硝酸还原酶(Nitrate Reductase,NR)活性测定试剂盒使用说明

硝酸还原酶（NR）检测
硝酸还原酶（Nitrate reductase, NR）属于氧化还原酶，是植物氮素同化过程中的关键酶，分布于细胞质内或细胞膜外，可催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，并与亚硝酸还原酶以偶联调节的形式对氮代谢进行调节，在初级氮同化的控制中起着重要作用。

测定原理：硝酸还原酶可催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3-+NADH+H+→ NO2-+NAD++H2O，NADH在340nm处有特征吸收峰，通过340nm处吸光度的变化即可表征硝酸还原酶活力。

迪信泰检测平台采用生化法，可高效、精准的检测硝酸还原酶活性变化。

此外，我们还提供其他氮代谢类检测服务，以满足您的不同需求。

生化法测定硝酸还原酶样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。

周期：2~3周
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）
2. 相关参数（中英文）
3. 图片
4. 原始数据
5. 硝酸还原酶活性信息。

硝酸还原酶(NR)检测试剂盒(萘胺比色法)简介：硝酸还原酶(Nitrate reductase，NR)是一种氧化还原酶，可分为参与硝酸盐同化的同化型还原酶和催化以硝酸盐为活体氧化的最终电子受休的硝酸盐呼吸异化型(呼吸型)还原酶。

硝酸还原酶是植物氮素代谢中氮素同化的关键酶，该酶与作物吸收利用氮肥有关，对作物的产量和质量有影响，因此可以把硝酸还原酶的活力当作营养诊断养、农田施肥或作物育种的生理生化指标。

Leagene硝酸还原酶(NR)检测试剂盒(萘胺比色法)检测原理是NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，其反应如下：NO3-+NADH+H+→NO2-+NAD++H2O产生的亚硝酸盐与磺胺、萘胺在酸性条件下定量生成稳定的红色偶氮化合物，于分光光度计检测吸光度，以吸光度变化所需萘胺进行计算。

该试剂盒主要用于检测植物样本、血清等中硝酸还原酶活性，尤其适用于植物体内硝酸还原酶的活力。

该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：自备材料：1、蒸馏水2、离心管或试管3、匀浆器或研钵4、恒温箱或水浴锅5、低温离心机6、比色杯7、分光光度计编号名称TE050350TTE0503100TStorage试剂(A):亚硝态氮标准(100μg/ml)1ml1ml4℃试剂(B):NR Lysis buffer250ml500ml RT试剂(C):NR Assay buffer30ml50ml RT试剂(D):硝酸盐缓冲液35ml80ml RT试剂(E):NADH2支3支-20℃试剂(F):NR终止液30ml60ml RT避光使用说明书1份操作步骤(仅供参考)：1、准备样品：①植物样品：取植物组织(根系)清洗干净，切碎，置于冰箱。

按植物组织：NR Lysis buffer 比例，加入预冷的NR Lysis buffer，冰浴情况下充分匀浆或研磨。

离心，留取上清液即为硝酸还原酶粗提液，4℃保存待用。

②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，冻存，用于硝酸还原酶的检测。

硝酸还原酶活性的测定一．试验原理：硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中的关键酶，与作物吸收和利用硝态氮的能力相关。

它催化NO3－还原为NO2－的反应：NO3－+NADH+H+→NO2－+NAD++H2O反应产生的NO2－可从组织内渗透到外界溶液中，定时测定一定的反应溶液中NO2－含量的变化情况则可了解此酶的活性大小。

NO2－的定量测定是用磺胺比色法。

此法简单易行而又非常灵敏，可测出0.5微克/ml NaNO2含量的变化。

二．试剂：磷酸缓冲液（Na2HPO4.12H2O NaH2PO4.2H2O） KNO3溶液磺胺试剂α－萘胺试剂 NaNO2标准溶液1. 0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O 30.0905g与NaH2PO4.2H2O2.4965g加去离子水溶解后定容至1000ml；2. 0.2 mol/L KNO3：称取 KNO3 20.22 g，用蒸馏水溶解，移入100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。

3.磺胺（对氨基苯磺酸胺）试剂：1克磺胺溶于25毫升浓盐酸后再用蒸馏水稀释至100 ml 。

4.α－萘胺试剂：0.2克α萘胺溶于25 ml 浓盐酸中，再用蒸馏水稀释至100 ml 。

5.NaNO2标准溶液：1克NaNO2溶于1000ml 蒸馏水中配成NaNO2母液。

实验时按处理稀释成要求浓度。

如1微克/ ml ：取母液1ml ，用蒸馏水稀释成1000 ml 。

三．仪器721型分光光度计真空泵保温箱天平真空干燥器打孔器三角瓶移液管烧杯四．试验步骤1．将新鲜取回的材料叶片用水清洗后用吸水纸吸干水份。

用打孔器取下直径为1厘米的圆片，再用蒸馏水洗2－3次，将蒸馏水吸干。

在天平上称取等重的叶子园片两份：每份0.4克左右（或每份取50个圆片）。

将两份圆片分别置于下列两种溶液中，容器使用50ml 三角瓶。

（1）0.1 M 磷酸缓冲液5 ml +蒸馏水5 ml 。

（2）0.1 M 磷酸缓冲液5 ml +0.2 M KNO3溶液5 ml 。

实验三：硝酸还原酶（NR）活性测定一、实验目的了解硝酸还原酶的活性测定的原理，掌握活体测定硝酸还原酶地方法二、实验原理硝酸还原酶是植物氮元素代谢过程中的关键酶，于作物的吸收和利用氮元素有关，他们作用于硝酸根，使之还原为亚硝酸根根：NO3-+NADH++H+ NR NO2-+NAD++H2O产生的亚硝酸根可以从组织内渗入到外界溶液中，从而测定溶液中亚硝酸根的含量的增加即为NR活性大小测定时间磺胺与亚硝酸钠形成重氮盐，再与α-奈氨偶联形成紫色物质。

反应液的酸度和温度都会对反应产生影响。

三、试剂与器材1、材料：小白菜叶片2、试剂：0.1mol/L ph7.5磷酸缓冲液，磺胺试剂、α-奈氨、0.2mol/LKNO3、NaNO2标准溶液3、器材：分光光度计、注射器、试管、天平、烧杯、移液管、恒温箱四、实验步骤1、按下列表格配置不同浓度的NaNO2溶液2、另取7支试管编号，取上述配置好的溶液各1ml，分别加入磺胺2ml、α-奈氨2ml摇匀静置30min，在520nm处比色以NaNO2终浓度为横坐标绘制标准曲线3、将小白菜叶片剪成0.5cm2大小称取两分，每份各0.5g放入另个烧杯中，一个烧杯中加入0.1ml/L磷酸缓冲液5ml再加入蒸馏水5ml，作为对照组。

林一个烧杯中加入0.1mol/L磷酸缓冲液5ml和0.2mol/LKNO3溶液5ml作为实验组。

将材料与溶液混合置于射器中抽气至材料沉入溶液。

4、将含材料的烧杯置于30℃恒温箱中30min，之后分别取1ml溶液按第二步进行NO2-含量测定5、结果分析：酶活性（NO2- μg g-1h-1）=（实验组NO2-含量-对照组NO2-含量）/材料重量（g）/时间（h）五、实验结果实验分析及感悟:由于实验过程中，移液管的混用可能会导致部分溶液污染导致实验产生误差。

叶片剪切的由于抽气不够是结果偏小。

本次试验经历了很长时间，我们从上午10点一直做到下午一点才做完。

当然经过努力的数据分析我们最终得到了我们所渴求的实验结果。

实验 6 植物体内硝酸还原酶活力的测定硝酸还原酶（ nitrate reductase,NR ），是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐（ NO 3 ˉ +NADH+H ＋→ NO 2 ˉ +NAD ＋ +H 2 O ）。

产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α - 萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。

其反应如下：生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。

硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。

一般单位鲜重以 N μg ／（ g · h ）为单位。

NR 的测定可分为活体法和离体法。

活体法步骤简单，适合快速、多组测定。

离体法复杂，但重复性较好。

Ⅰ离体法二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料水稻、小麦叶片、幼穗等。

（二）试剂1 ．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯 NaNO2 0.9857 g 溶于无离子水后定容至 1000 mL ，然后再吸取 5 mL 定容至 1000 mL ，即为含亚硝态氮的 1 μg ／ mL 的标准液。

2 ． 0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸缓冲液： Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 30.0905 g 与 NaH 2 PO 4 · 2H2 O 2.4965 g 加无离子水溶解后定容至 1000 mL 。

3 ． 1 ％磺胺溶液： 1.0 g 磺胺溶于 100 mL 3mol/L HCl 中（ 25 mL 浓盐酸加水定容至 100 mL 即为 3 mol/L HCl ）。

4 ． 0.02 ％萘基乙烯胺溶液： 0.0200 g 萘基乙烯胺溶于 100 mL 无离子水中，贮于棕色瓶中。

5 ． 0.1 mol/L KNO 3 溶液： 2.5275 g KNO 3 溶于 250 mL 0.1 mol/L pH7.5 的磷酸缓冲液。

6 ． 0.025 mol/L pH8.7 的磷酸缓冲液： 8.8640 g Na 2 HPO 4 · 12H 2 O ， 0.0570 g K 2 HPO 4 · 3H 2 O 溶于 1000 mL 无离子水中。

实验 6 植物体内硝酸还原酶活力的测定硝酸还原酶（ nitrate reductase,NR ），是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐（ NO 3 ˉ +NADH+H ＋→ NO 2 ˉ +NAD ＋ +H 2 O ）。

产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α - 萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。

其反应如下：生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。

硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。

一般单位鲜重以 N μg ／（ g · h ）为单位。

NR 的测定可分为活体法和离体法。

活体法步骤简单，适合快速、多组测定。

离体法复杂，但重复性较好。

Ⅰ离体法二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料水稻、小麦叶片、幼穗等。

（二）试剂1 ．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯 NaNO 20.9857 g 溶于无离子水后定容至 1000 mL ，然后再吸取 5 mL定容至 1000 mL ，即为含亚硝态氮的 1 μg ／ mL 的标准液。

2 ． 0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸缓冲液： Na 2HPO 4· 12H 2O 30.0905 g与 NaH2PO4· 2H2 O 2.4965 g加无离子水溶解后定容至 1000 mL 。

3 ． 1 ％磺胺溶液： 1.0 g 磺胺溶于 100 mL3mol/L HCl 中（ 25 mL 浓盐酸加水定容至 100 mL 即为 3 mol/L HCl ）。

4 ． 0.02 ％萘基乙烯胺溶液： 0.0200 g 萘基乙烯胺溶于 100 mL 无离子水中，贮于棕色瓶中。

5 ． 0.1 mol/L KNO 3 溶液： 2.5275 g KNO 3 溶于 250 mL 0.1 mol/L pH7.5 的磷酸缓冲液。

6 ． 0.025 mol/L pH8.7 的磷酸缓冲液： 8.8640 g Na 2 HPO 4· 12H 2 O ， 0.0570 g K2 HPO 4· 3H 2 O 溶于 1000 mL 无离子水中。

实验5 硝酸还原酶活性的测定【实验目的】掌握硝酸还原酶活性测定的两种方法，加深对硝酸还原酶在植物体氮素代谢中作用的理解。

【实验原理】硝酸还原酶（nitrate reductase,NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，（NO3-+NADH + H+→NO2-+NAD ++H2O）。

产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（or 对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（or 萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。

其反应如下：生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。

硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。

一般单位鲜重以Nμg/（g﹒h）为单位。

NR的测定可分为活体法和离体法。

活体法步骤简单，适合快速、多组测定。

离体法复杂，但重复性较好。

Ⅰ离体法【材料设备】（三）试剂1、NaNO2标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.1g溶于无离子水后定容至100ml，然后再吸取1ml用蒸馏水稀释成1000ml，该溶液每毫升含有NaNO21μg，用时稀释之。

2、0.1mol/L PH7.5的磷酸缓冲液，Na2HPO4·12H2O 30.0905g与NaH2PO4·2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1000mL。

3、1%（m/V）对氨基苯磺酸（磺胺酸）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol/L的HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol/LHCL）。

4、0.02%（m/V）萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100mL 去离子水中，贮于棕色瓶中。

5、0.1mol/L KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250mL 0.1mol/L Ph7.5的磷酸缓冲液中.6、0.025mol/L Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.8640g Na2HPO4·12H2O，0.0570g KH2PO4.3H2O，溶于1 000ml去离子水中。

硝酸还原酶(NR)活性的测定硝酸还原酶是一种重要的酶，参与植物的氮代谢和植物的抗逆能力等生理过程。

硝酸还原酶的活性可以反映出植物对外界环境变化的适应能力和生长发育状态。

因此，硝酸还原酶活性的测定具有重要的生物学意义。

一、实验目的本实验主要目的是通过测定植物中硝酸还原酶活性的变化，探究外界环境对硝酸还原酶活性的影响。

另外，本实验还旨在掌握硝酸还原酶活性的检测方法。

二、实验原理硝酸还原酶 (NR) 是一种能将 NO3- 还原为 NO2- 的酶。

其催化反应的速率与硝酸还原酶的活性密切相关。

因此，硝酸还原酶活性的测定，是利用一定体系中 NO3- 还原成NO2- 的速率或反应产物的含量，来评价細胞內硝酸还原酶活性大小的一种生化方法。

实验中通常采用光度法来测定硝酸还原酶的活性。

光度法是将产生的 NO2- 与苯磺酸二苯胺 ( sulfanilamide) 反应生成硝基苯偶氮苯磺酸 (N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride，NED) ，然后用紫外可见分光光度计测定产生的吸光度。

三、实验步骤3.1 实验前准备1）制备显色液：将 1g 苯磺酸二苯胺和 0.02 g NED 加入 10mL 硫酸中，用水稀释至100 mL 。

2）制备反应液：在无氧条件下，将浓硝酸滴入 50mL 去离子水中，制备100μM 硝酸钾溶液。

3）制备酶提取液：将新鲜植物组织（如叶片、幼芽等）用磨汁机研磨成细胞浆，加入0.05M 磷酸盐缓冲液 (PH=7.5) 中，按 1：5 的比例(即 1g 组织加 5mL 缓冲液) 收集悬液，离心 15 分钟，将上清液称取至 1mL，即为酶提取液。

3.2 检测方法1）在96孔板中加入100μL 酶提取液，40℃孵育20分钟。

2）加入100 μL 反应液，制备最终反应物质的浓度应为：10mM NaNO3、2mM Na2S2O4、0.05M 磷酸盐缓冲液 (pH 7.5)。

硝酸还原酶(NR)活性的测定硝酸还原酶(NR)活性的测定主要采用光度法和荧光法。

光度法测定硝酸还原酶活性的步骤如下：1. 准备0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)。

2. 准备硝酸钠(NaNO3)的不同浓度标准溶液。

3. 取一定量的细胞提取物，加入适量的磷酸盐缓冲液，使得体积总量达到一定的体积。

4. 在一条白色或透明的96孔板中，分别加入相同体积的磷酸盐缓冲液和不同浓度的NaNO3标准溶液。

5. 加入适量的细胞提取物到每一孔中，混匀。

6. 在适当的温度下孵育一定的时间。

7. 加入 Griess 试剂（硫酸铁铵与草酰胺的混合溶液）到每个孔中。

8. 在深色环境下，测量每个孔的吸光度值。

9. 利用吸光度值与所加入的NaNO3标准溶液浓度之间的关系，绘制标准曲线。

10. 根据待测样品的吸光度值及标准曲线，计算出硝酸还原酶活性。

荧光法测定硝酸还原酶活性的步骤如下：1. 准备0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)。

2. 准备硝酸钠(NaNO3)的不同浓度标准溶液。

3. 取一定量的细胞提取物，加入适量的磷酸盐缓冲液，使得体积总量达到一定的体积。

4. 在一条黑色的96孔板中，分别加入相同体积的磷酸盐缓冲液和不同浓度的NaNO3标准溶液。

5. 加入适量的细胞提取物到每一孔中，混匀。

6. 在适当的温度下孵育一定的时间。

7. 加入荧光探针（如草酰胺二乙酸盐,DAF-FM DA）到每个孔中。

8. 在荧光酶标仪中，设置适当的激发波长和发射波长，测量每个孔的荧光强度。

9. 利用荧光强度与所加入的NaNO3标准溶液浓度之间的关系，绘制标准曲线。

10. 根据待测样品的荧光强度及标准曲线，计算出硝酸还原酶活性。

NO试剂盒说明书一氧化碳试剂盒说明书(硝酸还原酶法)一.测定意义：NO化学性质活泼，体内代谢转化为硝酸盐(NO3)和亚硝酸盐(NO2),血清(NO3)与(NO2)浓度之和(NO2+NO3)才能准确代表体内(NO)水平。

血清(NO3+NO2)含量测定，国内有的单位采用金属镉还原法，但该法操作繁琐(血清需除蛋白)，反应不易控制(金属镉可将NO2进一步还原)，且不能完全将NO3还原为NO2，准确性差。

本测试法为一种灵敏、简捷、快速、稳定、易推广的方法。

二、原理：NO化学性质活泼，在体内代谢很快转化为NO2和NO3，而NO2又进一步转化为N03-,而NO2-又进一步转化为NO3-,本法利用硝酸还原酶特异性将NO3-还原为NO2-，通过显色深浅测定其浓度的高低。

一、试剂组成与配制：1.试剂一：液体6ml×2瓶(50T)如6ml×1瓶(25T)，-20℃以下保存。

使用前请放37℃水浴中或室温使其溶解后再用。

2.试剂二：液体6ml×2瓶(50T)如6ml×1瓶(25T)，-20℃以下保存。

使用前请放37℃水浴中或室温后再用。

混合试剂的配制：按试剂一：试剂二=1：1的比例配制，用多少配多少，配好后充分混合后待用，现用现配3、试剂三：液体12ml×1瓶(50T)如6ml×1瓶(25T)，室温保存4、试剂四：液体6ml×1瓶(50T)如3ml×1瓶(25T),室温保存5、试剂五：粉剂×1支，用时加90℃-100℃热蒸馏水20ml(50T)如10ml(25T)[注]，充分溶解，避光保存。

6、试剂六：粉剂×1支，用时加蒸馏水8ml(50T)如4ml(25T),避光冷藏保存，当颜色变成深咖啡色不可再用。

7、试剂七：液体8ml50T(4ml25T)×1瓶，室温保存。

显色剂的配制：需多少配多少试剂五：试剂六：试剂七=2.5：1：1.若能在一月内用完者也可以一次配成。

硝酸还原酶活性测定实验报告硝酸还原酶（nitrate reductase）是峰莱斯郎（Pierre van Laerzem）和卡尔·诺顿·塞尔西格（Carl Norton Searcy）于1943年发现的一种负责将硝酸还原为亚硝酸的酶。

该酶在许多生物体中都很常见，包括细菌、真菌、植物和动物等。

硝酸还原酶在土壤中特别重要，因为它可以将植物的主要氮源硝酸盐还原为植物可以利用的亚硝酸盐。

本实验旨在测定硝酸还原酶活性，从而了解该酶在样本中的含量及其催化亚硝酸盐的能力。

下面将详细介绍实验步骤和结果。

实验步骤：1. 取样本：从实验样本中获取合适的样品，如土壤样品、植物组织等。

2. 制备样品提取液：将样品加入合适的缓冲液中（一般为磷酸盐缓冲液），并进行均匀混合。

3. 离心：离心样品提取液，以去除悬浮的杂质及固体颗粒。

4. 超声处理：用超声波仪器对样品进行超声处理，破坏细胞结构，释放出硝酸还原酶。

5. 萃取：将样品提取液进行适度的萃取，以得到含有硝酸还原酶的萃取液。

6. 酶活性分析：将萃取液与适量的硝酸盐和辅助酶（如辅酶、酶辅酶等）混合，并在适合的温度和pH条件下孵育，一段时间后停止反应。

7. 颜色反应：使用格里希法或其他适当的方法，在反应停止后通过颜色反应测定亚硝酸盐的生成量。

亚硝酸盐的浓度与硝酸还原酶活性成正比。

8. 计算硝酸还原酶活性：根据样品的反应结果和标准曲线，计算出硝酸还原酶的活性。

实验结果：实验结果应包括标本中硝酸还原酶的活性以及对照组的活性值。

通常，对照组是以无酶萃取物为基准进行分析。

硝酸还原酶活性的测定单位为μmol/min/g（或μmol/h/g）。

讨论和结论：根据实验结果，可以比较不同样本之间的硝酸还原酶活性。

较高的活性值表明样本中含有较高水平的硝酸还原酶。

这可以用来评估土壤氮素转化能力、植物对硝酸盐的吸收能力等。

同时，本实验的成功与否也与实验流程相连。

在实验中，合适的采样技术、样品提取和超声处理等步骤对保证提取液中酶的完整性和活性至关重要。

硝酸还原酶活性测定一、原理：硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮肥有关。

它作用于NO3-使还原为NO2-；产生的NO2-可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO-2的含量的高低，即表明酶活性的大小。

NO2-含量的测定用磺胺（对氨基苯磺酸胺sulfanil—amide）比色法，这种方法非常灵敏，能测定每m10.5ug的NaNO2。

二、仪器药品：721型分光光度计、真空泵（或注射器）、保温箱、天平、真空干燥器、钻孔器、三角烧瓶、移液管、烧杯0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.50.2mol/L KNO3：溶解20.22g KNO3于1000ml蒸馏水中。

磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。

α—萘胺试剂：0.2gα—萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水中，稀释至100ml。

NaNO2标准溶液：1g NaNO2用蒸馏水溶解成1000ml。

然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，此溶液每ml含有NaNO25μg，用时稀释之。

三、操作步骤1、将新鲜取回的叶片水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用蒸馏水洗涤2到3次，吸干水分，然后于天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.2—0.3g（或每份取30个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：(1)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+蒸馏水5ml；(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+0.2mol/L KNO35ml。

然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。

将三角烧瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸取反应溶液1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml 及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，这520nm下进行比色测定。

硝酸还原酶（NR）活性检测试剂盒说明书微量法BC0085100T/48S诱导剂储备液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体10mL×1瓶，-20℃保存。

试剂二：液体2.5mL×1瓶，-20℃保存。

试剂三：液体6mL×1瓶，4℃保存。

试剂四：液体6mL×1瓶，4℃保存。

标准液：NaNO2标准储备液1mL，10μmol/mL，-20℃保存。

诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL蒸馏水，充分混匀。

标准液的配制：将标准储备液稀释为1.5、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1μmol/mL 浓度的标准溶液。

NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +NAD＋+H2O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及α - 萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。

钵、冰和蒸馏水。

一、样品测定的前处理1、取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡2h，取出样本，滤纸吸干后，-20℃冷冻30min，取出样本，滤纸吸干。

（根据需要进行诱导处理）2、称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴研磨，4000g，4℃离心10min，取上清冰上放置待测。

二、测定步骤1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（在EP管或96孔板中加入下列试剂）第1页，共2页混匀，显色20min，540nm处比色，计算（A测定-A对照）。

注意：空白管只需测一次。

三、NR活性计算：1. 标准曲线的绘制：以标准溶液浓度为x轴，以ΔA（A标准管-A空白管）为y轴绘制标准曲线，得到线性回归方程y=kx+b。

将（A测定-A对照）带入方程中，计算出x（μmol/mL）。

货号：MS1813 规格：100管/48样亚硝酸还原酶（Nitrite reductase，NiR ）试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：硝酸还原酶（NiR）是一类能催化亚硝酸盐还原的酶，广泛存在于微生物及植物体内，是自然界氮循环过程中的关键酶，可以将亚硝酸盐降解为NO或NH3，从而减少环境中亚硝态氮的积累，降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。

测定原理：亚硝酸还原酶可将NO2-还原为NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO2-减少，即 540nm处吸光值的变化可反应土壤中亚硝酸还原酶的活性。

自备实验用品及仪器：天平、研钵、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、水浴锅、低温离心机。

试剂的组成和配制：提取液：液体112mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体4mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。

临用前加 5mL 蒸馏水溶解。

试剂三：液体5mL×1 瓶，4℃保存。

（如出现沉淀可以 70-80℃加热溶解）试剂四：液体10mL×1 瓶，4℃避光保存。

（如出现沉淀可以 70-80℃加热溶解）试剂五：液体10mL×1 瓶，4℃避光保存。

工作液：临用前根据用量将试剂四和试剂五以 1:1 的比例混合。

酶液提取：1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。

10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2.细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃离心 10min，取上清置于冰上待测。