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脑膜炎球菌鉴定依据
脑膜炎球菌是一种引起严重感染的病原菌，常导致脑膜炎、败血症和肺炎等疾病。
为了正确诊断和治疗脑膜炎球菌感染，需要有一些特定的鉴定依据。
1. 细菌培养：脑膜炎球菌可以在富含葡萄糖和肽胨的培养基上生长。
通常使用巴氏培养基进行初步培养，然后通过形态特征和生化试验来确认菌株的身份。
2. 菌落特征：脑膜炎球菌菌落表现为灰白色，呈透明或微乳白色，并具有典型的粘液性。
菌落直径通常在2-3毫米之间，表面光滑且呈圆形。
3. 革兰氏染色：脑膜炎球菌是革兰氏阴性菌，通过革兰氏染色可以观察到珠状排列的细菌链。
4. 类脂多糖（CPS）抗原检测：脑膜炎球菌表面具有多糖抗原，可以通过CPS 抗原检测来确定菌株是否属于脑膜炎球菌。
5. 血凝素分型：脑膜炎球菌的血凝素分型可以根据其荚膜多糖抗原的种类和组合进行分类。
不同的血凝素类型对于疾病的发病特点和流行病学意义有重要影响。
6. 分子生物学检测：PCR技术可以检测脑膜炎球菌的基因组DNA，确定其物种和亚型，这对于疫情监测和菌株溯源具有重要意义。
通过以上鉴定依据，可以准确诊断脑膜炎球菌感染，为患者提供及时有效的治疗。
同时，这些依据也有助于研究人员进行细菌流行病学调查和疫苗研发。
![一种A、C群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量的测定方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/400fcd7d777f5acfa1c7aa00b52acfc789eb9f1c.png)
[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公布说明书[11]公开号CN 1971266A [43]公开日2007年5月30日[21]申请号200610048876.9[22]申请日2006.12.06[21]申请号200610048876.9[71]申请人云南沃森生物技术有限公司地址650106云南省昆明市高新区云南省大学科技园2期A3幢4楼[72]发明人黄镇 吴凯 [74]专利代理机构昆明正原专利代理有限责任公司代理人刘明哲[51]Int.CI.G01N 31/00 (2006.01)G01N 1/34 (2006.01)G01N 33/00 (2006.01)C12Q 1/00 (2006.01)G06F 19/00 (2006.01)权利要求书 1 页 说明书 8 页[54]发明名称一种A、C群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量的测定方法[57]摘要本发明一种A、C群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量的测定方法，属于生物技术领域，其步骤为：取A、C群脑膜炎球菌多糖结合物作为样1；取A、C脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液为样3；取一定量A、C群脑膜炎球菌多糖结合物，加入冷酚溶液，充分振荡，离心收集上清液为样2；取一定量A、C脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液，加入冷酚溶液，充分振荡，离心收集上清液为样4。
A群脑膜炎球菌多糖结合物测定磷含量、C群脑膜炎球菌多糖结合物测定唾液酸含量，计算出样1、样2、样3、样4的多糖浓度，并利用公式计算游离多糖含量。
本发明能准确、快速、简便测定出结合物中游离多糖的含量，从而评价制品质量。
200610048876.9权 利 要 求 书第1/1页1、一种A、C群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量的测定方法，其步骤是： (1)取待检脑膜炎球菌多糖结合物2ml作为样1，取该待检脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液2ml作为样3；(2)另取该脑膜炎球菌多糖结合物2ml置于15ml离心管中，取该待检脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液2ml置于另一15ml离心管中；向每离心管加入2～10ml冷酚溶液，振荡混匀10～30分钟，置冰浴5～20分钟，5000～10000rpm离心10～30分钟，每离心管单独收集上清液，结合物上清液为样2，衍生物上清液为样4； (3)A群脑膜炎球菌多糖结合物测定磷含量，计算样1、样2、样3、样4的多糖浓度；C群脑膜炎球菌多糖结合物测定唾液酸含量，计算样1、样2、样3、样4的多糖浓度；样1、样2、样3、样4的多糖浓度分别为p1、p2、p3、p4；(4)根据公式计算回收率P：，回收率应在80～120％；(5)根据公式计算游离多糖含量H：，式中P为回收率。
多糖含量测定的方法综述多糖是指由多个单糖分子通过糖苷键连接而成的碳水化合物，是生物体中的重要成分之一，在食品工业、医药和生物技术领域具有重要的应用价值。
对多糖含量进行准确的测定是非常重要的。
目前，针对多糖含量测定的方法有很多种，包括光度法、比色法、高效液相色谱法、质谱法等。
本文将对多糖含量测定的方法进行综述，并对各种方法的原理、优缺点以及适用范围进行分析。
一、光度法光度法是一种常用的多糖含量测定方法，其原理是通过测定多糖在特定波长下的吸光度来确定其含量。
常用的方法有邻苯二甲酰氯法、硫酸-安替土林蓝法等。
邻苯二甲酰氯法是一种简便快速的多糖含量测定方法，其原理是多糖与邻苯二甲酰氯在酸性条件下反应生成二糖苷，然后与二甲基氨基苯酚生成有色产物，利用紫外分光光度计在510nm处测定吸光度。
该方法操作简便、灵敏度高，但只适用于测定淀粉样品。
硫酸-安替土林蓝法是一种比色法，通过多糖与硫酸反应产生的酸性羟乙基酚与安替土林蓝在酸性条件下产生有色产物，利用紫外分光光度计在620nm处测定吸光度。
该方法适用于多种多糖的含量测定，但操作相对复杂，且对于含有还原糖的多糖测定结果会存在误差。
二、比色法三、高效液相色谱法高效液相色谱法是一种准确快速的多糖含量测定方法，其原理是通过高压注射将多糖样品进样到色谱柱中，利用高效液相色谱仪分离多糖，并通过紫外检测器在270nm处检测吸光度，从而确定多糖的含量。
该方法准确性高，适用范围广，但需要专用的设备和耗材，成本较高。
四、质谱法根据实际需要和条件，选择合适的多糖含量测定方法非常重要。
对于一般实验室而言，光度法和比色法是常用的方法，操作简便、成本低，适用于大多数多糖的含量测定。
对于要求准确性和高通量的实验室而言，高效液相色谱法和质谱法是更好的选择，能够满足实验需要。
不同的方法可以组合使用，以提高测定准确性和可靠性。
在实际操作中，需要根据样品的性质和含量范围，综合考虑方法的原理、操作难易度和设备条件，选择合适的多糖含量测定方法。
crm197载体蛋白等电点CRM197是一种常用的载体蛋白，它是一种非毒性的脱毒白喉毒素，具有良好的免疫原性和免疫调节作用。
本文将从CRM197的基本特性、制备方法、应用领域以及等电点等方面进行介绍。
我们来了解一下CRM197的基本特性。
CRM197是一种来源于白喉杆菌的毒素，经过化学修饰后，脱去毒性成分，但保留了免疫原性。
因此，CRM197具有良好的安全性和免疫原性，常被用作疫苗的载体蛋白。
制备CRM197的方法有多种，其中最常用的是通过发酵工艺获得。
首先，将白喉菌培养于适宜的培养基中，经过发酵过程产生CRM197蛋白。
然后，通过离心、过滤、纯化等步骤，得到纯度较高的CRM197蛋白。
CRM197的应用领域非常广泛。
首先，它常被用作疫苗的载体蛋白。
将目标抗原与CRM197融合，形成融合蛋白，能够提高抗原的免疫原性，从而增强疫苗的效果。
此外，CRM197还可用于制备抗体药物。
将目标抗原与CRM197结合，形成融合蛋白，可以增强抗原的稳定性和免疫原性，提高抗体药物的疗效。
在研究中，等电点是一个重要的参数。
等电点是指蛋白质带电量为零时的pH值。
对于CRM197载体蛋白来说，其等电点通常在7.5左右。
等电点的测定对于蛋白质的纯化和性质的研究非常重要。
可以通过等电点电泳等方法来测定CRM197的等电点，从而对其进行进一步的研究和利用。
CRM197是一种常用的载体蛋白，具有良好的免疫原性和免疫调节作用。
通过发酵工艺可以制备CRM197，并且它在疫苗和抗体药物的制备中具有重要的应用价值。
其等电点通常在7.5左右，对于蛋白质的研究和利用具有重要意义。
希望通过本文的介绍，能够增加对CRM197载体蛋白的了解。
引用格式：黄杰, 李松, 孙俊, 等. 高纯度白喉毒素突变体CRM197的制备及鉴定[J]. 中国测试，2023, 49(11): 176-183. HUANG Jie, LI Song, SUN Jun, et al. Production and identification of high purity diphtheria toxin mutant CRM197[J]. China Measurement &Test, 2023, 49(11): 176-183. DOI: 10.11857/j.issn.1674-5124.2023040038高纯度白喉毒素突变体CRM197的制备及鉴定黄 杰， 李 松， 孙 俊， 赖 艺， 何 刚， 魏 鑫， 侯文礼(成都康华生物制品股份有限公司研发中心，四川 成都 611130)摘 要: 为了制备高纯度的白喉毒素无毒突变体CRM197，可作为载体蛋白用于细菌性结合疫苗开发，对CRM197基因进行大肠杆菌密码子优化，并克隆至表达载体pET28a(+）中，将鉴定正确的重组质粒pET28a-CRM197转化到大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG 诱导表达，并分析其表达形式及表达条件的优化。
再对表达的重组CRM197蛋白进行纯化，最后对纯化的CRM197进行WB 、纯度、分子量和圆二色谱等检测项目的初步鉴定分析。
PCR 酶切和测序鉴定结果表明重组质粒pET28a-CRM197构建成功，将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组工程菌(E.coli (DE3/p28a/197)。
该重组工程菌发酵的最佳接种量为5%~10%(v /v )，且主要以包涵体形式表达，收获的菌体在高压均质机破碎压力为1 000 bar 的条件下进行破碎，然后利用6 mol/L 盐酸胍进行溶解变性，复性及经30 kD 超滤膜包超滤后上纯化系统AKTA pure150 M ，经一步阴离子交换层析进行纯化，其纯度可达98%以上，WB 、分子量及圆二色谱等鉴定结果均与标准品一致。
多糖含量测定的方法有哪些多糖是指由若干简单糖分子通过糖苷键连接而成的聚合物，具有较高的相对分子质量。
多糖广泛存在于自然界中，主要分布在动植物体内。
含有多糖的食物可以提供能量，也是人们膳食中不可或缺的一部分。
因此，准确测定多糖的含量对于食品工业、生物医药和科研领域具有重要意义。
下面将介绍几种常见的多糖含量测定方法。
1. 甲基糖酚法（Phenol-Sulfuric Acid Assay）：该方法主要用于测定简单糖和寡糖的含量，对多糖如淀粉等不适用。
将待测样品与硫酸进行加热处理，使多糖降解为简单糖，然后再与糖酚溶液反应生成稳定的化合物，通过比色法或荧光法进行测定。
该方法简单、快速，但对于含有酸性糖的样品准确性较差。
2. 高性能凝胶渗透色谱法（HPSEC）：高性能凝胶渗透色谱法是一种常用的测定多糖含量的方法。
该方法通过将样品溶液通过高性能凝胶柱进行分离，根据不同分子量的多糖在柱中的滞留时间进行定量。
该方法操作简单、准确性较高，但需要高性能凝胶柱设备，且对多糖的分子量范围有一定限制。
3. pH-酚硫酸法（Phospho-Uronic Acid Method）：该方法主要用于测定多糖中的酸性糖含量，如果胶、半乳糖等。
通过将样品与磷酸进行加热处理，使多糖中的酸性糖转化为酚硫酸盐，然后再与酚硫酸试剂反应生成稳定的化合物，通过比色法进行测定。
该方法操作简单，但仅适用于酸性糖。
4. 还原糖测定法（Reducing Sugar Assay）：该方法主要用于测定含有还原糖的样品，如葡萄糖、麦芽糖等。
通过将样品与还原剂如费林试剂进行加热处理，使还原糖发生氧化还原反应生成可检测的产物，通过比色法或电化学法进行测定。
该方法操作简单、灵敏度高，但对于非还原性糖如蔗糖的测定不适用。
5. 毛细管电泳法（Capillary Electrophoresis, CE）：毛细管电泳法是一种高效分离技术，常用于测定多糖的分子量和含量。
该方法通过将样品在电场作用下在毛细管内迁移分离，根据不同分子量的多糖在电泳过程中的迁移速度进行定量。
前言结合 (以蛋白为载体的细菌多糖类) 疫苗是指采用化学方法将多糖共价结合在蛋白载体上所制备成的多糖-蛋白结合疫苗，用于提高细菌疫苗多糖抗原的免疫原性，如 b 型流感嗜血杆菌结合疫苗、脑膜炎球菌结合疫苗和肺炎球菌结合疫苗等。
结合疫苗的生产及质量控制应符合国家有关规定和中国药品 GMP 要求。
其创造及检定方法的标准操作规范、验证和修订应获得国家食品药品监督管理局的批准或者认可.本原则合用于多糖—蛋白结合疫苗生产的质量控制和临床研究。
应根据疫苗生产用菌种的生物安全防护等级分类,在相应的生物安全防护条件下进行各项生产用菌种的操作。
生产操作和质量检验人员必须经过严格的职业培训，并应采取适宜的防护措施，例如免疫接种相应的疫苗。
必须制订详细的和切实可行的紧急处理措施,确保一旦发生细菌溢出、渗漏等其它细菌播散事故时，可最大限度地控制和避免危害人身和环境的安全.一、结合疫苗生产的质量控制原则(一)多糖抗原生产的质量控制1．生产用菌种和培养基：生产用菌种须经国家食品药品管理当局批准方可用于制备多糖抗原.应采用种子批系统。
从原始种子批传代、扩增后冻干保存为主种子批。
从主种子批制备工作种子批。
主种子批和工作种子批菌种的各种特性应与原始种子批一致。
工作种子批用于生产。
应验明各级菌种库菌种的记录、来源、历史和生物学特性，并进行各项必需的生物学特性鉴定.如：形态、培养特性、生化反应和血清学试验等。
必要时可采用核磁共振(1H 或者 13C)、核苷酸序列分析等特殊鉴定方法。
培养基成份应尽可能避免使用动物源性材料，禁止使用来自疯牛病疫区的牛源性材料.应通过监测细菌的生长速度、 pH 值和多糖的产量，保证不同批或者不同培养罐中细菌生长的均一性。
应在培养过程中及杀菌前取样进行纯菌试验，可采用革兰氏染色镜检和平皿划线接种培养等。
若发现染有杂菌应废弃。
2．精制纯化多糖：精制纯化多糖应逐批进行鉴别试验、纯度和份子大小测定。
应制定多糖纯度的合格标准。
脑膜炎球菌荚膜多糖的制备方法引言脑膜炎球菌（Neisseria meningitidis）是一种致病性较强的革兰氏阴性菌，其荚膜多糖是引起脑膜炎球菌感染的主要致病因子之一。
荚膜多糖具有抗原性，可用于制备多种免疫诊断试剂和疫苗。
本文将介绍一种常用的制备脑膜炎球菌荚膜多糖的方法。
材料与试剂1.脑膜炎球菌培养物：含有目标菌株的培养基。
2.大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α：用于扩增目标基因。
3.荚膜多糖提取缓冲液：含有适量盐类和缓冲剂的溶液。
4.蛋白酶K（Proteinase K）：用于消化细胞外蛋白。
5.酚/氯仿：用于提取荚膜多糖。
6.氯仿：用于去除酚/氯仿混合物中的蛋白质。
方法1.脑膜炎球菌培养与扩增–使用含有目标菌株的培养基，在37℃下孵育过夜。
–取适量的培养液，通过离心将细胞沉淀下来。
–用荧光定量PCR或其他方法检测目标基因是否存在，并选择阳性菌落进行扩增。
2.荚膜多糖提取–将脑膜炎球菌细胞沉淀洗涤一次，并用荚膜多糖提取缓冲液重悬。
–加入适量的蛋白酶K，以消化细胞外蛋白。
在37℃下震荡反应一段时间（如30分钟）。
–离心沉淀，收集上清液。
3.荚膜多糖纯化–将上清液转移至新离心管中，加入等体积的酚/氯仿混合物。
轻轻摇晃离心管以混合两相溶液。
–离心后，上清层为酚相，含有荚膜多糖，下清层为氯仿相，含有蛋白质。
–将上清层转移至新离心管中，加入适量的氯仿，并轻轻摇晃离心管以混合两相溶液。
–离心后，上清层为氯仿相，含有荚膜多糖。
4.荚膜多糖沉淀–将氯仿相转移至新离心管中，并加入2倍体积的冷乙醇。
轻轻摇晃离心管以混合两相溶液。
–放置于-20℃的冰箱中沉淀过夜或更长时间。
–离心沉淀，倒掉上清液，并用冷乙醇洗涤沉淀3次。
–最后一次洗涤后，将乙醇完全挥发干净。
5.荚膜多糖溶解与储存–加入适量的无菌去离子水或缓冲液溶解荚膜多糖。
–用0.22μm滤膜过滤以去除残留的杂质。
–分装并储存于-20℃或更低温度保存。
结合疫苗质量控制和临床研究技术指导原则前言结合（以蛋白为载体的细菌多糖类）疫苗是指采用化学方法将多糖共价结合在蛋白载体上所制备成的多糖-蛋白结合疫苗，用于提高细菌疫苗多糖抗原的免疫原性，如b型流感嗜血杆菌结合疫苗、脑膜炎球菌结合疫苗和肺炎球菌结合疫苗等。
结合疫苗的生产及质量控制应符合国家有关规定和中国药品GMP要求。
其制造及检定方法的标准操作规范、验证和修订应获得国家食品药品监督管理局的批准或认可。
本原则适用于多糖-蛋白结合疫苗生产的质量控制和临床研究。
应根据疫苗生产用菌种的生物安全防护等级分类，在相应的生物安全防护条件下进行各项生产用菌种的操作。
生产操作和质量检验人员必须经过严格的职业培训，并应采取适宜的防护措施，例如免疫接种相应的疫苗。
必须制订详细的和切实可行的紧急处理措施，确保一旦发生细菌溢出、渗漏等其它细菌播散事故时，可最大限度地控制和避免危害人身和环境的安全。
一、结合疫苗生产的质量控制原则（一）多糖抗原生产的质量控制1．生产用菌种和培养基：生产用菌种须经国家食品药品管理当局批准方可用于制备多糖抗原。
应采用种子批系统。
从原始种子批传代、扩增后冻干保存为主种子批。
从主种子批制备工作种子批。
主种子批和工作种子批菌种的各种特性应与原始种子批一致。
工作种子批用于生产。
应验明各级菌种库菌种的记录、来源、历史和生物学特性，并进行各项必需的生物学特性鉴定。
如：形态、培养特性、生化反应和血清学试验等。
必要时可采用核磁共振（1H或13C）、核苷酸序列分析等特殊鉴定方法。
培养基成分应尽可能避免使用动物源性材料，禁止使用来自疯牛病疫区的牛源性材料。
应通过监测细菌的生长速度、pH值和多糖的产量，保证不同批或不同培养罐中细菌生长的均一性。
应在培养过程中及杀菌前取样进行纯菌试验，可采用革兰氏染色镜检和平皿划线接种培养等。
若发现染有杂菌应废弃。
2．精制纯化多糖：精制纯化多糖应逐批进行鉴别试验、纯度和分子大小测定。
应制定多糖纯度的合格标准。
4生物技术世界 BIOTECHWORLD白喉毒素(diphtheria toxin,DT)是β噬菌体将白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)溶源化后,其tox基因编码表达的外毒素[1]。
DT可以灭活真核细胞的肽链延伸因子(Elongation factor,EP),阻断其细胞蛋白合成,从而导致细胞凋亡[2]。
突变的β噬菌体溶原白喉杆菌,可以产生6种DT突变体,只具有部分毒性或不具有毒性[3]。
CRM197是一种无毒的DT突变体,因其一个碱基G突变为A,使第52位氨基酸Gly突变为Glu,造成了酶活位点改变,无法与EP结合,导致其丧失了细胞毒性[4]。
DT经过甲醛脱毒处理,可以制成白喉类毒素(Diphtheria toxoid,DTd)。
DTd可以用作疫苗蛋白载体,然而必须经过较大体积的毒性物质处理过程方能制得,且有可能恢复毒性[5]。
CRM197不具有DT的酶活性及毒性,但具有DT的免疫原性,故常作为一种理想的免疫蛋白载体而广泛应用于疫苗开发领域[6]。
CRM197在防治肺炎[7]、白喉病[4]、流行性脑膜炎[8]等呼吸道传染病方面发挥着重要作用,尤其引人瞩目的是,因其在动物体内具有良好的免疫原性和安全性,CRM197作为蛋白载体在肿瘤等疾病的药物开发中暂露头角,对攻克癌症具有深远的意义[4,9]。
本文综述了CRM197应用领域的研究现状。
1 CRM197的应用领域1.1 作为结合疫苗蛋白载体王春娥等对制备的CRM197分离纯化,将其作为蛋白载体,成功制备了A群脑膜炎球菌结合物[10],增加了我国结合疫苗的载体类型。
赵雪娜等将G17与CRM197交联制备抗癌疫苗,通过体外药效试验证明其抑制肿瘤效果显著[4]。
Sticking P等在透皮免疫研究中发现,以CM197作为交联反应物的DT疫苗可以提高小鼠体内功能性抗体水平[11]。
Br ö ke M等系统研究了CRM197的生物化学和生物学特性,指出其作为疫苗结合蛋白的重要用途和潜在的临床应用[12]。
一种检测脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素（CRM197）结合物中游离多糖含量的方法朱涛1，朱婉玉2，宇学峰2，毛慧华2，邵忠琦2*（1. 天津科技大学；2. 天津康希诺生物技术有限公司，天津 300457）摘要：目的建立一种脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素（A群、C群、Y群、W135群）结合物中游离多糖含量的检测方法。
方法根据脱氧胆酸钠（NaDC）在酸性条件下可沉淀蛋白的原理，对标准蛋白溶液进行酸沉淀处理，考察其蛋白沉淀效果；分别对脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素（A群、C群、Y群、W135群）结合物进行脱氧胆酸钠酸沉淀，检测其游离多糖含量；向脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素结合物中标加多糖衍生物，考察其准确度；向标准蛋白溶液中标加不同浓度的脱氧胆酸钠溶液，验证脱氧胆酸钠对于蛋白检测的干扰，考察其耐用性。
结果不同浓度的标准蛋白溶液经脱氧胆酸钠酸沉淀法处理后，蛋白浓度在100~300μg/ml范围内，沉淀中蛋白回收率为90%~110%，蛋白浓度大于300 μg/ml的样品时，回收率显著降低；分别对脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素结合物中标加多糖衍生物，上清中多糖回收率为80%~110%。
重复6次对脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素结合物进行游离多糖含量检测，其相对标准偏差（RSD）均低于15%；当溶液总中NaDC的浓度不高于2%时，对蛋白检测无干扰。
结论 NaDC沉淀法能专一的沉淀蛋白，不沉淀多糖，该方法有较高的准确度和精密度，重复性好，可用于脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素结合物中游离多糖含量的测定。
关键词：脑膜炎球菌多糖；白喉类毒素；游离多糖；脑膜炎球菌多糖-CRM197 结合物；脱氧胆酸钠A Method for Measuring free Polysaccharide in Meningococcal Polysaccharide - Diphtheria Toxoid Conjugate PreparationsZHU Tao1，ZHU Wan-yu 2，YU Xue-feng 2，MAO Hui-hua2，SHAO Zhong-qi 2*（1. Tianjin University of Science & Technology；2. Tianjin CanSino Biotechnology Inc，Tianjin 300457）ABSTRACT：OBJECTIVE To develop a method for quantitative determination of free polysaccharide in the preparations of meningococcal polysaccharide - diphtheria toxoid (CRM197) conjugates. METHODS A series dilution of a standard protein solution were prepared and treated with sodium deoxycholate (NaDC) in an acidic condition to determine the concentration range in which proteins can be precipitated efficiently；Free polysaccharide in four meningococcal1polysaccharide – CRM197（type A、C、Y、W135）conjugate preparations were measured by separating the conjugates and free polysaccharide through NaDC precipitation,. The accuracy, repeatability and robustness of the NaDC precipitation method were investigated in the study. RESULTS The protein recovery was over90% by NaDC precipitation when the protein concentration was in the range of 100~300 μg/ml. The precipitation efficiency would be remarkably reduced when the protein concentration was higher than 300 μg/ml. The recovery of free polysaccharide in the meningococcal polysaccharide – CRM197 conjugates, determined using the spiked samples, was 80%~110%. The relative standard deviation (RSD) of the method was <15%. NaDC did not interfere with the protein assay at the concentration lower than 2%. CONCLUSION The NaDC precipitation method is accurate, fast and highly reproducible, and can be used for quantitative determination of free polysaccharide in meningococcal polysaccharide – CRM197 conjugate preparations.KEY WORDS: Meningoccocal polysaccharides; Diphtheria toxoid (CRM197); Free polysaccharides ; Polysaccharide –CRM197 conjugates; Sodium deoxycholate流行性脑脊髓膜炎（简称流脑）是危害儿童健康的主要传染病之一，具有非常高的病死率和致残率。
目前市场上使用的流脑疫苗有多糖疫苗和结合疫苗，主要预防A、C、Y和W135群脑膜炎球菌的感染。
白喉类毒素CRM197是生产结合疫苗常用的载体蛋白之一，将A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖和CRM197偶联，可以改变荚膜多糖的抗原性质，诱导出免疫记忆及增强所产生抗体的亲和力。
这种多价流脑结合疫苗在婴幼儿中具有良好的安全性和免疫原性，并能够提供长期的保护作用。
多糖-蛋白结合物是结合疫苗中的主要保护抗原，未被结合的游离多糖若超过一定比例，则会对结合疫苗的免疫原性和保护效力造成较大影响。
因此，游离多糖含量是结合疫苗生产中一项重要的质量控制指标，同时也是评价产品稳定性的主要指标。
常用的检测游离多糖的方法有乙醇分步沉淀法[1]、疏水作用色谱（HIC）、高效液相色谱（HPLC）等。
这些方法具有操作繁琐，耗时长，重复性不好等缺点。
有文献报道[2,3]脱氧胆酸钠可用于b型嗜血杆菌结合疫苗游离多糖的检测，文中提到脱氧胆酸钠是一种表面活性剂，在溶液中随着pH值的降低，逐渐形成胶团并专一吸附沉淀蛋白质，对游离多糖无沉淀作用，由此达到使结合态作者简介：朱涛，男，教授，研究方向：疫苗学及生物制药工程 E-mail：tao.zhu@通讯作者：邵忠琦，男，博士，研究方向：疫苗研发及分子生物学 E-mail：zhongqi.shao@多糖与游离态多糖分离的目的。
但文献中报道的为b型嗜血杆菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合物中游离多糖的检测，所采用的方法是否适用于其它多糖和不同蛋白载体的结合物中游离多糖分析还有待进一步证明。
这里，我们通过对文献报道方法的改进，建立了一种可以用于脑膜炎球菌多糖-CRM197结合物中游离多糖检测的脱氧胆酸钠沉淀法，并对该方法的准确度，重复性和耐用性等进行了验证。
1.实验材料1.1 主要材料和试剂A群、C群、Y群、W135群脑膜炎球菌多糖及其衍生物，脑膜炎球菌多糖-CRM197结合物均为天津康希诺生物技术有限公司制备。
牛血清白蛋白（BSA），购自Solarbio；唾液酸、D-核糖、NaDC均购自美国Sigma公司；磷酸二氢钾，由中国药品生物制品检定所提供。
1.2 主要仪器可见/紫外分光光度计，型号Genesys 10s，购自美国热电公司；pH计，型号PB-10，购自瑞士梅特勒公司；台式冷冻离心机，型号sigma 3k15，购自美国Sigma 公司；单道可调微量移液器，规格20-200 μl、100-1000 μl、1000-5000 μl，购自德国Eppendorf公司。
2. 检测方法2.1 多糖含量测定A群脑膜炎球菌多糖-CRM197结合物中多糖含量用磷测定法[4]检测，其中磷含量与多糖含量的换算系数为13.3，即多糖含量=磷含量×13.3；C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖-CRM197结合物中多糖含量用唾液酸法[5]检测，其中唾液酸与多糖含量的换算系数分别C群多糖含量=唾液酸含量/0.85，Y 群或W135群多糖含量=唾液酸含量×1.8。
2.2 蛋白含量测定四种脑膜炎球菌多糖-CRM197结合物中的蛋白含量均用Lowry法[6]检测。
3. 脱氧胆酸钠沉淀法的建立3.1 标准蛋白溶液中蛋白含量的测定配制不同浓度的标准蛋白溶液（100、200、250、300、400、500 μg/ml），用微量移液器取供试品溶液3.0 ml于离心管中，平行两管。
每管加0.6 ml 1%NaDC，冰浴30 min，用0.1M HCl 调样品pH值至2.0-2.5，混匀，此时会出现白色絮状沉淀，将处理好的样品置于离心机内，4℃，高速离心（转速约9000 g左右），时间为30 min。
离心结束后弃去上清，沉淀用0.1M NaOH复溶至3.0 ml，检测沉淀中的蛋白含量，考察蛋白沉淀效果。
3.2 方法的准确度验证取A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖-CRM197结合物溶液，用脱氧胆酸钠沉淀法分别进行处理，过程同3.1，检测沉淀中的多糖和蛋白含量。
通过下列公式计算蛋白沉淀率及游离多糖含量，当蛋白沉淀率≥90%，实验成立。
由于钼酸铵定磷法以及唾液酸法的标准曲线最低点较高，上清中的多糖含量无法达到标准曲线下限，故检测沉淀中的结合多糖含量，再通过计算得出游离多糖含量。
蛋白沉淀率（%）=M1/M×100%式中 M1为沉淀中的蛋白含量；M为样品总蛋白含量。
