下载文档原格式
厚、薄血膜法查疟原虫基本原理：疟原虫寄生于红细胞，经制片、染色后，显微镜下可以鉴别疟原虫的虫种和虫期。
试剂器材：75%酒精棉球、采血针、载玻片、甲醇、pH7.0~7.2 PBS缓冲液、姬氏染液（或瑞氏染液）、显微镜等。
操作方法：(1)采血：①采血时间在普查时，一般无法考虑采血时间。
在临床上，对现症病人一般可随时采血，但为了提高检出率，就应当考虑采血的适当时间。
对典型发作的间日疟及三日疟患者，应选择发作后数小时至10余小时采血为好。
此时疟原虫发育至环状体乃至大滋养体，虫体大，疟色素已形成，受染红细胞也出现变化，有利于疟原虫的检出。
恶性疟原虫大滋养体和裂殖体是在皮下、脂肪和内脏微血管中发育的，通常在外周血液中不易查到，配子体在环状体出现1周后方能见于外周血液，故在发作时采血。
②采血部位从患者耳垂或指尖（以左手无名指为宜）取血，婴儿通常从大姆趾第二趾骨腹面针刺采血。
③采血方法用75%乙醇棉球消毒取血部位皮肤，待干后用左手拇指和食指捏住采血部位，右手持针迅速刺入皮肤，待血液流出或轻轻挤出血滴，供制作涂片用，采血完毕用干棉球轻压伤口止血。
(2)制片：①薄血膜的制作取1滴血于1张洁净的载玻片上，选1张边缘平整、光滑的载玻片作推片，用左手拇指和中指夹持其两端，将推片的边缘中点与血滴接触，并与载玻片呈30o~45o夹角，待血滴沿推片边缘向两侧展开后，立即由右向左迅速推成薄血膜。
理想的薄血膜要求红细胞均匀地铺成一层，无裂痕，其末端凸出呈舌尖形。
注意：推片时用力和速度要均匀，不能中途停顿或重复推片，以免造成血膜断裂或厚薄不匀。
如取血量多，夹角宜小；取血量小，则夹角可大些。
②厚血膜的制作用推片的一角接触刺血点上的血滴，取血2滴，置载玻片上，并从里向外作旋转涂布，使成直径为0.8cm大小的圆形血膜，厚薄要均匀，然后平置桌上，待自然干燥。
③厚薄血膜同片制作用目测法将载玻片从右到左等分成6格，厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部，第1、2格可用于贴标签，制作厚、薄血膜方法同上。
疟原虫检验技术梁平县疾病预防控制中心何曦血涂片检查疟原虫是诊断和鉴定疟原虫种别的主要方法，也是疟疾流行病学调查的重要部分，血涂片制作和染色的好坏足心影响检查的结果，必须把握好“三关”，即制片、染色和镜检。
一、玻片清洁玻片清洁。
清洁的玻片无油脂，无划痕，无灰尘，玻片上有油迹，使厚血膜容易脱落，薄血膜涂布不均匀。
在用手指持玻片时，只能夹持玻片的两侧边缘，不要接触玻片的表面，以避免手指上的油污染污玻片。
1.新的载玻片先用热肥皂水洗涤，再用清水冲洗，然后用软而洁净的毛巾擦干待用。
2.使用过的载玻片的清洁方法有两种：①5%的肥皂水煮沸法：将洗衣肥皂削成小片，加水配成约5%的肥皂水，煮沸后将玻片一张一张地平放进肥皂水内，微火煮约一刻钟，然后灭火待肥皂水稍冷后，用清洁干毛巾擦净后待用。
②清洁液浸泡法：清洁液配制如下：重铬酸钾 80g浓硫酸 100ml水(清净水)1000ml配制时须先将重铬酸钾研细放入水中，慢慢加温到全部溶解为止，然后缓缓加入浓硫酸，待溶液冷却后倒入有盖的大口玻璃缸内。
清洁玻片时，将待洗的玻片逐张放入清洁中浸泡一两天后，取出清水冲洗至完全没有黄色为止。
浸泡前最好用二甲笨除去镜油，清洁液颜色变为墨绿色后即失去清洁作用，不能再用。
二、制片1.薄血膜涂制：(1)先用75%酒精棉球将耳垂消毒，待酒精干后用采血针迅速刺入耳垂近下端边缘处。
(2)用左手的拇指与食指以及右手的中指向相对的方向将耳垂轻轻挤压出血。
(3)取一张洁净的载玻片，将它的左1/3的表面接触耳垂上的血滴（不要将玻片接触耳垂上的皮肤），使一小滴血在玻片上。
血量1-1.5mm3 .1/4.火柴头大小。
(4)将推片臵于血溶之前与血液相接触，待血液沿推片边缘展开后，将推片与载玻片保持30角度，用力均匀迅速将推片由右向左推出而制成薄血膜。
涂制得较好的薄血膜只有一层血球，血球的分布排列比较均匀，血膜的末端突出如舌状。
若取的血滴太大，则涂制的血膜太宽太厚；若推时用力不均匀，则易成梯田状，若用力太大，则血膜两端过厚，若涂片上有油污，则血膜成多孔状。
检查疟原虫的血涂片制作与染色基本原理：疟原虫寄生在红细胞内，经染色后可对疟原虫形态做出鉴定。
材料准备：75%酒精、采血针、推片、载玻片、吉氏染液、甲醇、滴管、刻度管.(1)清洁载玻片的方法：将载玻片用清水清洗干净后晾干，再在稀释清洁液中浸泡1~2天，取出后用水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗，烘干，经95%酒精浸泡后，擦干。
清洗过的玻片用干净无油的纸包好备用。
(2)吉氏染液配制：○1原液配制，吉氏染剂粉1g，甲醇50ml，中性甘油50ml。
将吉氏染粉置乳钵中，加少量甘油充分研磨（30min以上），继续边加甘油边研磨，至加完为止。
然后转入烧瓶内，置55~60恒温水浴中，充分震摇使溶解（约2h）,冷却后加入甲醇，储于棕色瓶中，塞紧瓶塞，充分摇匀，1~3周后过滤，即为原液，配制时要研磨充分，不可混入水，配好后要密封，放置越久染色性能越好；○2工作液临时配制：将吉氏原液用pH 6.8~7.2的PBS作1:15~1:20稀释混匀即可。
操作方法：采用疟原虫感染小鼠做血涂片并染色.(但以下采血以人为例)（1）采血:1时间据各种疟原虫在人外周血中出现的规律，间日虐和三日疟患者可在发作后任何时间取血，但以发作后10h 以内最佳，恶性疟原应在发作开始后不久做血检，患者刚开始发作时原虫密度较低可能检测不到，所以应在第二次发作时再做一次以免漏诊：2部位成人可在耳垂或指尖，婴儿宜在脚跟或者大拇指：3方法先用75%酒精给皮肤消毒，右手持一次性无菌采血针迅速刺入皮肤2mm，轻轻挤压周围皮肤，弃去第一滴血，再取1滴作薄血膜，2滴作厚血膜。
薄血膜取血量少，涂面大，原虫分散，但形态清晰，易作虫种鉴别：厚血膜血量多，RBC集中，在原虫数量较少时便于发现，但因制作时细胞相互挤压堆积，原虫形态难认。
（2）涂片：1薄血膜制作取1滴置于洁净载玻片上，用1张磨口边缘作推片。
推片时用力要均匀，一次推成，保证血膜应呈舌形，RBC分布均匀。
2厚血膜制作用推片一角取血2滴，治愈薄血膜片右方用推片角由里向外顺一个方向旋转，使血滴形成直径约1cm的圆形血膜。
疟原虫检测血涂片镜检法1 范围本标准规定了血涂片镜检法检测疟原虫的技术规范。
本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对疟原虫的显微镜检测。
2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
2.1疟原虫Plasmodium spp疟原虫是一类单细胞、寄生性的真核动物，是疟疾（malaria）的病原体。
寄生于人体的疟原虫主要有恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）、间日疟原虫（Plasmodium vivax）、三日疟原虫（Plasmodium malariae）和卵形疟原虫（Plasmodium ovale）等。
2.2血涂片 blood films将血液涂制于载玻片上制成的涂片。
供显微镜疟原虫检查用的血涂片包括厚血膜涂片和薄血膜涂片两种。
3 仪器和器材3.1 生物显微镜（100×油浸物镜、5×或10×目镜）。
3.2 计数器。
3.3 载玻片（无划痕无油污的洁净载玻片）。
3.4 推片。
3.5 血片染色架。
3.6 血片干燥架。
3.7 玻片盒。
3.8 染色盘和染色缸。
4 试剂和材料4.1 吉氏染色原液。
4.2 pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）。
4.3 甲醇（分析纯）。
4.4 香柏油或专用浸油（折射率≥1.5）。
4.5 二甲苯（分析纯）。
4.6 75%酒精。
4.7 一次性采血针。
4.8 一次性手套。
5 检测步骤5.1 血涂片的制作5.1.1 采血部位及取血方法经75%乙醇消毒采血部位，待干后，用一次性采血针在耳垂或指端扎刺取血，婴儿可从拇趾或足跟扎刺取血。
取1张已消毒推片，用拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片左下角刮取血液4μL～5μL用于制作厚血膜，再用该端中部刮取血液1μL～1.5μL用于制作薄血膜。
5.1.2 厚血膜制作取1张载玻片，将推片左下角的血滴涂于载玻片的中央偏左，由里向外划圈涂成直径0.8cm～1.0cm 的圆形厚血膜,厚度以1个油镜视野内可见到5个～10个白细胞为宜。
疟原虫检验技术一、疟原虫的生物学特征疟原虫是一类单细胞真核生物，寄生在人类和其他脊椎动物的红细胞内。
常见的疟原虫种类包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫等。
疟原虫的生活史包括在人体内的无性生殖和在蚊体内的有性生殖两个阶段。
在人体内，疟原虫经历了肝细胞内的红外期和红细胞内的红内期发育过程。
了解疟原虫的生物学特征对于选择合适的检验方法具有重要意义。
二、疟原虫检验技术的分类1、显微镜检查法这是疟原虫检验的经典方法，包括薄血膜涂片和厚血膜涂片检查。
薄血膜涂片用于疟原虫形态学观察，可鉴定疟原虫的种类；厚血膜涂片则提高了疟原虫的检出率。
在显微镜下，观察疟原虫的形态、大小、细胞核和细胞质的特点，以及疟色素的分布等，从而确定是否感染疟原虫以及感染的种类。
2、免疫学检测法（1）抗原检测利用免疫层析技术检测患者血液中的疟原虫抗原。
这种方法操作简便、快速，适用于现场检测和大规模筛查。
（2）抗体检测检测患者血清中的特异性抗体。
但由于抗体在感染后一段时间才会产生，且抗体检测不能区分现症感染和既往感染，因此在疟疾诊断中的应用相对有限。
3、分子生物学检测法（1）PCR 技术通过扩增疟原虫特定的基因片段来检测疟原虫。
具有高度的敏感性和特异性，能够检测到极低浓度的疟原虫核酸。
（2）核酸杂交技术利用标记的核酸探针与疟原虫核酸进行杂交，从而检测疟原虫。
4、其他检测方法（1）血常规检查疟疾患者可能会出现贫血、白细胞减少等血常规异常。
（2）血生化检查部分疟疾患者可能会有肝肾功能损害，通过血生化检查可以了解相关情况。
三、显微镜检查法的操作步骤1、采血通常采集患者的末梢血或静脉血。
2、制作血涂片薄血膜涂片：将一滴血液滴在载玻片的一端，用推片以 30°－45°角均匀地推成薄而均匀的血膜。
厚血膜涂片：取较多的血液滴在载玻片上，用推片制成较厚的血膜。
3、固定和染色薄血膜涂片自然干燥后，用甲醇固定，然后用吉姆萨染液或瑞氏染液染色。
姬姆萨染色法过程
姬姆萨（Giemsa）染色法简称姬氏染色，是用天青色素、伊红、次甲蓝混合而成的姬姆萨染料对血液、疟原虫、立克次体、骨髓细胞、脊髓细胞等标本进行染色的方法。
姬姆萨染色是病理学以及疾病研究中常用的染色剂，染色原理和结果与瑞氏染色法基本相同，但该法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更清晰，而细胞质和中性颗粒则着色较差。
姬姆萨染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。
样本处理：组织样本块经10%中性福尔马林溶液固定后，制备成石蜡组织切片，然后进行脱蜡、水化处理；贴壁细胞样本，让其在盖玻片上爬行生长，然后使用甲醇在室温下固定；悬浮细胞样本，离心收集细胞，涂片后用甲醇室温下固定。
姬姆萨染色：滴加Giemsa染色工作液，37℃染色20~30分钟；蒸馏水轻轻洗去染液，在室温条件下充分干燥。
然后在二甲苯中浸泡5分钟，去除杂质，待载玻片透明后，用中性树胶封片。
结果观察：在普通光学显微镜下观察细胞形态。
