细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒

Hoechst33342显微观察标记DNA产品介绍：Hoechst 33342是⼀种可透过细胞膜并对DNA染⾊的细胞核染⾊试剂，它在嵌⼊双链DNA后释放强烈的蓝⾊荧光。

Hoechst 33342常⽤于细胞凋亡检测，染⾊后⽤荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。

Hoechst染料是⼀类在显微观察中标记DNA的荧光染料。

因为这类荧光染料能标记DNA，所以它们也经常⽤于细胞核和线粒体的显像观察。

这类染料中两个相关的染料Hoechst 33258和Hoechst 33342经常使⽤。

这两种染料都在紫外光下350nm处被激发，都在461nm处最⼤发射光附近发射蓝/青⾊荧光。

Hoechst染料可以⽤于活细胞或者固定化细胞，并且经常⽤来代替其它核酸染料如DAPI。

这两种染料关键的不同点在于，与DAPI相⽐，Hoechst 33342加有⼄基，这使它具有更强的亲脂性，因此能更好的透过完整的细胞膜。

在⼀些实验中，Hoechst 33258的渗透性明显⽐Hoechst 33342要弱些。

这些染料也可以⽤来检测样品中的DNA含量，通过绘制发射光强度与DNA含量的标准曲线。

技术资料：1.Ex(nm)：3502.Em(nm)：4613.分⼦量：561.934.溶剂：DMSO5.分⼦式：C27H28N6O · 3HCl6.外观：黄绿⾊粉末染⾊程序：(1) ⽤PBS或合适的缓冲液制备10～50µM Hoechst33342染料。

(2) 将1/10细胞培养基体积的Hoechst染料溶液加⼊细胞培养物中(可以⽤1/10浓度的Hoechst染料缓冲液代替培养基)。

(3) 在37℃培养细胞10～20分钟。

(4) ⽤PBS或合适的缓冲液洗细胞两次。

(5) ⽤带有350nm激发波长，460nm发射波长的滤光⽚的荧光显微镜观察细胞。

储存条件：-20℃⼲燥避光保存，有效期⼀年。

注意事项：(1) Hoechst 33342对⼈体有⼀定刺激性，请注意适当防护。

TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(显色法)产品编号 产品名称包装 C1098TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(显色法)50次产品简介：碧云天生产的显色法TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。

对于待检测的细胞或组织样品，经过生物素标记和后续的DAB 显色等步骤，即可在普通光学显微镜下观察到凋亡细胞。

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA 内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA 。

细胞凋亡时抽提DNA 进行电泳检测，可以发现180-200bp 的DNA ladder 。

基因组DNA 断裂时，暴露的3'-OH 可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-dUTP)，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合，最后在HRP 的催化下通过DAB 显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞，这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。

本试剂盒有如下优点。

(1) 高灵敏度：背景染色极低，阳性染色强，可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA 断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。

(2) 特异性好：TUNEL 检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。

(3) 快速：仅需约2-3个小时即可完成。

(4) 应用范围广：可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。

(5) 实测效果好：参考图1。

图1. 本试剂盒的检测效果图。

A. HeLa 细胞未处理或用DNase I 室温孵育10分钟后的检测效果图。

诺唯赞凋亡检测试剂盒说明书
一、试剂盒组成
1.死亡标记染料溶液：包含荧光染料，用于检测凋亡细胞。

2.细胞固定溶液：用于固定细胞，使其能够固定在载片上。

3.染色溶液：用于染色凋亡细胞。

二、试剂盒原理
该试剂盒通过染色其中一种特殊染料标记凋亡细胞，然后观察染色结果来检测凋亡细胞的存在与否。

凋亡细胞会通过特殊的途径引发染色发生改变，从而与正常细胞区分开来。

三、操作流程
1.收集待检测的细胞样品。

2.将细胞样品加入离心管中，并用生理盐水洗涤。

3.将洗涤后的细胞用细胞固定溶液固定在载片上。

4.加入足够的死亡标记染料溶液，使标记染料完全覆盖住细胞。

5.在黑暗条件下，孵育细胞片10-15分钟。

6.按照说明书的要求，用生理盐水洗涤细胞片。

7.加入足够的染色溶液，使细胞完全浸泡在溶液中。

8.孵育细胞片15-30分钟，然后用水冲洗。

9.将载片装入显微镜，观察细胞的染色情况。

四、结果解读
1.正常活细胞：无染色或轻微染色。

2.凋亡细胞：明显染色，通常呈现为亮蓝色。

3.有核碎片的细胞：染色核碎片呈现为绿色。

五、注意事项
1.所有操作必须在无菌环境下进行，以避免污染。

2.使用前请检查试剂是否过期，过期试剂禁止使用。

3.操作过程中应注意个人防护措施，如佩戴手套、口罩等。

4.染料溶液接触皮肤或眼睛应及时用大量水冲洗。

5.操作过程中尽量避免暴露在光线中，因为光线可能影响染色结果。

凋亡小体/hoeschst染色试剂盒目录号：DN18目录编号包装单位DN1801 100次❖试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存100次固定液4℃50 ml100×染色浓缩液4℃避光0.5 ml染色稀释缓冲液4℃或者室温50 ml本产品收到后按照上面指示温度存放各成份，6个月内有效。

❖产品介绍：凋亡中晚期细胞形态学变化为染色质在局部区域凝集，固缩，继而核碎裂出现凋亡小体。

在Hoeschst染色下，细胞核或者凋亡小体的DNA会呈现致密浓染或者碎块状致密浓染。

本试剂盒Hoechst染料紫外光激发波长350-370 nm；发射波长465 nm，在荧光显微镜下DNA发出蓝色荧光。

❖注意事项：1.需可以观察蓝色荧光的荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。

2.需PBS或0.9%NaCl溶液，盖玻片与载玻片。

3.荧光容易淬灭，应该尽量避光操作和保存。

❖操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）1.贴壁细胞1)取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。

将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。

2)刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。

本试剂盒使用固定液主要为4％多聚甲醛，如果不适合您的细胞或者效果不佳，很多种固定配方如细胞固定液『甲醇：冰乙酸（3∶1 ）现配』，都可以使用，可以根据自己细胞特点选用适合的固定方法。

3)去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。

洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。

4)取5μl 100×染色浓缩液与0.5ml染色稀释缓冲液混合后加入染色5-10分钟，也宜用摇床，或手动晃动数次。

5)用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。

6)滴一滴封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。

本人收集的激光共聚焦常见荧光染料染色方法zuohy(2008-09-19 17:33:43)一、Hoechst 33258染色1、试剂盒组成固定液 50 mlHoechst 33258染色液 50 ml抗荧光淬灭封片液 5 ml说明书 1 份保存条件：4℃保存，Hoechst 33258染色液需4℃避光保存。

本试剂盒自订购之日起六个月内有效。

2、注意事项：需荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。

需PBS或0.9%NaCl溶液。

需盖玻片与载玻片。

荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品宜避光保存。

在使用抗淬灭封片液的情况下可以减缓淬灭，但仍宜尽量避光。

3、使用说明：1）贴壁细胞A. 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。

将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。

B. 刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。

C. 去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。

洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。

D. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。

也宜用摇床，或手动晃动数次。

E. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。

F. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。

使细胞接触封片液，切勿弄反。

G. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。

激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右，详细图谱请参考下图。

2）悬浮细胞A. 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。

B. 离心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。

洗涤期间手动晃动。

C. 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。

2008/11/09 09:55PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。

但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。

正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。

故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。

电子天平准确称取1mg 碘化丙啶（propidium iodide，PI）溶于10ml PBS（PH 7.2），成100ug/ml 的储备液，用前等量混合（注意避光）protocol:1、收集细胞，数量需1－2×10E6个（悬浮细胞直接吹起即可，对于贴壁细胞用胰酶消化时，最好用DMEM+胰酶消化,且消化过程中不要去移动瓶子，防止消化所形成的细胞团影响后面的染色及分析），离心，11,000rpm，5min。

2、用1ml 冰冷的PBS重悬后，离心：11,000rpm，5min。

3、用200μl冰冷的PBS重悬后，用加样器混匀后，缓慢的加入含有4ml冰冷的70％乙醇的10ml离心管中，边加边摇匀。

－20℃，过夜。

（或者置4℃，1h后进行下一步）4、1,500rpm，10min，小心弃上清后，用1ml冰冷的PBS重悬，1,500rpm，5min。

小心弃上清。

5、加入含有40μg/ml 的PI，100μg/ml的RNase的PBS溶液500μl，37℃，培养30min －1h。

混匀。

溶液配方：PBS 910μlPI 80μlRNase 10μl共1ml6、过滤，供流式检测。

Hoechst 33342/PI双染色法紫外光激发, Hoechst-PI双染在荧光显微镜下可见4 种细胞形态:活细胞(VN) ,染成蓝色,核呈正常结构;早期凋亡细胞(V A) ,染成蓝色,核呈固缩状或圆珠状;晚期凋亡细胞(NV A) ,也被染成红色,但可见明显的染色质凝集。

2008/11/09 09:55PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。

但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。

正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。

故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。

电子天平准确称取1mg 碘化丙啶（propidium iodide，PI）溶于10ml PBS（PH 7.2），成100ug/ml 的储备液，用前等量混合（注意避光）protocol:1、收集细胞，数量需1－2×10E6个（悬浮细胞直接吹起即可，对于贴壁细胞用胰酶消化时，最好用DMEM+胰酶消化,且消化过程中不要去移动瓶子，防止消化所形成的细胞团影响后面的染色及分析），离心，11,000rpm，5min。

2、用1ml 冰冷的PBS重悬后，离心：11,000rpm，5min。

3、用200μl冰冷的PBS重悬后，用加样器混匀后，缓慢的加入含有4ml冰冷的70％乙醇的10ml离心管中，边加边摇匀。

－20℃，过夜。

（或者置4℃，1h后进行下一步）4、1,500rpm，10min，小心弃上清后，用1ml冰冷的PBS重悬，1,500rpm，5min。

小心弃上清。

5、加入含有40μg/ml 的PI，100μg/ml的RNase的PBS溶液500μl，37℃，培养30min －1h。

混匀。

溶液配方：PBS 910μlPI 80μlRNase 10μl共1ml6、过滤，供流式检测。

Hoechst 33342/PI双染色法紫外光激发, Hoechst-PI双染在荧光显微镜下可见4 种细胞形态:活细胞(VN) ,染成蓝色,核呈正常结构;早期凋亡细胞(V A) ,染成蓝色,核呈固缩状或圆珠状;晚期凋亡细胞(NV A) ,也被染成红色,但可见明显的染色质凝集。

Hoechst33342/PI双染细胞凋亡检测试剂盒产品组成：产品编号BB-4131规格100 -200THoechst33342染色液A 1000ulPI染色液B 1000ul试剂C 10ml产品简介：贝博Hoechst33342/PI双染细胞凋亡检测试剂盒是采用DNA探针双染细胞核的方法检测细胞的状态。

Hoechst33342染色液A可以透过正常细胞膜，而细胞凋亡后，细胞膜对Hoechst33342染色液A的通透性增加，PI染色液B不能透过细胞膜，对正常细胞和凋亡细胞不能染色，而对坏死细胞可以染色。

用两种染色液对细胞进行双染后，使用流式细胞仪或荧光显微镜即可对细胞状态进行检测。

在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（A+/B+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（A++/B+），坏死细胞为低蓝色/高红色（A+/B++）。

使用方法：1、染色缓冲液的配制：根据样品数按下列比例配制染色缓冲液。

取100μL试剂C加900μL无菌去离子水稀释，混匀即成染色缓冲液。

2、收集样本细胞，细胞数量在10X105个以内。

3、用PBS洗涤细胞两次。

4、用500μL-1ml 染色缓冲液将细胞重悬。

5、加入5-10ul Hoechst33342染色液A。

6、加入5-10ul PI染色液B。

7、轻轻混匀后4℃避光孵育10-20分钟。

8、用PBS洗涤细胞。

9、用流式细胞仪或荧光显微镜检测结果。

HO33342用紫外光激发，PI用蓝光激发。

Hoechst33342-DNA复合物的最大激发波长为350nm，最大发射波长为460nm，PI-DNA复合物的最大激发和最大发射波长分别为488nm和615nm。

结果分析 ：正常细胞为低蓝色/低红色（A+/B+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（A++/B+），坏死细胞为低蓝色/高红色（A+/B++）。

形态学：正常细胞核形态呈圆形，淡蓝色，内有较深的蓝色颗粒；凋亡细胞的核呈亮蓝色，或核呈分叶状，碎片状。

凋亡小体/hoeschst染色试剂盒目录号：DN18目录编号包装单位DN1801 100次❖试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存100次固定液4℃50 ml100×染色浓缩液4℃避光0.5 ml染色稀释缓冲液4℃或者室温50 ml本产品收到后按照上面指示温度存放各成份，6个月内有效。

❖产品介绍：凋亡中晚期细胞形态学变化为染色质在局部区域凝集，固缩，继而核碎裂出现凋亡小体。

在Hoeschst染色下，细胞核或者凋亡小体的DNA会呈现致密浓染或者碎块状致密浓染。

本试剂盒Hoechst染料紫外光激发波长350-370 nm；发射波长465 nm，在荧光显微镜下DNA发出蓝色荧光。

❖注意事项：1.需可以观察蓝色荧光的荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。

2.需PBS或0.9%NaCl溶液，盖玻片与载玻片。

3.荧光容易淬灭，应该尽量避光操作和保存。

❖操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）1.贴壁细胞1)取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。

将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。

2)刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。

本试剂盒使用固定液主要为4％多聚甲醛，如果不适合您的细胞或者效果不佳，很多种固定配方如细胞固定液『甲醇：冰乙酸（3∶1 ）现配』，都可以使用，可以根据自己细胞特点选用适合的固定方法。

3)去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。

洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。

4)取5μl 100×染色浓缩液与0.5ml染色稀释缓冲液混合后加入染色5-10分钟，也宜用摇床，或手动晃动数次。

5)用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。

6)滴一滴封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。

SOP13广东药学院药科学院新药筛选与药效评价中心Standard Operation Protocol（SOP）●技术方法名称:Hoechst33258荧光染色观察药物诱导细胞凋亡●基本原理:Hoechst 33258，也称bisBenzimide H33258或HOE33258。

分子式为C25H24N6O·3HCl，分子量为533.88，CAS Number 23491-45-4。

Hoechst 33258溶于水，溶解度可达10mg/ml。

Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。

用于细胞核染色时，推荐的Hoechst 33258工作浓度为0.5-10μg/ml。

Hoechst 33258 为特异性DNA 染料，与 A-T 键结合，这种染料对死细胞或经 70% 冷乙醇固定的细胞可立即染色。

而活细胞的着色是渐进性的，在 10min 内可达饱和。

在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散均匀荧光，出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。

Hoechst 33258染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。

Hoechst 33258也常用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。

Hoechst 33258的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发波长为352nm，最大发射波长为461nm。

●试剂与器材1. Hoechst 33258 贮存液：称取 Hoechst 33258 试剂1mg ，用 20ml 蒸馏水溶解后，滤过，4℃ 避光保存。

用时蒸馏水 10 倍稀释成染色液。

2. 封片液（ pH5.5 ）： 20mmol/L 柠檬酸； 50mmol/L 磷酸氢二钠； 50% 甘油，3. 细胞固定液 4%多聚甲醛，现配。

操作步骤1. 将贴壁细胞以5×105 /ml或其他适宜的密度接种于用35mm培养皿或其他培养器具中，35mm培养皿每孔1.5- 2ml，37℃ 、 5%CO 2孵箱中培养至细胞贴壁，加入实验药物，继续培养过夜。

hoechst染色检测凋亡细胞原理染色检测凋亡细胞是通过特定的染色方法来检测细胞凋亡的过程和结果。

染色方法允许科学家观察细胞核的变化、DNA断裂和其他凋亡特征。

其中，Hoechst染色是一种常用的染色方法之一。

Hoechst染色是一种荧光染色方法，最早由德国药厂Hoechst AG开发，主要用于核酸染色。

该染料可以结合DNA的碱基，从而在显微镜下使细胞核呈现出蓝紫色的荧光。

Hoechst染料通常与其他染料如荧光素化细胞质染料相结合，以区分细胞核和胞质。

当细胞发生凋亡时，其核酸会发生断裂和降解，导致DNA的碱基暴露在细胞核中。

Hoechst染料能够结合这些裸露的碱基，从而使细胞核染色。

由于凋亡细胞的DNA碎片化，Hoechst染色下不同于正常细胞。

一般来说，使用Hoechst染色检测细胞凋亡需要以下步骤：1.培养细胞：首先，需要培养细胞，使其达到适当的生长状态。

细胞可以来源于不同的组织或细胞系，如肿瘤细胞系或原代细胞。

2.染色处理：将Hoechst染料加入培养基中，让细胞与染料接触。

通常情况下，需根据实验要求和细胞类型确定染料的浓度和处理时间。

3.孵育和洗涤：将含有Hoechst染料的培养基孵育在适当的条件下，如37°C的恒温培养箱中。

经过染色后，需要洗涤细胞以去除未结合的染料。

4.显微镜观察：最后，将细胞放在玻片上，用显微镜观察细胞核的染色情况。

Hoechst染料在显微镜下通常呈现出蓝紫色荧光，而正常细胞核呈现规则的形状和结构。

而凋亡细胞的染色较弥散，且核内会观察到碎片化的DNA。

Hoechst染色法可以将正常细胞和凋亡细胞区分开来，并且可以观察到凋亡细胞的具体形态变化。

凋亡细胞的观察有助于研究细胞凋亡的机制以及其在生物学中的重要角色。

凋亡是一种由众多信号分子和通路调节的主动性细胞死亡过程。

它在多种生理和病理情况下发挥重要作用，如细胞发育、免疫应答和肿瘤发生。

凋亡细胞的特征包括细胞核的形态改变、DNA断裂和核酸降解。

In situ cell death detection kit-POD法一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。

其原理是脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）把荧光素（fluorescein）标记的dUTP（三磷酸脱氧尿甘）连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，HRP又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。

本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。

还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。

细胞凋亡实验步骤及注意事项一、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法二、实验原理细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。

凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。

它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。

细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。

在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。

在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。

在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。

核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。

如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。

相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。

细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。

一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。

三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。

研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。

本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。

H o e c h s t染色的讨论H o e c h s t染色的具体步骤caspase8428：我看到资料上说，荧光染色的时候可以用DAB与荧光物质反应生成沉淀。

那么，Hoechst染色时，什么时候加DAB，浓度是多少，用什么稀释，最后怎么来终止反应？是不是还要用抗退色固片介质来封片？sunandsuny：Hoechst染色时无需用DAB来显色，它直接结合细胞的DNA ，经过紫外光激发后发出蓝色荧光。

如果你是用来染培养的细胞的话，可以参考下面的步骤（切片雷同）：细胞涂片：甲醇：冰乙酸（3：1）固定15分钟，PBS洗一次，加Hoechest 33258荧光染料37℃孵育15~30分钟，于荧光显微镜下观察。

凋亡细胞由于染色质固缩，细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。

操作比较容易的。

altbenair:想做肝癌细胞hepG2。

看过很多帖子还有文献上的方法，但是都不太具体大都是这样：固定（福尔马林4%），pbs洗三遍，加hoechst孵育1H，将细胞悬液滴于载玻片上荧光显微镜检测。

细胞悬液怎么做？我要做贴壁细胞用胰酶消化？drake015: .1．贴壁细胞，让细胞自己在盖玻片上爬片。

操作如下：A. 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养PBS 或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。

将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。

B. 刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。

C. 去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。

洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。

D. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。

也宜用摇床，或手动晃动数次。

E. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。

F. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。

细胞凋亡-Hoechst 染色试剂盒简介：细胞凋亡-Hoechst 染色试剂盒(Hoechst Staining Kit)是一种采用经典的Hoechst33258进行细胞凋亡检测的快速简便的试剂盒。

当细胞发生凋亡时，染色质会固缩，Hoechst33258染色后在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白。

Hoechst Staining Kit 经常用于培养的贴壁或悬浮细胞以及组织切片的细胞凋亡检测。

该试剂盒检测细胞含量范围一般为0.1～1×106之间。

组成：操作步骤(仅供参考)：(一)贴壁细胞1、取洁净盖玻片在70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用无菌的PBS 或生理盐水洗涤3次，再用细胞培养液洗涤1次。

2、加入干预条件使细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入Hoechst 固定液0.5ml 。

3、去除固定液，用PBS 或生理盐水洗，吸尽液体。

洗涤时宜用摇床，或手动晃动。

4、加入Hoechst 33258染色液0.5ml 孵育。

也宜用摇床，或手动晃动数次。

5、弃染色液，用PBS 或生理盐水洗，吸尽液体。

洗涤时宜用摇床，或手动晃动。

6、滴一滴抗荧封片剂于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片剂，尽量避免气泡。

7、荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。

激发波长350nm 左右，发射波长460nm 左右。

(二)悬浮细胞1、离心收集细胞样品于1.5ml 离心管内并弃液，加入Hoechst 固定液0.5ml ，缓缓悬起细胞固定。

2、低速离心去除固定液，用PBS 或生理盐水洗。

洗涤时手动晃动数次。

3、低速离心离心后吸去大部分液体保留约50μl 液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上， 编号 名称 DA0032 100T Storage 试剂(A): Hoechst 固定液 50ml RT 试剂(B): Hoechst 染色液 50ml -20℃ 避光 试剂(C): 荧光封片剂 5ml 4℃ 避光 使用说明书 1份尽量使细胞分布均匀。

PH0532|Hoechst33342/PI双染试剂盒（Hoechst33342/PI Detection Kit）货号：PH0532规格：100T存储：4℃保存，有效期一年试剂组成规格保存Heochst33342染液 1.0mL4℃，避光Propidium Iodide（PI）500μL4℃，避光10×Buffer A10mL4℃注：Buffer A工作液配制用：双蒸水将10×Buffer A稀释10倍。

◆产品简介荧光染料Hoechst33342能少许进入正常细胞膜，使其染上低蓝色，而凋亡细胞的膜通透性增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst33342比正常细胞的多，荧光强度要比正常细胞中要高，此外，凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合，并且凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等都使凋亡细胞的蓝色荧光增强。

而PI染料是不能进入细胞膜完整的正常细胞和凋亡细胞中，即活细胞对PI染料拒染，而坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被PI染料染色。

根据这些特性，用Hoechst33342结合PI染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。

在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst33342++/PI+），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst33342+/PI++）。

◆注意事项【试剂盒以外需自备仪器和试剂】荧光显微镜或流式细胞仪、低速离心机、微量移液器、1.5mL Microtube、载玻片、盖玻片1、在红色荧光对兰色荧光散点图上，还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹，可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。

2、用Heochst33342染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20min之内为宜。

Hoechst33342染色液（10ug/mL即用型）使用说明货号：C0030规格：10ml/50ml保存：-20℃避光保存，一年有效。

产品简介：Hoechst33342，也称bisBenzimide H33342或HOE33342，是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。

Hoechst33342染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。

Hoechst 33342也常用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。

Hoechst33342的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst33342和双链DNA结合后，最大激发波长为350nm，最大发射波长为461nm。

本Hoechst33342染色液为即用型，可直接用于固定细胞或组织的细胞核染色，也可直接用于活细胞或组织的细胞核染色。

使用说明：1.对于固定的细胞或组织：a.对于细胞或组织样品，固定后，适当洗涤去除固定剂。

随后如果需要进行免疫荧光染色，则先进行免疫荧光染色，染色完毕后再按后续步骤进行Hoechst33342染色。

如果不需要进行其它染色，则直接进行后续的Hoechst 33342染色。

b.对于贴壁细胞或组织切片，加入少量Hoechst33342染色液，覆盖住样品即可；对于悬浮细胞，至少加入待染色样品3倍体积的染色液，混匀。

室温放置3-5分钟。

c.吸除Hoechst33342染色液，用TBST、PBS或生理盐水洗涤2-3次，每次3-5分钟。

d.直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光显微镜下观察。

细胞发生凋亡时，会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。

2.对于活细胞或组织：a.加入适当量Hoechst33342染色液，必须充分覆盖住待染色的样品，通常对于六孔板一个孔需加入1ml 染色液，对于96孔板一个孔需加入100微升染色液。

b.在适宜于细胞培养的温度下培养20-30分钟。

弃染色液，用PBS或培养液洗涤2-3次即可进行荧光检测。

SOP13广东药学院药科学院新药筛选与药效评价中心Standard Operation Protocol（SOP）●技术方法名称:Hoechst33258荧光染色观察药物诱导细胞凋亡●基本原理:Hoechst 33258，也称bisBenzimide H33258或HOE33258。

分子式为C25H24N6O·3HCl，分子量为533.88，CAS Number 23491-45-4。

Hoechst 33258溶于水，溶解度可达10mg/ml。

Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。

用于细胞核染色时，推荐的Hoechst 33258工作浓度为0.5-10μg/ml。

Hoechst 33258 为特异性DNA 染料，与 A-T 键结合，这种染料对死细胞或经 70% 冷乙醇固定的细胞可立即染色。

而活细胞的着色是渐进性的，在 10min 内可达饱和。

在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散均匀荧光，出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。

Hoechst 33258染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。

Hoechst 33258也常用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。

Hoechst 33258的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发波长为352nm，最大发射波长为461nm。

●试剂与器材1. Hoechst 33258 贮存液：称取 Hoechst 33258 试剂1mg ，用 20ml 蒸馏水溶解后，滤过，4℃ 避光保存。

用时蒸馏水 10 倍稀释成染色液。

2. 封片液（ pH5.5 ）： 20mmol/L 柠檬酸； 50mmol/L 磷酸氢二钠； 50% 甘油，3. 细胞固定液 4%多聚甲醛，现配。

操作步骤1. 将贴壁细胞以5×105 /ml或其他适宜的密度接种于用35mm培养皿或其他培养器具中，35mm培养皿每孔1.5- 2ml，37℃ 、 5%CO 2孵箱中培养至细胞贴壁，加入实验药物，继续培养过夜。

TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤一、试剂盒内容2.终止缓冲液：用于停止DNA链的合成反应，防止假阳性结果的产生。

3.蛋白酶K：用于溶解细胞质膜和核膜，使DNA暴露出来。

4.异硫氰酸荧光素（FITC）标记转移酶：用于检测dUTP与DNA标记的连接。

5.正控组织切片或细胞悬液：用于检验试剂盒的敏感性和特异性。

二、操作步骤1.细胞处理将要测试的细胞分成实验组和对照组，分别处理。

实验组是要测试凋亡的细胞，对照组是不会凋亡的细胞。

2.固定细胞用4%的乙醛或无氧乙醛等适当浓度的固定液固定细胞。

涂片上的细胞需要进行细胞穿孔，可以使用0.1%的Triton X-100进行细胞穿孔。

3.蛋白酶K消化将蛋白酶K溶解在PBS缓冲液中，加入溶液中胶原酶和蛋白酶蚀解，接着加入盛有细胞的离心管中。

将离心管放入37℃恒温水浴中，反应20-30分钟。

4.清洗细胞用PBS缓冲液洗涤细胞3次。

每次用PBS缓冲液冲洗细胞5分钟。

5.脱水将细胞离心，抽去PBS缓冲液，然后使用3%的过氧化氢来进行脱水。

6.TUNEL染色将细胞加入等量的TUNEL试剂液，轻轻混合后，将离心管放入37℃恒温水浴中，反应30-60分钟。

7.洗涤细胞用PBS缓冲液洗涤细胞3次。

每次用PBS缓冲液冲洗细胞5分钟。

8.反应终止使用终止缓冲液反应终止DNA链合成反应，将离心管放入室温中静置10分钟。

9.洗涤细胞用PBS缓冲液洗涤细胞3次。

每次用PBS缓冲液冲洗细胞5分钟。

10.展片与观察将细胞滴在载玻片上，并加入封片缓冲液。

在载玻片上覆盖盖玻片，用显微镜观察。

通过上述步骤，可以使用TUNEL细胞凋亡试剂盒对细胞进行凋亡分析。

该试剂盒可根据DNA末端的3'-OH羟基与终止缓冲液中标记的dUTP之间的连接，用显微镜观察细胞内是否存在凋亡现象。

荧光标记的dUTP可通过荧光显微镜直接观察，而酶标记的dUTP则需要加入相应的底物，通过酶的催化反应后可通过光学密度法或荧光显微镜来定量测定。