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t(17;19)-急性淋巴细胞白血病细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的敏感性及其意义张晓春;郑晓敏;陈诚;李义德【摘要】目的:观察t (17; 19)-急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞对肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)所介导的细胞毒的敏感性及可能机制,并探讨其临床意义.方法:以t(17; 19)-ALL细胞株4株、1例t (17; 19)-ALL患者骨髓标本为实验组,其他ALL细胞株28株为对照组.流式细胞术测定细胞表面TRAIL受体表达;重组人可溶性TRAIL (rhsTRAIL)作用后,3H-thymidine法测定其对细胞增殖的影响;FITC标记的Annexin-V染色及流式细胞术检测细胞早期凋亡;免疫印迹法观察细胞凋亡通路变化(caspase-8、Bia、caspase-3和PARP的表达).结果:t(17; 19)-ALL细胞表面死亡受体4(DR4)表达水平明显高于其他各组细胞株(P＜0.05),死亡受体5 (DR5)表达水平高于MLL+-ALL细胞株(P＜0.05),诱骗受体1(DcR1)和诱骗受体2 (DcR2)均呈阴性表达;rhsTRAIL浓度为100 μg·L-1时,t (17; 19)-ALL细胞抑制率接近100％,显著高于其他各组细胞株(P＜0.05或P＜0.01),该抑制作用在加入TRAIL中和抗体RIK-2及caspase广谱抑制剂z-VAD-fmk后被阻断;加入rhsTRAIL后,t(17; 19)-ALL细胞发生早期凋亡,其凋亡率明显高于对照组细胞株(P ＜0.05); rhsTRAIL作用2h内,caspase-8、Bid、caspase-3和PARP出现活化条带.结论:t (17; 19)-ALL细胞株对TRAIL高度敏感,并最终对移植物抗白血病(GVL)效应敏感,t (17; 19)-ALL患者为获得长期存活,应及早进行同种造血干细胞移植(allo-SCT).【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2014(040)001【总页数】6页(P164-169)【关键词】t (17;19)-急性淋巴细胞白血病;肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体;移植物抗白血病;细胞凋亡【作者】张晓春;郑晓敏;陈诚;李义德【作者单位】宁夏医科大学总医院儿科,宁夏银川750004;宁夏医科大学总医院儿科,宁夏银川750004;宁夏医科大学总医院儿科,宁夏银川750004;宁夏医科大学总医院医学实验中心,宁夏银川750004【正文语种】中文【中图分类】R733.71同种造血干细胞移植（allogeneic stem cell transplantation，allo-SCT）后，移植物抗白血病效应（graft versus ceukemia，GVL）由细胞毒性T细胞（cytotoxic T-lymphocyte，CTL）和自然杀伤（natural killer，NK）细胞所介导[1]，是白血病患者得以治愈的关键反应。
综述NK细胞的生物学及在肿瘤治疗中的作用自然杀伤细胞（natural killer cell，NK细胞）是一种骨髓衍化的淋巴细胞，由于在形态上胞浆丰富，胞质内含有大型嗜天青颗粒，故又称为大颗粒淋巴细胞（large granular lymphocyte，LGL）[1,2]。
1971年Cudkowizc 和Bennett首次描述了这类细胞的功能，他们发现经放射线照射的小鼠接受母体来源的骨髓细胞移植后发生了排斥反应[3,4]。
传统理论认为，移植抗原是共显性遗传的，例如，亲代抗原在第一代杂种共表达，子代能够耐受亲代的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）[3]。
然而，Cudkowizc 和Bennett发现H-2基因杂合体的第一代杂种鼠经放射线照射后能够排斥亲代H-2基因纯合体小鼠的骨髓细胞。
这种现象被称为“杂交抵抗”。
后来发现介导这种现象的细胞是一种淋巴样细胞，对放射线不敏感，能在体外直接杀伤肿瘤细胞，且无MHC限制性[1,5-7]。
随后就将这类细胞命名为NK细胞。
与T、B细胞免疫激活过程不同，NK细胞的免疫反应是迅速的，意味着其可在感染最初阶段清除病原体。
事实上，众多研究已表明，NK细胞可以清除胞内菌和寄生虫感染，在控制一些病毒感染的过程中也起重要作用[8-11]。
尽管一些体内外试验表明，NK细胞具有抗肿瘤活性，但是其确切机制还不完全清楚[12-14]。
1. NK细胞的生物学特征NK细胞占外周血淋巴细胞的10-15％，也存在于脾脏、骨髓及其它组织，包括肝脏、腹腔、胎盘[1]。
NK细胞在肿瘤和病毒感染中发挥很重要的免疫监视作用，构成机体免疫系统第一道防线。
与免疫系统其它细胞（尤其是T细胞）不同，NK细胞不能被抗原重复刺激致敏而且没有长期的抗原记忆功能。
NK细胞缺乏特异性的细胞表面分子标志，许多标志认为是NK相对特异性的，比如小鼠NK细胞表面的NK1.1、DX-5、ASGM1，人类NK细胞表面的CD56，CD16[1,15-18]。
索拉菲尼联合TRAIL对诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的影响王德华;刘云燕;李敏然;苗同国;孙杏丽;任桂芳【摘要】目的观察索拉菲尼(SOR)联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对肝癌细胞株SMMC-7721增殖及凋亡的影响.方法培养人肝癌细胞株SMMC-7721,进行同步化,分为对照组(无血清培养基)、SOR不同浓度干预组、TRAIL不同浓度干预组及SOR联合TRAIL组,用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长抑制率及流式细胞仪作凋亡分析,Western blot法检测Mcl-1蛋白表达.结果 MTT法结果显示不同浓度SOR或TRAIL单药处理组,其细胞生长抑制率随着浓度的增加而逐渐增强,而SOR(2μmol/L)联合TRAIL组,其抑制率均高于TRAIL不同浓度干预组(P<0.05).3组药物干预组细胞凋亡率均显著高于对照组(P<0.01),SOR干预组(2μmol/L)的细胞凋亡率与TRAIL干预组(100 ng/ml)比较差异无显著性(P>0.05),而SOR联合TRAIL组(2μmol/L+100 ng/ml)的细胞凋亡率显著高于其他2组(P<0.05).SOR联合TRAIL可明显抑制SMMC-7721细胞内Mcl-1的表达(P<0.05).结论SOR联合TRAIL能够抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖,增强其凋亡,其机制可能为通过Mcl-1发挥了协同作用.【期刊名称】《解放军医药杂志》【年(卷),期】2018(030)008【总页数】4页(P21-24)【关键词】肝肿瘤;索拉菲尼;肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体;凋亡【作者】王德华;刘云燕;李敏然;苗同国;孙杏丽;任桂芳【作者单位】石家庄市第五医院肿瘤科;石家庄市第五医院感染四科;石家庄市第五医院感染四科;石家庄市第五医院肿瘤科;石家庄市第五医院感染四科;石家庄市第五医院感染四科【正文语种】中文【中图分类】R735.7原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，易发生侵袭转移，预后差。
病毒性感染的免疫治疗方法引言：病毒性感染是一种全球性公共卫生问题，已经成为威胁人类健康的重要因素。
传统的抗病毒药物治疗在某些情况下可能无效或存在严重副作用，因此寻求新的治疗方法变得尤为重要。
免疫治疗作为一种新颖而可行的方法，近年来受到广泛关注。
本文将介绍几种主要的免疫治疗方法，并讨论它们在病毒性感染治疗中的应用。
一、单克隆抗体单克隆抗体是一种由单一免疫细胞分泌出的完全相同的抗体，可以特异性地与目标分子结合。
在对抗病毒性感染中，单克隆抗体可以被设计成与特定的抗原结合，并干扰病毒入侵宿主细胞的过程。
例如，在流感季节，广谱单克隆抗体可以被制备出来，覆盖多个不同株系流感病毒。
这些单克隆抗体可以中和病毒，阻止其进一步感染宿主细胞，并促进免疫系统的清除作用。
此外，单克隆抗体也可以通过调节免疫细胞功能，增强机体抗病毒反应。
二、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）TRAIL是一种能够促使恶性细胞凋亡的分子。
在病毒感染中，TRAIL被发现在某些情况下能够诱导感染的细胞自我消亡，以限制病毒复制和传播。
因此，利用TRAIL对抗病毒感染成为一种新颖而有潜力的治疗策略。
近年来，许多实验结果表明，应用TRAIL或其受体激动剂可以诱导肾上腺素酪氨酸激酶（ASK）依赖性自噬途径，并通过凋亡途径消灭RNA病毒等多种类型的病原微生物。
三、核酸干扰核酸干扰是指利用人工合成的小分子RNA介导基因沉默或抑制转录的过程。
在病毒感染中，核酸干扰技术可以靶向病毒基因组或宿主因子，从而阻断病毒复制和传播。
RNA干涉通过两种机制实现抗病毒作用：siRNA靶向病毒基因组的特定区域进行降解和miRNA通过驱动物理拮抗来遏制病毒转录和复制。
目前，核酸干扰已成功应用于治疗乙型肝炎、人免缺糖尿病等多种与病毒相关的疾病，并显示出潜力用于新型冠状病毒和流行性腺嘌呤胆碱钠转运体2（POMC）及卵巢癌细胞株virus感染的治疗。
四、细胞免疫治疗细胞免疫治疗是利用激活、扩增或改良体内之T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞以达到对抵御局部彭菌甚至肿拈带有反发应力之肿拈更好之效果。
TRAIL在肿瘤治疗中作用机制的研究进展细胞凋亡(apoptosis)又称为程序性死亡(programmed cell death,PCD)，是由基因编程调控的细胞自主性自杀过程。
细胞凋亡功能的失控可引起机体平衡失调，导致一些严重的相关疾病的发生，如肿瘤、早老性痴呆症(AD)、帕金森症(PD)、Huntingto 舞蹈症等。
经典细胞凋亡途径包括死亡受体信号传导途径和线粒体细胞色素C凋亡信号传导途径。
其中死亡受体信号传导途径的研究已经取得了部分成果，在诱导肿瘤细胞凋亡中发挥着重要作用。
而肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)及其受体是近几年新发现的TNF家族新成员, 在体内、体外均显示出良好的抗肿瘤效应且对正常组织细胞无毒性［1］,因此有望为肿瘤治疗提供新的途径，正成为新的研究热点。
本文就其结构功能及抗肿瘤机制研究最新进展综述如下。
1 TRAIL及其受体的结构与功能1.1 TRAIL TRAIL又称Apo2L(apoptosis 2 ligand)是Wiley小组［2］于1995年最早克隆和命名的又一TNF家族成员。
TRAIL基因定位于染色体3q26,分子量为32.5 kd,等电点7.63,由281个氨基酸组成的蛋白质,在转染的细胞株中以Ⅱ型跨膜蛋白的形式表达在细胞表面。
TRAIL在很多正常组织表达, 但在脑、肝和睾丸中未检测到表达［3］。
利用腺病毒作载体转导TRAIL基因介导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤基因治疗的一个新的方向［4，5］。
无论膜结合型TRAIL还是可溶性TRAIL在体外均能诱导多种肿瘤细胞凋亡，但正常组织对TRAIL蛋白不敏感。
1.2 TRAIL的受体TRAIL的受体包括TRAIL R1、TRAIL R2、TRAIL R3、TRAIL R4和骨保护素(OPG)。
根据结构与功能，可以分为2类：(1)死亡受体：包括TRAILR1、TRAILR2；(2)诱骗受体：包括TRAILR3、TRAILR4和OPG(osteoprote gerin)。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的临床前抗肿瘤作用
研究
1.pHS-TRAIL表达质粒的构建人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(human TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand, hTRAIL)是一种跨膜蛋白,由281个氨基酸组成,其中1-14位氨基酸为胞内区,15-40位氨基酸为跨膜区,41-281位氨基酸为胞外区。
由于114-281位氨基酸的胞外区片段完全具有促细胞凋亡活性,同时完整的rhTRAIL蛋白分子在体外较难获得表达,因此我们选择114-281位氨基酸所在肽段进行重组表达质粒的构建。
先前的研究发现,rhTRAIL表达系统的选择具有一定的难度,若使用真核系统对rhTRAIL蛋白进行表达,容易形成没有生物学活性的二聚体形式；当采用常规的原核系统例如T7表达体系和温度诱导性表达体系时,rhTRAIL蛋白又容易形成包涵体,这些表达系统的问题会给后期纯化工艺、产品质量等均会带来问题,因而我们选用了pBR322载体,并以此为基础构建了一个色氨酸启动子驱动目的基因的载体,随后在色氨酸启动子的下游插入编码hTRAIL114-281片段的基因序列,再将该重组质粒导入宿主菌W3110。
构建获得表达载体,确认目的蛋白的正确表达,并初步摸索了其在摇瓶水平影响表达的条件。
2. rhTRAIL的发酵及纯化工艺研究上一章节的研究中,通过基因工程技术将人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Recombinant Human TNF-related apoptosis-inducing ligand、rhTRAIL)编码胞外部分114-281aa的基因片段插入到表达载体pHS色氨酸启动子的下游,得到重组质粒pHS-TRAIL,而后将此质粒转化到W3110菌株内,基因测序结果显示插入的目的基因序列正确。
由于rhTRAIL 的临床使用剂量可能较大(通常百毫克级),因此对于表达系统、高密度发酵工艺
以蛋白纯化工艺的选择和优化以及质量控制均提出了较高的要求。
通常,影响大肠杆菌高密度发酵的因素主要包括细胞新陈代谢所需的营养的供给和控制、毒副产物(乳酸和氨)的控制或排出、氧气的供给以及关键参数,如pH值、溶氧浓度和温度等的实时控制问题。
本章就rhTRAIL的摇瓶培养、发酵生产工艺以及纯化工艺进行了初步的研究和优化,通过对培养基的组成、高密度发酵条件的优化以及纯化工艺的摸索,从而研究如何在保证生物制品产品质量的前提下提高目的蛋白表达量和纯化工艺的收率,并最终提高rhTRAIL的产量。
3. rhTRAIL的体外及体内药效学及机理研究在前面的研究中,我们通过对培养基的组成、高密度发酵条件的优化以及纯化工艺的摸索,在保证rhTRAIL蛋白品质的前提下提高了蛋白产量,获得了足够量的rhTRAIL蛋白纯品。
本章节我们进一步对获得的重组蛋白进行体外及体内药效学及机理研究。
由于重组TRAIL蛋白具有广谱抗肿瘤活性,因此我们将HCT-116、Colo-205、A549及MCF-7等12种肿瘤细胞作为体外药效活性研究对象,并且构建了人结肠癌HCT-116和Colo-205裸小鼠模型和非小细胞肺癌95D裸小鼠模型,采用单独用药、联合用药的方式进行了体内药效学研究；最后以A549细胞为实验对象,通过Annexin-PI双染和Western blot的实验手段研究了rhTRAIL蛋白的诱导细胞凋亡途径。
4. rhTRAIL在大鼠体内的药动学和组织分布研究在前述章节中,我们已经利用基因工程手段获得了具有生物学活性的rhTRAIL纯品；本章中,我们研究了大鼠静脉注射5、10和30mg/kg rhTRAIL后,血浆浓度经时变化曲线,并研究了大鼠静脉注射10mg/kg rhTRAIL后,各组织中的rhTRAIL分布情况。
结果显示在5-30mg/kg范围内,主要药物动力学参数AUC及Cmax与剂量呈线性相关,CL和V1在三个剂量组没有显著性差异(P>0.05),雌雄大鼠间各动力
学参数没有显著性差异,同时,大鼠静脉注射rhTRAIL后,其迅速分布到各组织。
肾脏为最主要的分布器官,其次为脾、血、卵巢、肝脏和肺,心、脑、脂肪、胃、肌肉、肠、胸腺和睾丸组织分布较低。
上述组织中rhTRAIL含量随着时间的延长迅速下降,未观察到蓄积现象。
结论肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL)属于肿瘤坏死因子家族,在体内以三聚体的形式可与不同受体结合后通过不同信号通路介导细胞凋亡。
相关研究证实TRAIL蛋白对多种人肿瘤细胞(如肺癌、肝癌、结肠癌、白血病细胞等)具有生长抑制和细胞毒效应。
国内外一些制药企业均对TRAIL开展了多项临床前和临床研究,但进入临床后的研究进展则较为缓慢,对其原因也未见明确报道。
本研究在构建了重组TRAIL蛋白的表达体系并通过工艺优化获得了高纯度的重组TRAIL蛋白后,对其体外、体内药效以及体内代谢、组织分布性质开展了相关研究。
研究结果显示重组TRAIL蛋白在体内体外对不同肿瘤细胞均具有一定的生长抑制作用,体内代谢组织分布结果显示其在体内主要分布于肾脏。
上述结果一方面提示重组TRAIL蛋白具有良好的成药性,另一方面可能由于TRAIL蛋白被肾小球快速滤过所致的半衰期较短,提示联合小分子用药或TRAIL 蛋白偶联小分子药物可能更适合于该分子作为治疗性蛋白药物的开发方向。
