慢病毒包装操作方案

慢病毒包装、滴度测定方案流程一、背景：四质粒的包装体系1.含有目的基因的转染质粒2.VSV-G：pMD2.G（包膜质粒）3.Rev：pRSV-Rev4.Gag/Pol：pMDLg/pRRE二、包装细胞：293T293T细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。

该细胞贴壁松散，操作时请尽量轻柔；换液时需预热培养基。

培养条件：DMEM ＋10% FBS＋1% P/S三、主要试剂1.93T培养基：高糖DMEM（含丙酮酸钠、谷氨酰胺）+ 10% FBS + GlutaMAX2.病毒收获培养基：取50 ml 293T培养基，加入0.5 g BSA（Sigma A9418）和终浓度为10-15 mM的HEPES，0.22 µm过滤。

3.无内毒素质粒抽提试剂盒4.Polybrene (10 mg/ml)：促转染试剂，提高转染效率。

四、包装步骤1.Day1:汇合度90%的10cm dishs HEK293T细胞（~ 6×107/dish）按1：1比例传代至15cm dishs，第二天细胞汇合度达到90%-95%（~1.5×108/dish），培养基为Gibico高糖DMEM培养基（含10%FBS）。

2.Day2:1)转染前2-3个小时更换培养基（含10%FBS)；2)按照以下比例配制转染试剂：Mix 1体积μlMix 2量DMEM（无FBS）1000μlDMEM（无FBS）1000μl目的基因质粒25μgVGF190μl（1μg/μl）PMD2G7.5μgPSPAX215μgMix 1和Mix 2分别混合后，室温5-10min, 后将Mix 1和Mix 2混合，室温30min，加入至15cm dish中。

（细胞达到汇合度90%，细胞过少会影响转染效率）。

3.Day36h-24h内更换新鲜培养基（含10%FBS），观察转染效率并拍照。

慢病毒（过表达）包装步骤秦超1.转染复苏293T细胞,传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。

转染步骤：（以10cm培养皿为例）⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%—90%，保证细胞处于良好的状态,转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。

⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti—mem，混匀⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti—mem，混匀，室温静置5min⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。

2.收毒(36—48h)收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可.⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min,以沉淀细胞碎片。

⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管(用蛋白质浓缩管即可）中。

4000rpm离心至所需体积。

⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液,按每次的接毒量分装，-80℃冻存。

由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。

3.接毒接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40％—50%，务必使用生长状态良好的细胞。

将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml细胞密度60%—70%时可以再接毒一次。

4.检测及培养细胞系（48h)如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。

如需培养成细胞系,可继续培养。

如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。

慢病毒包装实验技术方法1、实验试剂DMEM、超牛血清、G418、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、Lipofectamine TM 20002、实验仪器细胞培养板，37℃细胞培养箱，离心机，Amicon Ultra-15离心过滤器3、293FT细胞的培养用于包装病毒的293FT细胞必须处于生长旺盛期，细胞状态良好，细胞边缘清晰，传代次数较低。

293FT细胞培养：使用含10%超级新生牛血清的DMEM高糖培养基（并添加0.1mM的非必需氨基酸，2mM的L-谷氨酰胺，2mM的丙酮酸钠，500µg/ml的G418和1%的青霉素或链霉素），置于37℃、5% CO2 细胞培养箱中常规培养，保证细胞生长状态良好。

4、转染质粒细胞铺板：用含有10%FBS的无抗生素DMEM将生长旺盛的293FT细胞以一定密度铺到培养板中，使次日密融合度达到60%左右。

分别用脂质体作为转染试剂实现包装质粒和核心质粒的共转，PAX 2、pMD和核心穿梭质粒以3：1：4的比例用Lipofectamine TM 2000共转293 FT细胞。

转染6h后，移去细胞培养液，更换为新鲜的DMEM 培养基。

转染后24 h和48h分别于倒置荧光显微镜下观察转染效率并拍照，效率应达到85%以上。

5、收集病毒转染48小时后收集含慢病毒的上清液于无菌的离心管中，3000 rpm，4 ℃离心10 min，取离心后的上清分装到新的无菌的离心管中，-80℃冰箱保存。

将包装病毒的细胞培养板中加上新鲜的培养基，72h 后再次收获慢病毒上清液并离心处理后于-80℃保存。

6、慢病毒滴度测定慢病毒滴度测定：滴度测定前1天接种HeLa细胞，12孔板中细胞密度为2×105个细胞/孔，含10% FBS的DMEM为1ml/孔，第2天将500µl病毒液及含10% FBS的DMEM 500µl加入到1.5ml的离心管中混匀，并将其加入到预先种好的细胞中，37℃、5%CO2培养箱培养，48h后用流式细胞仪检测阳性率。

慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培养试剂试剂名称终浓度试剂品牌胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mM Invitrogen2 慢病毒包装试剂PEG6000溶液50%Wako3 耗材●50 mL离心管●15 mL离心管●10 cm细胞培养皿●0.45μm过滤器● 2 mL EP管二、操作流程1细胞培养1.1293T/293FT细胞的复苏1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。

在超净台内，用吸管吸取6~7mL完全培养液至15 mL离心管中；2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C 水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化；3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用）。

4)在室温条件下，250 g离心4分钟。

5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。

（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培养容器。

）6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。

1.2293T/293FT细胞传代1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。

将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。

在显微镜下观察，可看到大部分细胞变圆不贴壁，拍打培养瓶两侧会有大量细胞脱离，此时应立即终止消化，若细胞仍然有大部分贴壁，可适当延长孵育时间；3)加入等体积完全培养液终止消化，并用吸管吹打培养瓶底2-3次使所有细胞彻底脱壁。

慢病毒包装实验的要点：1：良好的293FT细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过30代；2：细胞铺板需均匀，避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多；3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮。

尽量少的细胞死亡，产生的病毒就越多；实验前要准备的试剂、耗材和仪器；试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培养基,0.25%胰酶，PBS,TRL 转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基。

耗材准备：10cm细胞培养皿，6孔细胞培养板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1.5ml，0.22um PVDF滤膜和10ml无菌注射器，试管架。

仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。

第一天：上午（病毒包装质粒共转染前，293FT细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT 细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）；实验前准备：安全柜开紫外灯照30分钟；把培养基和试剂放置常温；消化细胞：从37 5%的co2细胞培养箱拿出细胞状态良好的293FT细胞，吸出原培养基，加入PBS 1ml略洗之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液，加入10ml PBS吹打混匀后，离心1000r /5min, 吸出上清液。

细胞铺板：在10cm细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2.5×106个293FT细胞吸入15ml离心管，再加入完全培养基至10ml充分混匀，然后把混匀的293FT细胞移入10cm培养皿）。

放置培养箱中培养48h。

插入铺板后图片刚铺板后铺板1天后第三天：上午细胞转染：细胞铺板48h后，从培养箱取出293FT细胞，倒置显微镜观察，细胞密度达90%左右；吸出原有培养基，沿皿壁缓慢加入8ml完全培养基，放置于培养箱中，待转染。

慢病毒包装步骤慢病毒包装步骤慢病毒包装简要步骤：以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1×106个293T细胞。

1、取1.5ml灭菌EP管，加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清培养基。

轻柔混匀，室温孵育5min。

3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。

室温孵育20min4、用胰酶消化并记数293T细胞。

用含血清的培养基重悬细胞。

5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。

6、将1ml重悬的293T细胞（1×106个细胞/ml）加入到平板中。

37℃CO2孵箱中孵育过夜。

7、转染后48-72h收获含病毒的上清。

3000 rpm 离心20min，去除沉淀。

8、病毒上清-80°C贮存。

包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。

注意事项1.在慢病毒感染细胞前，为检测病毒上清培养液内病毒的活性，并确定病毒与转染细胞之间的比率，需要确定病毒2. 在慢病毒转染细胞的过程中最重要的一步是融合，只有一些较小的慢病毒载体才能转导进细胞，因此，病毒颗粒的吸附是慢病毒转染的限速步骤。

质粒转染的步骤1、DNA的量：Lipofectamine 2000=1：2~32、细胞密度大约占培养板的80%左右，转染。

3、转染期间不要加抗生素，否则会导致细胞死亡。

步骤如下：以24孔培养板为例1、转染前一天细胞换新的培养基2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀；b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；c、将a+b的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成；3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。

慢病毒包装标准操作细则1. 目的：规范慢病毒包装标准操作程序2. 范围：适用于慢病毒包装操作工序3. 操作程序3.1器材准备无菌10ml玻璃吸管、电动移液枪、，移液枪（量程1000μL）、10cm培养皿、各种枪头，1.5mL EP管、试管架，酒精灯、振荡混匀仪、荧光显微镜、CO2培养箱、生物安全柜3.2溶液准备1640培养基，Opti-MEM，Lipo转染试剂，293T细胞，重组慢病毒穿梭质粒，重组慢病毒骨架质粒(H1，H2)。

3.3操作步骤3.3.1转染前一天，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为6x 106细胞，重新接种于10 cm细胞培养皿，37 ℃、5% CO2培养箱内培养。

24 h待细胞密度达～80%时即可用于转染。

细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。

3.3.2第二天转染前用电动移液器将细胞培养基更换为无血清的1640培养基或是opti-MEM培养基。

3.3.3准备两个灭菌EP管，依次向一灭菌的EP管中加入10ug目的载体质粒，12ug pHelper 1.0质粒， 10ug pHelper 2.0质粒、相应体积的Opti-MEM培养基，总体积调整为500ul，轻轻混匀。

3.3.4在另一灭菌EP管中，加入460ul的Opti-MEM培养基和40ul Lipo转染试剂轻轻混匀，室温孵育5分钟。

3.3.5把两管含有载体的溶液与转染试剂的溶液进行混合，轻轻颠倒混匀，总体积为1ml，室温孵育20分钟。

将混合液滴加入细胞培养皿中，37 ℃, 5% CO2细胞培养箱中孵育6h～8 h。

3.3.6培养6-8 h后换液，弃去含有转染混和物的培养基，每盘细胞加入10 ml的10% FBS的1640培养基，于37 ℃, 5% CO2细胞培养箱中培养。

3.3.7转染24h后观察转染效率并拍照。

3.4清场3.4.1物品集中在废液桶中灭菌后清洗。

慢病毒包装实验步骤
1.选择长势良好的293T细胞，胰酶消化计数，以2×106个细胞的数量接种于接种到6 cm
细胞培养皿中,当细胞密度在90%时转染目的质粒。

2.细胞转
A液：16.5 μL lipo3000，
250 μL Opti-MEM
B液：21.6 μL p3000，
4 μg PMDLg/PRRE
2 μg pcl-VSVG
0.8 μg PRSV-REV
4 μg 目的质粒
250 μL Opti-MEM
将B液加到A液中混匀，室温静置20 min，将脂质体混悬液逐滴加入到6 cm细胞培养皿中，转染8 h。

3.8 h后，弃掉旧培养基，更换4 mL 预热过的10% FBS无双抗新鲜DMEM培养基，培
养48 h。

4.48 h后吸取上清液至15 mL离心管中，3000 rpm，离心20 min去除细胞碎片，后向3
体积的上清液加入1体积的病毒浓缩液（浓缩液为8.5%的聚乙二醇（PEG）8000和0.4 M氯化钠），涡旋混匀后，4℃过夜孵。

5.病毒感染前一天，选择有良好生长状态的目的细胞，胰酶消化计数，接种于96孔板。

6.病毒浓缩结束后，3500 g，4 ℃，离心25 min后，去上清。

7.96孔板中，弃掉旧培养基，每孔加入浓缩的病毒的不含双抗的完全培养基。

补充8
μg/mL polybrene以促进病毒转导，同时设置一个没有病毒的对照孔。

8.24 h后，更换F-12K完全培养基培96 h后分别加入含有2 μg/mL嘌呤霉素的F-12K培
养基进行筛选。

资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。

所以要在细胞购进时就进行冻存。

2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。

4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。

5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。

6. 细胞计数。

7.将细胞离心，1000rpm，2min。

8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。

10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。

二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。

2. 消化细胞，方法同上。

3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。

密度为3×105个/ml。

4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。

三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。

2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。

3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。

4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。

5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。

慢病毒包装实验流程介绍
慢病毒包装流程：
1、载体质粒与系统质粒共转染293T细胞。

2、收集48~72h的细胞上清液。

3、超速离心纯化浓缩。

4、纯化分装。

5、滴度检测。

慢病毒包装具体实验步骤如下：
一、质粒转染
1、转染前，依次准备好转染试剂、Opti-MEM培养基、目的质粒、骨架质粒、EP管。

2、然后，配置质粒和OMEM的混合液。

3、配置转染试剂和OMEM的混合液。

4、轻轻混匀，静置5min。

5、将配好的质粒与转染试剂混合后形成转染体系。

6、轻轻混匀，静置20min。

7、从培养箱中取出10cm培养皿，弃去培养液，更换为OMEM 培养液。

8、转染，轻轻混匀。

9、在培养皿盖上做好标记，放回培养箱继续培养。

10、转染后6-8h，更换为新鲜的DMEM培养基。

11、转染后次日，显微镜下观察转染效率。

12、转染后48h，收集上清液于干净的50ml离心管中。

13、加入新鲜的DMEM培养基，继续培养。

14、转染后72h，再次收集上清液。

二、浓缩纯化
1、将收集好的上清液离心，弃去细胞碎片。

2、用0.22μm滤膜过滤，分装到超速离心管中。

3、超速离心。

4、离心结束后，将所收获的病毒颗粒重新悬浮，于4℃冰箱中溶解，过夜。

5、次日，再次将溶解后的病毒过滤、分装、入库。