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病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、腺病毒1.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
1.2.2特点1）几乎可以感染所有类型的细胞2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。
病毒如何侵染细胞概述病毒是一种微生物，无法自主繁殖，必须寄生在宿主细胞内才能生存和复制。
病毒的侵染过程可以分为吸附、穿透、解壳、核酸释放、合成、装配和释放等阶段。
本文将详细介绍这些步骤，以便更好地理解病毒如何侵染细胞。
吸附病毒侵染细胞的第一步是吸附。
病毒表面覆盖着一层外套蛋白，它们可以与宿主细胞表面的一些特定蛋白质结合，从而使病毒与细胞接触并吸附在细胞上。
这一过程类似于磁铁吸附物体一样。
穿透一旦病毒吸附在细胞表面，它会进一步穿透细胞膜并进入细胞内部。
有一些病毒可以直接通过细胞膜穿透，例如HIV。
但是，其他病毒则需要借助宿主细胞内的内吞作用完成穿透，例如流感病毒。
解壳和核酸释放完成穿透后，病毒需要解壳并释放其遗传物质。
这个遗传物质通常是DNA或RNA，其中不同类型的病毒使用不同的遗传物质。
解壳的方式因病毒而异，有些会在穿透过程中解壳，而有些则需要等到进入细胞内后才能解壳。
解壳后，病毒核酸会被释放到细胞内。
合成释放到细胞内的病毒核酸将自我复制，并利用宿主细胞的机制合成病毒蛋白，从而制造出更多的病毒颗粒。
这个过程可以分为三个步骤：转录、转译和复制。
在这个过程中，病毒会利用宿主细胞的一些机制，如核糖体、RNA聚合酶等。
装配和释放最后，新合成的病毒核酸和蛋白将组装成为病毒颗粒。
这个过程通常发生在细胞内，并且需要蛋白激酶等宿主因素的帮助。
一旦组装完成，病毒将通过宿主细胞和细胞膜释放出去，并进一步侵染其他细胞。
总之，病毒的侵染过程是一个复杂的过程，它依靠病毒和宿主细胞之间的相互作用，以及病毒利用宿主细胞的机制来完成自我复制和扩散。
对病毒侵染的了解有助于我们更好地理解病毒的传播和治疗。
病毒的细胞培养操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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广州英思特生物科技有限公司为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务，病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类1.11.1.1体，一方面1.1.21）研。
? 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.21.2.1达E11.2.21）2）3）4）5）1.2.3腺病毒包装简要流程1）构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体2）采用 PacI 消化纯化的质粒。
3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。
4）将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。
5）分装，-80℃保存。
1.3、慢病毒和腺病毒的比较2、构建目的基因到载体2.1构建手段一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。
1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序鉴定DNA分子。
质粒在宿主细胞体内外都可复制。
通过个些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不断的复制，来得到目的产物。
3、质粒DNA在大肠杆菌里转化连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒，以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化的三步骤。
3.1大肠杆菌感受态细胞的制备30min2）离心管放到42℃保温90s3）冰浴2min4）每管加800ulLB液体培养基，37℃培养1h（150r/min）5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置6）倒置平皿37℃，12~16h，出现菌落3.3质粒提取步骤1）取1~4ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转离心1min，弃上清一次。
病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、腺病毒1.2.1 原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
慢病毒感染细胞实验原理及步骤1. 实验原理慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。
对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。
所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一，并且正在获得越来越广泛的应用。
2. 主要材料细胞培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、青霉素-链霉素溶液、慢病毒、Polybrene助转染试剂3. 主要试剂配制（1）PBS磷酸盐缓冲液：PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL，调pH7.2，121℃，30min，高压灭菌，4℃保存备用。
（2）细胞生长培养液：临用前根据需要在培养基中加入10%胎牛血清，再按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 ug/mL，置于4℃冰箱保存。
4. 实验步骤（1）胰酶消化细胞，无血清培养基重悬，调整细胞密度为0.5~1×105/ml（根据情况酌情调整），每孔200ul细胞悬液接种至24孔板，培养箱培养过夜。
次日进行慢病毒感染，此时细胞的融合度约为70%左右。
（2）准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用瞬时离心机离心20秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。
根据实验按照MOI准确计算慢病毒用量，将其稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。
病复制实验报告一、实验目的本实验旨在通过病毒复制实验探究病毒在细胞内的复制机制，以及病毒对宿主细胞的感染和病变过程。
二、实验原理1. 病毒复制机制：病毒通过侵入宿主细胞，利用宿主细胞的生物合成机制进行病毒基因的转录和复制，使病毒数量不断增加。
2. 病毒感染和病变过程：病毒侵入宿主细胞后，破坏宿主细胞的正常生理功能，引起细胞病变，如细胞核的改变、细胞内溶解等。
三、实验步骤1. 过筛：将病毒悬液通过滤纸或过滤器筛除细菌及细胞等杂质。
2. 病毒培养：将过筛后的病毒悬液接种于宿主细胞培养基中，利用宿主细胞的生长环境和条件培养病毒。
3. 观察感染情况：观察培养皿中细胞的变化，如细胞的形态、颜色、数量等。
4. 提取病毒：通过离心等方法将病毒从培养基中提取出来，用于后续实验操作。
四、实验结果经过观察和分析，我们得到以下实验结果：1. 病毒感染：培养皿中的宿主细胞出现形态改变，如变圆、脱落等。
2. 病变过程：病毒感染后，细胞核出现异常变化，如核浓缩、核裂变等，细胞内溶解现象也会出现。
3. 病毒复制：经过一段时间的培养，病毒数量逐渐增加，宿主细胞逐渐丧失正常生理功能。
五、实验讨论1. 病毒感染机制：病毒通过侵入宿主细胞，利用宿主细胞的生物合成机制进行病毒基因的转录和复制，导致病毒数量不断增加。
2. 病变过程：病毒感染宿主细胞后，破坏了细胞核的正常结构和功能，引起细胞内外的病变现象。
3. 实验局限：本实验只是模拟了病毒感染和病变的部分过程，没有涵盖完整的病毒复制机制和病变过程。
4. 应用前景：病毒复制实验可以用于病毒学研究，探究病毒感染机制，为疾病防治提供理论基础。
六、实验结论通过本次病毒复制实验的研究和分析，我们可以得出以下结论：病毒通过感染宿主细胞，利用宿主细胞的生物合成机制进行病毒基因的转录和复制，导致病毒数量不断增加。
病毒的感染和复制过程会对宿主细胞造成病变，导致细胞形态、结构和功能发生改变。
该病毒复制实验为病毒学研究提供了基础，并具有重要的理论和应用价值。
病毒感染细胞实验整体流程及原理杨晓芳于2011年5月11日整理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、腺病毒1.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
病毒是如何感染人类细胞的病毒是一种感染人类细胞并引发疾病的微小生物体，它们可以通过各种途径进入人体，进而感染人类细胞。
病毒如何感染人类细胞，一直是研究者们关注的重要问题之一。
本文将从病毒感染的生物学机制、宿主细胞的特征等角度，探讨病毒感染人类细胞的过程。
一、病毒感染的生物学机制病毒感染人类细胞的过程，可以分为五个基本阶段：吸附、进入、解壳、合成、释放。
其中吸附和进入是感染的前两个关键步骤。
（一）吸附在病毒感染细胞之前，它必须先与宿主细胞表面的特定分子相互作用。
这种分子通常被称为病毒的受体。
病毒在向宿主细胞寻找受体的过程中采用了多种策略，发挥了各种独特的感染机制。
例如，一些病毒会利用一些糖蛋白和蛋白质作为受体，然后通过与宿主细胞的膜融合进入其中；另一些病毒（如乙型肝炎病毒）则利用血液中的受体进入肝细胞；其他病毒则需要受体介导的内吞作用。
在吸附过程中，一些病毒可以直接结合到宿主细胞上，而另一些则需要辅助蛋白质（例如补体蛋白等）促进。
（二）进入吸附之后，病毒就会进入宿主细胞之中。
病毒与宿主细胞膜的融合是病毒进入细胞的最常见途径之一，在此过程中膜蛋白从病毒颗粒中释放出来，通过与宿主膜融合，从而将病毒粒子内部与细胞膜相连。
其他进入途径包括通过受体介导的内吞、钩端蛋白介导的细胞膜漂移等。
二、病毒感染宿主细胞的相关特征在病毒感染人类细胞的过程中，宿主细胞的特征也起着至关重要的作用。
宿主细胞的特点可以影响病毒感染的效率，同时也会影响病毒的寿命和复制能力。
（一）表面结构的不同人体细胞一般有许多微细的突起结构，如微绒毛、纤毛等。
这些突起结构主要发挥着细胞吸附、定位和运输等作用。
在病毒感染宿主细胞时，病毒所需要的受体可能通过特定的突起结构表达，因此拥有表达最佳受体的细胞更容易受到感染。
此外，不同细胞类型上若干成分（如不同的糖类或蛋白质）的表达也可能影响着一些特定病毒的感染。
（二）细胞壁的状况人类细胞的细胞壁在细胞分裂过程中扮演着非常重要的角色。
病毒感染细胞实验整体流程和原理病毒感染细胞实验整体流程及原理⽬的基因不能直接整合到⼤多数真核细胞，常⽤的⼿段是将⽬的基因包装成病毒来感染细胞，从⽽得到表达满⾜实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒慢病毒原理慢病毒(Lentivirus )是逆转录病毒的⼀种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相⽐，⼀⽅⾯可以扩增替代瞬时表达载体使⽤，另⼀⽅⾯，Len tivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可⽤于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于⾮分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进⾏长时间的稳定表达。
特点1)直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和⾮分裂细胞均有感染作⽤，适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞(⽐如神经元细胞、⼲细胞或其它原代细胞)。
可以通过简单⽅式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
2)3) 可⽤于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4) ⽆需任何转染试剂，操作简便。
5) 可以根据客户需要制备多种标记。
慢病毒包装简要流程:1) 含有⽬的基因的慢病毒RNAi⼲扰载体的构建和质粒纯化提取。
2) 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3) 培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4) 病毒的纯化和浓缩。
5) 分装、-80 C保存。
6)滴度测定⽬的基因检定，并出具检测报告。
、腺病毒原理腺病毒(Ade no virus , Ad)是⼀种⽆包膜的线状双链DNA 病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个⾎清型，⼤多数Ad 载体都是基于⾎清型2和5, 通过转基因的⽅式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能⼒。
这些重组病毒仅在⾼⽔平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是⼀种适⽤于治疗的⾼效控制系统。
特点消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。
病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、腺病毒1.2.1 原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
1.2.2特点1）几乎可以感染所有类型的细胞2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。
4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单.5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。
1.2.3腺病毒包装简要流程1）构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体2）采用PacI 消化纯化的质粒。
3）消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。
4）将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。
5）分装，-80℃保存。
1.3、慢病毒和腺病毒的比较2、构建目的基因到载体2.1构建手段一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。
1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序鉴定2）如果没有匹配的酶切位点，则设计带有特殊接头的引物进行PCR扩增，得到目的片段，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到穿梭载体，酶切，并测序鉴定2.2质粒载体2.2.1概念能够进行自主复制的环状DNA双链结构，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子2.2.2特征质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。
有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。
质粒在宿主细胞体内外都可复制。
通过个些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不断的复制，来得到目的产物。
3、质粒DNA在大肠杆菌里转化连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒，以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化的三步骤。
3.1大肠杆菌感受态细胞的制备1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mlLB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
2）取0.4ml菌液转接到40mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h3）菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min4）4℃离心10min（4000r/min）5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽6）用冰浴的0.1mol/L氯化钙10ml悬浮细胞沉淀，立即冰浴30min7）4℃离心10min（4000r/min）8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置）9）分装细胞，200ul一份，4℃保存3.2质粒DNA的转化1）取200ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀，冰浴30min 2）离心管放到42℃保温90s3）冰浴2min4）每管加800ulLB液体培养基，37℃培养1h（150r/min）5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置30min 6）倒置平皿37℃，12~16h，出现菌落3.3质粒提取步骤1）取1~4ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转离心1min，弃上清2）加250ul溶液Ⅰ/RNaseA（溶液Ⅰ为细胞悬浮液）混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮，室温静置1-2min。
3）加入250ul溶液Ⅱ（细胞裂解液），轻柔的反复颠倒混匀5-6次。
室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。
4）加入350ul溶液Ⅲ（中和液），立刻轻柔地反复颠倒混匀5-6次，此时会出现白色絮状沉淀。
5）12000室温离心10min，收集上清。
6）将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min。
7）12000转离心1min，弃滤液。
8）加入500ul溶液PB（洗涤液）12000转离心1min，弃滤液，目的是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。
9）加入500ul溶液W（去盐液），12000转离心1min，弃滤液，重复一次。
10）12000转离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。
11）将DNA纯化柱置于新的离心管中，悬浮滴加50-100ul溶液Eluent（为无菌的双蒸水，PH为8.0-8.5），室温放置2min。
12）12000转离心1min，此时管底即为高纯度的质粒DNA，质粒于-20℃保存。
质粒提取步骤：吸取液体培养基于1.5ml离心管中12000转离心1min，弃上清，吸取培养基重复离心弃上清离心，留取少量菌液作为菌种保存，可直接置于-20℃——加250ulBufferS1悬浮细菌，悬浮均匀——加250ulBufferS2温和充分的上下翻转4-6次混合均匀，使菌体裂解——加350ulBufferS3温和上下翻转12000离心10min——取上清液转移到专用的制备管（2ml）12000转离心1min，弃滤液——加500ulBufferW112000转离心1min，弃滤液——加500ulBufferW212000转离心1min，弃滤液，重复一遍——将制备管置回2ml 离心管12000转离心1min——将制备管移入新的1.5ml离心管中，加60~80ulEluent或离子水，室温1min12000转离心1min——移去制备管，将有质粒的离心管于4℃或是-20℃保存4、质粒DNA和其他包装质粒共转染293T细胞产生病毒（即病毒包装）4.1名词解释4.1.1293T细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。
4.1.2脂质体：某些细胞质中的天然脂质小体，可作为生物膜，用于捕获外源性物质后更有效地运送到靶细胞，经同细胞融合而释放。
4.2共转染的操作步骤第一天：用无抗生素DMEM+10%FBS铺板293FT细胞，2ml/孔。
确保第二天细胞密度达到80%-90%融合度第二天：1. 500ul 无血清培养基稀释2ug 表达质粒+1.5ug psPAX2+1.5ug pMD2.G2. 500ul 无血清培养基稀释15ul 脂质体20003. 5min后，将DNA溶液和脂质体溶液混合，室温静止20min4. 从6孔板中吸出1ml无血清培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物。
5. 6-10h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+10%FB（从此刻开始算时间）。
第三天：1.转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上第四天：1.转染后48和72h分别收获含病毒的上清。
2.3000 rpm 离心20min，0.45um滤膜过滤，去除细胞沉淀。
3.12000转离心浓缩细胞、分装-80°C贮存。
4.滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
4.3病毒包装的原理质粒DNA为能转录出慢病毒遗传物质（RNA），但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋白成分的载体质粒，其同时连有目的基因和报告基因，psPAX2为能表达慢病毒外壳的质粒，其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜，pMD2.G为慢病毒的膜蛋白质粒，通过lipofectamine2000进行三质粒共转到靶细胞基因组中，宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出的目的基因RNA与psPAX2、pMD2.G基因翻译出的蛋白组装为慢病毒。
在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。
在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入细胞后，其遗传物质RNA反转录出DNA，该基因再整合到靶细胞的基因组中，完成转染过程，因为质粒DNA只能转录出病毒RNA和表达目的基因却不能表达出病毒的外壳和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复增殖，故对宿主细胞是无害的并且高效的将目的基因转然到靶细胞基因组中。
5、慢病毒感染细胞5.1流程图5.2感染步骤1）铺板：将对数生长期的细胞消化重悬后，按1*105/L密度接种于12孔板，生长过夜2）感染：将70-80%铺满12孔板中的培养液吸除，换新鲜的培养液，同时加入PBS浓度梯度稀释的病毒液，混合均匀后即可放入孵箱培养。
3) 24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体根据细胞状态来看。
5.3荧光显微镜的操作流程打开荧光器（30min内不能关闭，否则影响显微镜寿命），细胞培养板置于载物台，调节物镜和光圈，先用自然光观察视野内细胞，再关闭光，开启荧光通道，观察荧光强度，判定感染率。
图片取样前可以调节曝光时间，增益值和彩色度使荧光照片最完美。
（针对leica）5.4注意事项内容1.病毒浓度要适宜，太少的话细胞被感染的也少，但是病毒浓度太大，对细胞有伤害。
2.感染病毒时培养基量少，以保证病毒的浓度，在培养10h左右可根据培养基颜色加培养基。
3.在不明确细胞感染复数情况下，可进行浓度梯度感染，计算细胞感染复数。
