,K +2.8mol /L ,Ca2+2.3mol /L ,Mg2+2.2mol ,Cl -128.5mol /L ,HCO3-23.1mol /L ,H2Po4-l.lmol /L ,葡萄糖0.6lg /L ,渗透压289.omosM /L ,PH 值7.3配置完成等量灌注,操作方法同EA +b 组㊂电针治疗同EA 组㊂图1㊀大鼠脑立体定位及置管示意图1.5㊀指标收集与检测1.5.1㊀ELISA 法检测㊀大鼠空腹FPG ㊁FIN 实验16th 周治疗结束后,各组大鼠禁食12h 以尾静脉采血静置,离心取上清㊂ELISA 法按试剂盒操作要求检测各组大鼠空腹FPG ㊁FIN 并计算各组大鼠IRI ㊂1.5.2㊀免疫组化㊀各组大鼠禁食12h 颈椎脱臼法处死,冰上剥取下丘脑,右侧下丘脑组织-80ħ保存备用㊂左侧下丘脑组织用多聚甲醛(4%)固定后,酒精脱水并进行浸蜡及包埋㊂切片厚度4μm ,经脱蜡㊁抗原修复,滴加一抗(Aβ421ʒ100,p-tau ㊀㊀㊀1ʒ100)㊁二抗,镜下观察并完成镜检拍照㊂使用IPP6.0软件对免疫组化照片进行光密度分析,每张切片选取3张400倍照片做光密度分析,area 为面积,IOD 为积分光密度,density (mean )为平均光密度㊂1.5.3㊀Western blot 检测㊀从-80ħ冰箱中取出下丘脑组织,加入400μL 裂解液(含PMSF )碾磨㊁裂解离心取上清,使蛋白变性㊂BSA 标准品稀释为1㊁0.8㊁0.6㊁0.4㊁0.2标准蛋白,采用DG-3022A 酶标仪测定OD568并计算蛋白浓度㊂蛋白样品(40μg )和Marker 加入上样孔,电泳1.5h ㊂凝胶根据Marker 切下目的条带,PVDF 膜甲醇浸泡后同滤纸浸泡于电转缓冲液㊂PVDF 膜浸泡于含5%脱脂奶粉TBST ,室温摇床封闭2h ;浸泡一抗(β-actin 1ʒ200,GSK3-α1ʒ500,GSK3-β1ʒ1000),封闭液稀释相应的HRP 标记二抗(1ʒ50000),采用BandScan 分析胶片灰度值㊂1.6㊀统计学方法采用SPSS 统计软件Version 24.0进行统计分析,所有数据以均数ʃ标准差(x ʃs)表示,采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD 检验,P <0.05为差异有统计学意义㊂2㊀结果2.1㊀各组大鼠FPG ㊁FINS 与IRI 水平变化比较表1示,治疗结束与N 组比较,其他各组大鼠FPG ㊁FINS 与IRI 明显升高(P <0.05或P <0.01);与M 组比较,p-EA 组㊁EA 组㊁p-EA +b 组与CSF 组大鼠FPG ㊁FINS 和IRI 均有不同程度降低(P <0.05或P <0.01);与EA 组比较,p-EA 组大鼠的FINS 与IRI 降低(P <0.05),EA +b 组FPG ㊁FINS 与IRI 升高(P <0.05),p-EA +b 组大鼠的FPG 与IRI 升高(P <0.05);与EA +b 组比较,p-EA 与CSF 组大鼠的FPG ㊁FINS 和IRI 降低(P <0.05),p-EA +b 组大鼠的FINS 与IRI 升高(P <0.05);与CSF 组比较,p-EA +b 组大鼠的FPG ㊁FINS 与IRI 升高(P <0.05)㊂表1㊀各组大鼠FPG ㊁FINS ㊁IRI 水平比较(x ʃs )组别鼠数FPG (mmol /L )FINS (mU /L )IRIN 组10 6.02ʃ0.5513.89ʃ0.323.71ʃ0.37M 组1012.42ʃ1.16∗∗29.73ʃ9.32∗∗16.41ʃ5.47∗∗p-EA 组107.98ʃ0.60∗##һ26.07ʃ0.48∗∗#ʏһ9.24ʃ0.68∗#ʏһEA 组108.81ʃ1.62∗#һ28.76ʃ0.92∗∗#11.26ʃ2.12∗∗#EA +b 组1011.86ʃ1.39∗ʏ33.02ʃ0.75∗∗ʏ17.41ʃ7.49∗∗ʏp-EA +b 组1011.11ʃ1.71∗#ʏӘ28.96ʃ4.79∗∗һӘ14.29ʃ3.49∗∗ʏһӘCSF 组107.48ʃ0.66∗#һ29.86ʃ0.77∗∗#һ9.93ʃ4.27∗#һ㊀㊀注:与N 组比较:∗∗P <0.01,∗P <0.05;与M 组比较:##P <0.01,#P <0.05;与EA 组比较:ʏP <0.05;与EA +b 组比较:һP <0.05;与CSF 组比较:ӘP <0.05㊀㊀2.2㊀各组大鼠下丘脑Aβ42与p-Tau 表达比较图2示,第16周电针治疗结束时,黑色箭头所示棕黄色或棕褐色细胞膜是各组大鼠下丘脑Aβ42㊁p-Tau 的阳性表达㊂N 组与p-EA 组大鼠下丘脑见极少量棕黄色或棕褐色淡染的阳性细胞;EA 组㊁p-EA +b 组与CSF 组大鼠下丘脑偶见棕黄色或棕褐色淡染的阳性细胞;M 组㊁EA +b 组棕黄色或棕褐色阳性表达聚集数量多,着色深㊂图2㊀各组大鼠下丘脑Aβ42与p-Tau 免疫组织化学(ˑ400)㊀㊀表2示,M 组㊁p-EA 组㊁EA 组㊁EA +b 组㊁p-EA +b 组㊁CSF 组大鼠Aβ42㊁p-Tau 的阳性表达明显高于N 组(P <0.05或P <0.01);p-EA 组㊁EA 组大鼠Aβ42㊁p-Tau 的阳性表达低于M 组㊁EA +b 组㊁CSF 组(P <0.05或P <0.01);EA 组与p-EA 组大鼠之间Aβ42㊁p-Tau 的阳性表达差异无统计学意义;p-EA +b 组与CSF 组大鼠Aβ42阳性表达差异无统计学意义㊂表2㊀各组大鼠下丘脑Aβ42㊁p-Tau 平均光密度比值及下丘脑GSK-3α㊁GSK-3β蛋白表达比较(/β-actin ,x ʃs )组别鼠数density (mean )Aβ42p-TauGSK-3αGSK-3βN 组100.0047ʃ0.001㊀㊀㊀0.0007ʃ0.003㊀㊀㊀0.284ʃ0.02㊀㊀㊀0.349ʃ0.01㊀㊀㊀M 组100.0142ʃ0.002∗∗0.0117ʃ0.001∗∗0.598ʃ0.02∗∗0.770ʃ0.01∗∗p-EA 组100.0061ʃ0.008∗∗##һһӘ0.0012ʃ0.001∗##һһ0.329ʃ0.01∗##ʏһ0.404ʃ0.02∗##ʏһEA 组100.0092ʃ0.008∗#ʏӘ0.0013ʃ0.002∗##0.401ʃ0.02∗#0.436ʃ0.03∗##EA +b 组100.0136ʃ0.003∗∗ʏ0.0062ʃ0.001∗∗##ʏ0.442ʃ0.03∗∗#ʏӘ0.497ʃ0.03∗##ʏӘp-EA +b 组100.0110ʃ0.002∗∗ʏʏ0.0047ʃ0.002∗∗##ʏһӘӘ0.475ʃ0.02∗∗#ʏӘ0.587ʃ0.03∗∗#ʏʏһӘCSF 组100.0107ʃ0.008∗∗#ʏһ0.0017ʃ0.002∗##һ0.539ʃ0.01∗∗ʏ0.641ʃ0.04∗∗#ʏʏһһ㊀㊀注:与N 组比较:∗∗P <0.01,∗P <0.05;与M 组比较:##P <0.01,#P <0.05;与EA 组比较:ʏʏP <0.01,ʏP <0.05;与EA +b 组比较:һһP <0.01,һP <0.05;与CSF 组比较:ӘӘP <0.01,ӘP <0.05㊀㊀2.3㊀各组大鼠下丘脑GSK-3α和GSK-3β蛋白表达比较表2图3示,与N 组比较,其他各组大鼠下丘脑GSK-3α㊁GSK-3β蛋白表达增加(P <0.05或P <0.01);与M 组比较,p-EA ㊁EA 组和p-EA +b 组大鼠下丘脑GSK-3α㊁GSK-3β蛋白表达减少(P <0.05或P <0.01),CSF 组大鼠GSK-3α差异无统计学意义,GSK-3β蛋白表达减少(P <0.05);与EA 组比较,p-EA 组大鼠下丘脑GSK-3α㊁GSK-3β蛋白表达减少(P <0.05),EA +b 组㊁p-EA +b 组CSF 组大鼠下丘脑GSK-3α㊁GSK-3β蛋白表达增加(P <0.05);与EA +b 组比较,p-EA 组大鼠下丘脑GSK-3α(P <0.05),p-EA +b 组㊁CSF 组大鼠下丘脑GSK-3β蛋白表达减少(P <0.05);与CSF 组比较,EA +b 组和p-EA +b 组大鼠下丘脑GSK-3α㊁GSK-3β蛋白表达减少(P <0.05)㊂图3㊀各组大鼠下丘脑GSK-3α和GSK-3β蛋白表达电泳图㊀㊀3㊀讨论胰岛素与大脑的生物活性㊁神经结构和生理功能密切相关,对中枢神经系统认知功能有着重要影响,胰岛素相关信号分子传导异常是IR 发生的关键[13]㊂IR 时,由胰岛素介导的神经能量代谢出现异常引起神经元糖代谢紊乱,从而导致神经元功能障碍及中枢神经系统疾病的发生[14]㊂本研究依据中医针灸 治未病 理论,以足三里㊁关元㊁丰隆与百会四穴配伍,旨在培补先天之本㊁后天气血生化之源的同时,祛痰消脂㊁疏通脑络㊂研究中预防组受试动物在造模的同时给予电针治疗,以期通过电针干预激发受试动物机体内在的抗病能力,预防IR 与IR 相关的认知功能损害,强调电针早期干预的预防效应㊂GSK3是PI3K /Akt 信号通路的生理底物,通过负反馈调节该通路的效应蛋白对IR 的发生发展有重要影响㊂GSK-3α和GSK-3β是GSK3两种形式的异构体㊂活化的GSK-3a 可以激活APPγ分泌酶使得Aβ沉积增加[15-16],GSK-3β会造成tau 蛋白过度磷酸化并导致神经纤维缠结;此外,GSK-3β通过提高胰岛素受体底物的丝∕苏氨酸磷酸化水平来抑制胰岛素受体对胰岛素受体底物的酪氨酸磷酸化,通过抑制胰岛素信号传导加重IR[17-18]㊂因此,GSK-3α与GSK-3β的活化是IR与认知功能损害共同的病理改变㊂本研究中,M组㊁EA+b组和p-EA+b组大鼠下丘脑GSK-3α与GSK-3β蛋白表达增加,这与其下丘脑中Aβ42与p-Tau阳性表达聚集数量多㊁着色深的结果一致㊂同时,这3组受试动物外周血FPG㊁FINS及IRI水平升高㊂电针治疗后,p-EA组㊁EA组外周胰岛素抵抗程度显著降低,下丘脑Aβ42与p-Tau阳性表达减少,GSK-3α与GSK-3β蛋白表达降低,且p-EA组治疗效果优于EA组,p-EA组与EA 组p-Tau阳性表达结果无明显差异㊂在中枢微量注入PI3K抑制剂LY294002的条件下,电针防治效应被阻断,EA+b组㊁p-EA+b组大鼠的FPG㊁FINS与IRI升高,Aβ42与p-Tau阳性表达聚集数量多㊁着色深,且GSK-3α与GSK-3β蛋白表达增加,说明电针对IR大鼠认知功能损伤的防治效应或可通过PI3K/Akt信号通路实现㊂这与我们前期研究中发现,电针调节PI3K/Akt信号通路相关分子活性,从而促进改善IR大鼠学习记忆能力的实验结果相一致㊂然而CSF组大鼠在经过电针治疗后,下丘脑GSK-3α与GSK-3β蛋白表达增加的同时,Aβ42与p-Tau阳性表达聚集数量减少㊁着色浅,且外周血FPG㊁FINS及IRI水平降低㊂考虑PI3K/Akt信号通路不是参与针灸防治IR认知功能损害的唯一途径,因此电针防治胰岛素抵抗相关认知功能损伤的作用机制值得更进一步的研究㊂参考文献:[1]㊀BIESSELS GJ,REAGAN LP.Hippocampal insulin resistanceand cognitive dysfunction[J].Nat Rev Neurosci,2015,16:660-671.[2]㊀杨莘,乔雨晨,吴晓光,等.不同护理干预方法在轻度认知功能障碍患者中的应用效果[J].中华护理杂志,2012,47(1):77-79.[3]㊀GRAY SM,MEIJER RI,BARRETT EJ.Insulin regulates brainfunction,but how does it get there?[J].Diabetes,2014,63(12):3992–3997.[4]㊀莫巍,钱国锋.二甲双胍对高脂诱导胰岛素抵抗大鼠空间认知㊁学习记忆及脑能量代谢的影响[J].中国老年学杂志,2014,34(10):2813-2816.㊀㊀㊀[5]㊀李娜,康建华,杨立顺.阿尔茨海默病(AD)患者外周血Aβ42及Aβ40的变化研究[J].中国实验诊断学,2016,20(10):1664-1664.[6]㊀姜美驰,梁静,张玉杰,等.针刺 四关 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第四军医人学硕士学位论文】型１ＡＰＰ及Ａ０的代调｝ＭａｋｏｔｏＨｉｇｕｃｈｉ，Ｎｏｂｕｈｉｓａ１ｗａｔａａ１１ｄＴａｋａｏｍｉＣ．Ｓａｉｄｏ．ＵｎｄｅｒＳｔａｎｄｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓｉｎＡｌＺ｜ｌｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓｔｏｗａｒｄｔｈｅｒ印ｅｕｔｉｃｉｎｔｅｒｖｅｎｔｊｏｎｓ．ＢｊｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｊｏｐｂ，５ｊｃａＡｃｔａ（ＢＢＡ）－Ｐｒｏｌｅｊｎｓ＆Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００５，ＶｂＪ１７５１，１，６０一６７）图２ＡＰＰ分子跨膜结构及分泌酶作用位点ＤｅｎｎｉｓＪ．Ｓｅｌｋｏｅ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｉ’ｓｄｉｓｅａｓｅｉｓａｓｙｎａｐ帕ｃｆａｉｌｕｒｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００２ｖｏｌ２９８．２５．７８９．７９１．）第四军医大学硕士学位论文Ｆｉｇ３Ｅｆｆｅ§耋琶型囊雾善鼍』薹茎孽弄囊尹毒羟ｇ冀毫≮蠹馨雾疃彝目萼｛｛！；｛毫；氕ｐ１可ｎ；嚣羹姜ｌＨｒＬ４２鱼晴攀名挛皇ｉ罚重吒ｌ澄橐囊善ｉ蔷挂号薛ｌｍ墓鬻哗蒌琴毒薹耋型萎：薹墨霎藿塞矍￡妻美；霉薹饕ｉ毛矿；雩套车引朝！锤毒ｉ耋吁１１一目。

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黎隹捅即产生离瞪盈璺粪菲攀溜漤调节，说明非甾体类抗炎药的作用机制之一是通过ＭＡＰＫ信号系统作用的【２８１。

２．４．４引起突触功能障碍很多证据表明，早期ＡＤ的记忆障碍起始于海马突触的细微改变。

病史为２—４年的ＡＤ患者颞叶和前脑皮层的形态学定量研究显示，脑中突触密度降低２５％一３５％，突触数目降低１５％一３５％。

同时ＡＤ患者的认知障碍程度还和海马和相关皮层的突触囊泡蛋白突触体素的多少相关，在轻微认知障碍和轻度ＡＤ患者皮层中突触体素的免疫活性比同龄对照组降低２５％。

在２—３个月的ＡＰＰ转基因鼠脑中突触体素阳性的突触前终末和微管相关蛋白阳性神经元降低３０％，且出现在ＡＢ斑块出现之前。

在多个ＡＰＰ转基因小鼠系中显示海马有明显的基础突触递质和／或长时程增强（与突触可塑性相关的电生理指标）不足，如在Ｖ７１７Ｒ心Ｐ转基因鼠脑海马脑片中，基础突触递质有４０％丧失。

远志皂苷类化合物及其药理作用研究进展作者：高丽娜，周长征，刘青芝，万新焕来源：《北京联合大学学报》2022年第03期[摘要] 远志皂苷作为中药远志的主要药效成分之一，母核多为齐墩果酸型的五环三萜，其上连接多种糖类，至今已提取分离出几十种皂苷类化合物。

远志皂苷具有抗炎、抗氧化和抗衰老等多种药理活性。

其现代临床应用广泛，包括抗阿尔茨海默病（AD）、治疗心脑血管和抗癌作用等，对多种疾病或药物产生的认知功能障碍具有显著影响。

通过对远志皂苷类化合物及其药理作用的研究进行综述，以期为后续研究提供参考。

[关键词]远志皂苷;化学成分;药理作用;研究进展[中图分类号]R 285.5[文献标志码]A[文章编号]1005-0310（2022）03-0058-07Research Progress on Polygala Saponins andTheir Pharmacological EffectsGAO Lina， ZHOU Changzheng， LIU Qingzhi， WAN Xinhuan（College of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China）Abstract： Polygala saponin is one of the main medicinal components of the traditional Chinese medicine Polygalaceae. The parent nucleus is mostly a pentacyclic triterpenoid of oleanolic acid type， which is connected with a variety of sugars. So far， dozens of saponins have been extracted and isolated. Polygala saponins have various pharmacological activities such as anti-inflammatory，anti-oxidation and anti-aging， and their modern clinical applications are extensive， including anti-AD， cardiovascular and cerebrovascular effects， and anti-cancer effects as well as significant effects on cognitive dysfunction produced by various diseases or drugs. This article reviews the research on polygala saponins and their pharmacological effects in order to provide reference for subsequent researches.Keywords： Polygala saponins;Chemical constituents;Pharmacological effects;Research progress远志（P.tenuifolia）为远志科植物远志（Polygala tenuifolia Willd.）或卵叶远志（Polygala sibirica L.）的干燥根，可与多种药物进行配伍，是临床益智藥处方中使用频率排前3位的单味中草药。

tau蛋白磷酸化机制Tau蛋白是神经元突触中的重要基质蛋白，它在突触的稳定性、神经元信号传递和内部物质运输等方面扮演着重要角色。

然而，在阿尔茨海默病等神经退行性疾病中，Tau蛋白的异常聚集和磷酸化状态的改变会导致神经元损伤和神经系统衰退。

本文将就Tau蛋白的磷酸化机制进行详细的阐述。

一、Tau蛋白的结构与功能Tau蛋白是一种高度可磷酸化的蛋白质，其主要在神经元轴突的微管组装和稳定中发挥重要作用。

Tau蛋白主要存在于神经元胞体和轴突中，这种蛋白质通过微管系统的动态调节来维持神经元的形态和功能。

除此之外，Tau蛋白还参与了突触稳定性的维持和神经元内部物质运输的正常进行。

二、Tau蛋白的磷酸化过程Tau蛋白的功能和磷酸化状态息息相关，当Tau蛋白中的磷酸化水平发生改变时，其在轴突功能和细胞骨架结构等方面的维持都会产生重要的影响。

磷酸化是通过蛋白激酶来实现的，Tau蛋白主要被四种蛋白激酶磷酸化，分别为cyclin-dependent kinase 5 (CDK5)、Glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β)、microtubule-affinityregulating kinase (MARK)和Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII)。

每种蛋白激酶在磷酸化Tau蛋白的过程中都有特定的作用。

CDK5主要将Tau蛋白的Ser235和Ser404位点磷酸化，这种磷酸化状态在阿尔茨海默病中会发生异常。

GSK-3β主要磷酸化Tau蛋白的Ser199和Ser396位点，这种磷酸化状态与Tau蛋白的聚集有着密切的关系。

MARK主要磷酸化Tau蛋白的Ser262、Ser293和Ser324位点，这种磷酸化状态与Tau蛋白在微管动态稳定性中的作用密切相关。

CaMK-II主要磷酸化Tau蛋白的Ser199位点，这种磷酸化状态在Tau蛋白的亲和力和空间构象的改变中有着重要作用。

GlcNAc糖基转移酶表达下调对tau蛋白磷酸化的影响【摘要】以人O GlcNAc糖基转移酶（OGT）基因为靶点，研究小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）对HEK293T细胞中OGT 基因表达的抑制作用，以及这种抑制作用对tau蛋白磷酸化与糖基化修饰的影响。

方法：根据人OGT基因序列特点，设计高效且特异性强的siRNA。

用脂质体转染siRNA进入HEK293T细胞，通过实时PCR检测siRNA对OGT基因表达的抑制。

用蛋白免疫印迹法检测tau蛋白糖基化与磷酸化修饰的变化。

结果：设计的siRNA能够有效抑制OGT 基因的表达，与空白组相比，抑制效率可达78.1%左右。

OGT基因表达的下调使tau蛋白糖基化水平下降，而磷酸化水平增高。

结论： tau 蛋白的糖基化负调节其磷酸化,葡萄糖摄入减少或代谢降低可能在阿尔茨海默尔病的发生发展中起关键作用。

【关键词】阿尔茨海默尔病 tau蛋白 O GlcNAc糖基转移酶RNA干扰［Abstract］Objective: To investigate the inhibitory effect of small interference RNA(siRNA)targeting OGT gene on the alteration of tau phosphorylation and glycosylation level in human being. Methods： The siRNA NC and the siRNA targeting OGT gene were chemically synthesized and transfected intoHEK293T cells via lipofectamine2000.Realtime PCR was employed to evaluate the efficacy of RNA interference. The level of tau phosphorylation and glycosylation were detected by Western blot. Results： The designed siRNA could effectivly downregulate the OGT mRNA expression to 78.1% while compared with blank group. The level of the tau phosphorylation at various sites was significantly upregulated and the level of the tau glycosylation was downregulated with the inhibition of OGT gene expression. Conclusion：The modification of phosphorylation and glycosylation of tau protein indicated the apparent negative correlation, which probably was induced by deficient brain glucose uptake/metabolism in Alzheimer′s disease［Key words］Alzheimer′s disease; tau; OGT; RNA interfering阿尔茨海默尔病（Alzheimer′s disease, AD）的病理特征包括大脑局部尤其是海马和皮层神经元退行性病变，细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)和细胞外老年斑（senile plaque ,SP）沉积。