表达蛋白的生物学活性的检测

文章编号:1007-8738(2003)04-400-04TGF 2βR Ⅱ/Fc 融合蛋白的纯化及其生物学活性鉴定李圣青1,李焕章1,杨乔欣2,倪殿涛1(第四军医大学1西京医院呼吸内科,2基础部微生物学教研室,陕西西安710032)收稿日期:2002-12-23;　修回日期:2003-03-27作者简介:李圣青(19702),女,安徽芜湖人,博士生.Tel.(029)3375237/3373682Purif ication and characterization of thef usion protein TGF 2βR Ⅱ/FcL I S heng 2qi ng 1,L I Huan 2z hang 1,Y ang Qiao 2xi n 2,N I Dian 2tao11Department of Respiration ,Xijing Hospital ,2Department of Mi 2crobiology ,Fourth Military Medical University ,Xi ’an 710032,ChinaAbstractAIM :T o expre ss the fusion protein TGF 2βR Ⅱ/Fc in largeamounts by using recombinant Bac 2TR Ⅱbaculovirus expre ssion system constructed by our laboratory and to purify and charac 2terize it.Then ,to verify whether the fusion protein TGF 2βR Ⅱ/Fc can be able to block the biological activity of cytokine TGF 2β1.METH ODS :The viral titer was determined by plaque form 2ing te st.The recombinant baculovirus was amplified by in fecting sf9cells.The fusion protein was purified by FPLC using protein G column.The purified product was analyzed by SDS 2PAGE and the amount of target protein calculated by gray scanning.We st 2ern blot and sandwich E LISA were used to affirm the expre ssion of the fusion protein.MTT colorimetry was used to te st whetherthe fusion protein can block the inhibition effect of cytokine TG F 2β1on the growth of L929cells.I t was to verify whether the fusion protein can reduce the fibronectin production in L929cells ac 2celerated by TGF 2β1by we stern blot.RESU LTS :The titer ofrecombinant Bac 2TR Ⅱbaculavirus in the primary culture fluid was 2×1012pfu/L.A fter electrophore sis ,gray scanning analy 2sis showed that the target protein accounted for 10percent of the total protein.We stern blot analysis and sandwich E LISA de 2tection proved that the target protein has been expre ssed.The fusion protein could block the inhibitive effect of cytokine TGF 2β1on the growth of L929cells and fibronectin production in L929cells.CONC L USION :The fusion protein TGF 2βR Ⅱ/Fc can in 2hibit the biological activity of TGF 2β1in vitro.This study will behelpful to the mass production of the fusion protein ,and will fa 2cilitate its further use in the therapy of pulmonary fibrosis.K eyw ords :transforming growth factor 2beta ;pulmonary fibrosis ;fusion protein摘要目的:用重组Bac 2TR Ⅱ杆状病毒表达系统大量表达融合蛋白TGF 2βR Ⅱ/Fc ,并对其进行纯化及鉴定;验证该融合蛋白是否能够阻断细胞因子TGF 2β1的生物学作用。

可编辑修改精选全文完整版分子生物学实验方法与步骤表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。

强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS 结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。

采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。

因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。

二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。

2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。

3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。

4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。

5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。

6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。

7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。

8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。

9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。

二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl 封底,余加TEMED4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。

人C-Src蛋白酪氨酸激酶真核表达、纯化及活性检测徐岚;肖斌;陈慧芹;李晓荣;郝文波【摘要】The objective of this work is to construct a eukaryotic expression vector for the C-Src tyrosine kinase(Csk)gene from human. Total RNA was extracted from HeLa cells. The full-length cDNA sequence of Csk gene was isolated and amplified via RT-PCR,and cloned into a eukaryotic expression vector pENTER,the recombinant pENTER-Csk-his plasmid was constructed. The recombinant plasmid was transfected into 293T cells,after 48 hours,the expression levels of Csk protein were determined by SDS-PAGE and Western blot. The localization of Csk protein was detected via indirect immunofluorescence,and the protein Csk was purified by nickel chelate beads;in addition,the activity of the protein was measured via his-pulldown and CO-IP. Results showed that:Double digestion and sequencing reveled that recombinant plasmid pENTER-Csk-his was constructed properly without mutation. Both SDS-PAGE and Western blot detected a 51 kD protein,indicating that Csk protein was expressed successfully in the 239T cells. The indirect immunofluorescence confirmed the expression of Csk protein in cytoplasm. Finally,the purified protein Csk by nickel chelate beads interacted with the IGF1R and SHC1 by his-pulldown and CO-IP. Conclusively,this study successfully acquired the full-length sequence of Csk,the eukaryotic expression vector pENTER-Csk-his was constructed,and the gene was expressed efficiently in 293T cells,moreover,the expressed protein presented bioactivity.%旨在构建人C-Src蛋白酪氨酸激酶（Csk）基因真核表达系统。

蛋白活性的检测原理和方法蛋白活性是指蛋白质分子在生物体内发挥其生物学功能时所具有的活性特征。

蛋白活性的检测是生命科学和生物技术研究中的一个重要内容，可以帮助科研人员了解蛋白质的结构和功能，并为蛋白质的研究、开发和应用提供有价值的参考。

在蛋白活性检测中，常用的原理和方法包括理化性质法、酶活性法、配体结合法、抗原抗体相互作用法、细胞功能法等。

下面将对这几种常用方法进行详细介绍。

1. 理化性质法理化性质法是一种通过测定蛋白质的物理化学性质来评估蛋白活性的方法。

其中包括紫外吸收光谱、荧光光谱、圆二色光谱、静态光散射、动态光散射等技术。

这些方法可以通过测量蛋白质在不同波长的光吸收或发射光强度来确定其构象、稳定性、聚合状态等物理化学特性，进而推断蛋白质的活性。

2. 酶活性法酶活性法是通过测定蛋白质酶活性的方法来评估其活性。

常用的酶活性检测方法包括酶促反应动力学法、酶电极法、酶标记法等。

其中，酶促反应动力学法是通过测定酶底物的转化速率来评估酶的活性；酶电极法是通过测量酶底物和产物间的电势差或电流变化来评估酶的活性；酶标记法是通过将蛋白质与酶标记物结合，然后测定酶标记物的信号来评估蛋白质的活性。

3. 配体结合法配体结合法是一种通过测定蛋白质与配体之间的相互作用来评估蛋白活性的方法。

其中包括荧光标记法、放射性标记法、表面等温滴定法等技术。

这些方法利用配体与蛋白质结合后形成的复合物具有不同的性质，如荧光强度、放射性强度等，通过测定这些性质的变化来评估蛋白质的活性。

4. 抗原抗体相互作用法抗原抗体相互作用法是一种通过测定蛋白质与抗体之间的结合来评估蛋白活性的方法。

最常用的技术是酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA），该方法通过将抗原与抗体结合后，用酶标记的二抗对抗体进行检测，通过测定酶标记物的信号来评估蛋白质的活性。

5. 细胞功能法细胞功能法是一种通过测定蛋白质所调控的细胞功能来评估其活性的方法。

ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄＪ，Ｓｅｐ２００７，Ｖｏｌ３５Ｎｏ９人脂联素（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）基因全长１７ｋｂ，位于染色体３ｑ２７，包含３个外显子和２个内含子。

该基因编码的脂联素蛋白在血浆中分子质量为２８ｋｕ。

脂联素在血循环中含量较高，其血浆浓度约占总血浆蛋白的０．０１％［１］。

目前，脂联素在调节血糖稳态、抗动脉粥样硬化及抗炎等方面的作用已有较为肯定的认识［２］。

脂联素在治疗领域的尝试也已开始，为了能够更好地了解脂联素的结构及作用机制，本研究利用Ｇａｔｅｗａｙ表达系统快速构建了人脂联素原核表达载体，表达并纯化了重组脂联素蛋白。

１材料与方法１．１材料大肠杆菌ＤＨ５α及ＢＬ２１（ＤＥ３）均为本实验室保存，质粒ｐＭＤ１８－Ｔ，ｒＴａｑＤＮＡ聚合酶，ＤＮＡ凝胶回收试剂盒为大连宝生物公司产品。

质粒ｐＤＯＮＲ２０１，ｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２以及Ｇａｔｅｗａｙ表达体系均为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品（澳大利亚新南威尔士大学齐建成教授馈赠）。

Ｍ－ＭＬＶ逆转录酶为ｐｒｏｍｅｇａ产品。

兔抗人脂联素多克隆抗体购自Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ公司；辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的羊抗兔ＩｇＧ为北京中杉公司产品。

蛋白纯化试剂盒以及１６４０培养基为Ｎｏｖｏｇｅｎ公司产品。

蛋白复性用ＮＤＳＢ２０１由美国Ｓａｎｔａｃｒｕｚ公司ＴｏｍｍｉｅＬｅｅＳｔａｒｌｉｎｇ先生馈赠。

异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ），二硫苏糖醇（ＤＴＴ）等均为进口或国产分析纯试剂。

１．２方法１．２．１人脂肪组织总ＲＮＡ的提取和脂联素基因的克隆新鲜皮下脂肪组织标本取自一行子宫瘤切除术且无代谢性疾病者，提取总ＲＮＡ。

将１μｇ总ＲＮＡ，７２℃变性２ｍｉｎ后迅速冰浴降温，加入１５μＬ逆转录酶混合液（２ＵＲｎａｓｅ抑制剂，摘要目的：在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。

方法：利用ＰＣＲ技术扩增人脂联素基因完全编码序列，选用Ｇａｔｅｗａｙ原核表达体系，经过ＢＰ反应、ＬＲ反应两步反应，将ＰＣＲ产物克隆入ｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２质粒，构建融合表达载体ｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ－ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），以异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达脂联素融合蛋白，经镍柱亲和层析纯化，ＮＤＳＢ２０１高效复性后，使重组蛋白作用于体外培养的肝细胞，ＲＴ－ＰＣＲ法检测重组脂联素对肝细胞葡萄糖－６－磷酸酶转录水平的影响。

3C蛋白酶的表达纯化及活性鉴定技术概述作者：刘宗文李森雍德祥来源：《科学与信息化》2017年第08期摘要为获得一种新的基因工程工具酶，通过基因合成的方法获得3C蛋白酶基因并将其克隆入表达载体pGEX-4T-1中构建表达载体pGEX-4T-3C，转化大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。

表达产物经GST柱纯化后获得目的蛋白，于4℃条件下对融合蛋白TY50进行切割以鉴定活性。

结果表明3C蛋白酶在大肠杆菌中获得了稳定高效的表达，经过GST柱纯化纯度达95%以上。

酶切结果表明，获得的3C蛋白酶能够切割含有3C酶切位点的融合蛋白，因此成功开发出一种新的基因工程工具酶。

关键词蛋白酶；工具酶；基因工程1 导言蛋白酶是切割小RNA病毒科非结构蛋白的关键酶，在病毒复制过程中起重要作用。

人鼻病毒3C蛋白酶具有高度酶切特异性，识别位点为Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln Gly-Pro{Matthews， 1994 #1}，能特应性地切割Gln-Gly之间的肽键[1， 2]，人鼻病毒3C蛋白酶全长546 bp左右[3]，编码的蛋白质相对分子质量约为19997。

鉴于此特异性，本研究通过基因工程方法构建重组3C蛋白酶以开发一种新型的工具酶，丰富本公司产品类型。

利用NCBI数据库查找人鼻病毒3C蛋白酶的氨基酸序列[4]，通过本公司的生物工具网站将其优化为适用于大肠杆菌表达的基因序列，直接合成并整合到表达载体中，表达并纯化获得高纯度的3C蛋白酶。

该蛋白酶能特应性地切割含3C蛋白酶切位点的融合蛋白，具有良好的生物学活性，为开发新的基因工程工具酶奠定了良好的基础。

2 材料与方法2.1 与菌株宿主菌大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）及表达载体pGEX-4T-1为本公司自存。

2.2 试剂限制性内切酶为NEB（北京）有限公司产品；DNA聚合酶为本公司自产；胶回收及质粒小抽试剂盒为AXYGEN产品；Glutathione Sepharose 4B购自GE公司；T4 DNA连接酶购自Thermo公司。

蛋白酶体的检测方法
蛋白酶体是细胞内的重要器官，它在细胞内起着分解和降解蛋
白质的作用。

检测蛋白酶体的活性对于研究细胞的生物学功能和疾
病的发生具有重要意义。

目前，有多种方法可以用于检测蛋白酶体
的活性，以下是其中一些常用的方法：
1. 荧光显微镜观察，荧光显微镜可以观察蛋白酶体的形态和分布，结合荧光标记的蛋白质底物，可以直接观察蛋白酶体的活性和
分解过程。

2. 蛋白酶体活性检测试剂盒，商业化的蛋白酶体活性检测试剂
盒可以通过荧光或发光信号来检测蛋白酶体的活性，这些试剂盒通
常包含底物和检测试剂，操作简便，适用于高通量筛选和实验室研究。

3. 蛋白酶体特异性抑制剂，通过使用特异性的蛋白酶体抑制剂，可以抑制蛋白酶体的活性，从而间接检测蛋白酶体的功能。

4. 免疫印迹分析，利用特异性抗体对蛋白酶体相关蛋白进行免
疫印迹分析，可以检测蛋白酶体的相关蛋白表达水平，间接反映蛋
白酶体的活性。

总的来说，蛋白酶体的检测方法多种多样，可以根据实验需要选择合适的方法进行检测。

这些方法的应用可以帮助研究人员更好地理解蛋白酶体在细胞内的功能和调控机制，为相关疾病的研究和治疗提供重要的参考。

常见的蛋白检测方法蛋白质是生物体内基本的组成部分，对于研究生物体的生理、病理过程具有重要意义。

因此，准确、快速地测量蛋白质的含量和活性是生物学研究的基础之一。

本文将介绍几种常见的蛋白检测方法，包括光度法、比色法、核酸杂交、免疫层析、质谱法以及流式细胞术。

一、光度法光度法是一种常见且简单的蛋白检测方法。

通过测量可见光或紫外光通过溶液时的吸光度来确定蛋白质的浓度。

这种方法的原理是蛋白质分子中存在芳香族氨基酸（如色氨酸和酪氨酸）能够吸收紫外光。

常用的测定波长是280纳米，此时酪氨酸和色氨酸对紫外光的吸收最大。

光度法需要注意的问题是，其他物质可能会干扰吸光度的测定，因此需要选择适当的波长和合适的标准曲线进行校正。

二、比色法比色法也是一种常见的蛋白检测方法。

它利用蛋白质与某些特定化学试剂反应，生成有颜色的复合物，然后根据复合物的光吸收特性来确定蛋白质的浓度。

常用的比色试剂有Bradford试剂、Lowry试剂和BCA试剂等。

这些试剂能与蛋白质反应产生蓝色或紫色的复合物，在适当的波长下测量其光吸收度，从而得出蛋白质的浓度。

比色法的优点是灵敏度高，适用范围广，但也存在可能受到其他溶液成分的干扰的问题。

三、核酸杂交核酸杂交是一种常用的蛋白检测方法，特别适用于检测蛋白质与核酸的相互作用。

这种方法基于DNA和RNA的互补配对原理，可以通过与特定的DNA或RNA探针杂交，来检测特定蛋白质的存在。

常见的核酸杂交方法有Northern blotting和Southern blotting等。

这些方法需要先将样品中的蛋白质转化为核酸序列，然后与互补的DNA或RNA序列进行杂交，通过检测杂交物的存在来确定蛋白质的浓度。

四、免疫层析免疫层析是一种常用的蛋白检测方法，利用抗体与蛋白质的特异性结合来实现检测。

这种方法需要先制备对目标蛋白质具有特异性的抗体，然后将样品与这种抗体进行反应，形成抗原-抗体复合物。

通过抗原-抗体复合物的特定结构来检测蛋白质的存在。