实验二抑制剂对酶促反应速度的影响-(1)

酶促反应动力学实验报告14301050154 杨恩原实验目的：1.观察底物浓度对酶促反应速度的影响2.观察抑制剂对酶促反应速度的影响3.掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值实验原理：一、底物浓度对酶促反应速度的影响在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。

在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度[S]的增加而迅速增加，但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值(即最大速度Vmax)。

底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示(Michaelis-Menten方程)即：式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[S]为底物浓度当v=Vmax/2时，则Km=[S]，Km是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法。

但是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确求得Km和Vmax。

若将米氏方程变形为双倒数方程(Lineweaver-Burk方程)，则此方程为直角方程，即:以1/V和1/[S]分别为横坐标和纵坐标。

将各点连线，在横轴截距为-1/Km，据此可算出Km值。

本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性，再根据1/v和1/[S]的倒数作图，计算出其Km值。

二、抑制剂对酶促反映的影响凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。

酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。

可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。

竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。

非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[S]与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vmax。

本实验选取Na2HPO4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。

实验步骤：实验一:底物浓度对酶促反应速度的影响1.取试管9支，将0.01mol/L基质液稀释成下列不同浓度：管号试剂2.另取9支试管编号，做酶促反应：管号试剂3.混匀，37 ℃水浴保温5分钟左右。

温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响（间接碘量法）（effects of temperature pH activitor and inhibitor to activity of enzyme）一、目的1.了解温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响2.学习酶活性的判定二、原理酶活性大小可以用反应速度来表示，即在单位时间内，酶所催化底物的消耗量或产物的生成量来衡量。

酶活性大，反应速度就快。

反之则慢。

酶促反应速度受多种因素的影响。

如温度、pH、激活剂、抑制剂等。

本实验是观察在不同温度，pH，以及缺乏激活剂或有抑制剂的条件下唾液淀粉酶的活性大小。

借以验证各种因素对酶活性的影响。

唾液中含有唾液淀粉酶，此酶可以使淀粉逐步水解，最后生成麦芽糖。

麦芽糖具有还原性。

根据淀粉被唾液淀粉酶水解后产物的生成量（即还原性麦芽糖的多少）判定酶活性的大小。

用碘的反滴定法测定还原物的量，还原物多，酶活性大。

具体反应如下：1、试剂成分（S、H、S试剂）：CuSO4、Na2CO3、NaHCO3、KI、KIO3、酒石酸钾钠、草酸钾。

2、判定酶活性大小的化学反应过程：Na2CO3＋2H2O —→2NaOH ＋ H2CO3CuSO4＋2NaOH —→Cu(OH)2↓＋ Na2SO45KI ＋KIO3 ＋ 3H2SO4—→3I2＋3K2SO4 ＋3H2O酶淀粉———→麦芽糖麦芽糖＋Cu++—→麦芽糖氧化产物＋Cu+ Cu+＋ I2—→Cu++ ＋ 2I-COO- 草酸钾COO-Cu++＋|—————→| >CuCOO- 防止逆反应COO-剩余I2 ＋ Na2S2O3—→2I- ＋ Na2S4O6（与淀粉呈兰色) （与淀粉无色)3、判定酶活性大小的标志酶活性大→麦芽糖多→Cu+ 生成量多→I2消耗量多→剩余I2少→Na2S2O3消耗量少酶活性越大，Na2S2O3消耗量越少。

空白实验无酶活性，因此Na2S2O3消耗量最多。

与空白实验进行对比，差值越大，说明此条件下酶活性越大。

温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响（间接碘量法）（effects of temperature pH activitor and inhibitor to activity of enzyme）一、目的1.了解温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响2.学习酶活性的判定二、原理酶活性大小可以用反应速度来表示，即在单位时间内，酶所催化底物的消耗量或产物的生成量来衡量。

酶活性大，反应速度就快。

反之则慢。

酶促反应速度受多种因素的影响。

如温度、pH、激活剂、抑制剂等。

本实验是观察在不同温度，pH，以及缺乏激活剂或有抑制剂的条件下唾液淀粉酶的活性大小。

借以验证各种因素对酶活性的影响。

唾液中含有唾液淀粉酶，此酶可以使淀粉逐步水解，最后生成麦芽糖。

麦芽糖具有还原性。

根据淀粉被唾液淀粉酶水解后产物的生成量（即还原性麦芽糖的多少）判定酶活性的大小。

用碘的反滴定法测定还原物的量，还原物多，酶活性大。

具体反应如下：1、试剂成分（S、H、S试剂）：CuSO4、Na2CO3、NaHCO3、KI、KIO3、酒石酸钾钠、草酸钾。

2、判定酶活性大小的化学反应过程：Na2CO3 ＋2H2O —→2NaOH ＋ H2CO3CuSO4＋2NaOH —→Cu(OH)2↓＋Na2SO45KI ＋KIO3 ＋ 3H2SO4—→3I2＋3K2SO4 ＋3H2O酶淀粉———→麦芽糖麦芽糖＋Cu++—→麦芽糖氧化产物＋Cu+Cu+＋ I2—→Cu++ ＋ 2I-COO- 草酸钾COO-Cu++＋|—————→| >CuCOO- 防止逆反应COO-剩余I2＋Na2S2O3—→2I- ＋Na2S4O6（与淀粉呈兰色) （与淀粉无色)3、判定酶活性大小的标志酶活性大→麦芽糖多→Cu+ 生成量多→I2消耗量多→剩余I2少→Na2S2O3消耗量少酶活性越大，Na2S2O3消耗量越少。

空白实验无酶活性，因此Na2S2O3消耗量最多。

与空白实验进行对比，差值越大，说明此条件下酶活性越大。

底物浓度及抑制剂对酶促反应速度的影响一、实验目的：1、学习和掌握Km的测定原理和实验方法。

2、掌握竞争性抑制剂对酶活性的影响及竞争性抑制剂表观Km’的测定。

二、实验原理：1.酶的底物浓度和酶促反应速度的关系一般情况下符合米-曼氏方程：式中：v为反应初速度；Vmax为最大反应速度；[S]为底物浓度；Km为米氏常数，其单位为mmol/L。

Km值是酶的特征性常数，一般来说，Km可以近似地表示酶与底物的亲和力。

测定Km值是酶学研究中的一个重要方法。

Lineweaver-Burk作图法（双倒数作图法，图1）是用实验方法测定Km值的最常用的比较简单的方法。

Lineweaver-Burk将米氏方程改写成双倒数形式：1/ v = Km/ Vmax×1/[S] + 1/ Vmax以1/v－1/[S]作图得一个斜率为Km/ Vmax的直线，将直线外推与横轴相交，其横轴截距为-1/Km ,纵轴截距为1/Vmax ，因此实验时，选择不同的[S]，测定相应的v，依L－B双倒数方程作图，即可求得Km 和Vmax；在抑制剂存在时，即可求得表观Km 和 Vmax，竞争性抑制的动力学特点见图2。

2.本实验以碱性磷酸酶（AKP）为例，磷酸苯二钠为底物，磷酸氢二钠为其竞争性抑制剂，茶碱为其非竞争性抑制剂。

AKP催化磷酸苯二钠水解产生游离酚和磷酸盐。

酚与酚试剂应用液在碱性溶液中生成蓝色的衍生物。

根据蓝色的深浅可测出酚的含量，从而算出相应的酶促反应速度(v)。

再根据Lineweaver—Burk法作图，计算其Km 值及抑制剂存在时表观Km值的改变。

三、实验步骤：1.米氏常数测定按下表操作：2.抑制剂对酶促反应速度的影响按下表操作：3.计算以1/A660－1/[S]作图，求出Km及表观Km。

四、结果与分析：实验数据处理表格：1.米氏常数Km测定管号0 1 2 3 4 5[S](mmol/L) 2 2 3 4 6 8A6600.206 0.318 0.412 0.496 0.5532.抑制剂存在时表观Km测定管号0 1 2 3 4 5[S](mmol/L) 2 2 3 4 6 8A6600.170 0.185 0.275 0.376 0.389作图：计算：1.Km计算：由直线方程y=7.0999x+0.9662知，当y=0时，x=-0.1361，即-1/Km=-0.1361，所以Km=7.35mmol/L，纵截距为0.96622.表观Km计算：由直线方程y=10.895x+0.9662知，当y=0时，x=-0.08868，即-1/Km=-0.08868，所以Km=11.28mmol/L，纵截距为0.9662表观Km>Km,，且纵截距相等，所以抑制剂是竞争性抑制剂。