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血吸附法检测新生牛血清病毒1原理有些病毒在其敏感宿主细胞中增殖，并不引起细胞病变，但在细胞表层存在病毒蛋白质，用一定百分比的红细胞悬液覆盖细胞表面，置于不同温度条件下一定时间，显微镜下观察，即可出现红细胞被吸附的现象。
血吸附法的技术主要特点是:敏感性高、速度快、成本低。
主要缺点是:病毒特异性检查问题尚未解决，结果判定的客观性较差，是间接检查病毒存在的方法，技术程序也还比较陈旧。
该方法首先使用无病毒血清对实验用Vero细胞进行培养增值，然后分别制备阴性供试品、阳性供试品以及待测试供试品。
取两瓶细胞，分别加入供试品。
然后在适宜的条件下处理，然后观察实验结果。
2材料和方法2.1材料2.1.1病毒牛副流感病毒。
2.1.2细胞Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)：购自中国生物制品检定所；2.1.3试剂无病毒污染的新生牛血清：阴性对照品使用；MEM培养基：细胞基础培养基；0.85%生理盐水：洗脱血细胞；胰蛋白酶：消化细胞；鸡血；豚鼠血。
2.1.4仪器设备①专门的病毒实验室：生物安全柜(CBK一DZOI)操作，符合国家生物安全要求；②洁净工作台；③倒置显微镜；④冰箱；⑤离心机；⑥离心瓶、注射器、吸管。
2.1.5阳性病毒将牛副流感病毒在Vero细胞上连续传代至病毒滴度为5.0lgCCID50/ml以上时进行合并，分为若干批，零下70℃冻存，作为阳性病毒对照液。
2.2方法2.2.1细胞制备以细胞密度为2~3×105/mL的Vero细胞，接种到适宜的细胞培养瓶后置于37℃培养箱培养，每天镜下观察细胞的分裂增殖情况，并记录形成良好单层的时间(镜下观察细胞生长成片率达90%以上为良好单层)。
注意将制备的细胞及时进行编号和标注，以免造成混淆。
2.2.2红细胞悬液配制取体重300一500g豚鼠，心脏采血2一3mL放入内含3一5mL生理盐水的离心管中，盖栓、轻摇。
豚鼠血加入生理盐水洗三次，800一1000转/分钟离心10一15分钟，压积血球，备用。
牛血清质量标准
1. 外观
牛血清应呈现透明至淡黄色的液体，无沉淀物，无悬浮物，无杂质。
如果出现不透明的现象，应拒绝接受。
2. 营养成分
牛血清应含有适当的营养成分，如氨基酸、维生素、矿物质等，以支持细胞生长和维持细胞活力。
具体的营养成分应符合行业标准或规定。
3. 无菌
牛血清应无菌，即不含有细菌、病毒、支原体和其他微生物。
这一方面可以通过无菌检测来确定。
4. 无支原体
牛血清应无支原体，这是一种常见的污染物。
支原体的存在可能会影响细胞生长和细胞活力，因此需要确保血清中不含支原体。
5. 无病毒
牛血清应无病毒，特别是对于某些特定的细胞系，如人细胞系，病毒的存在可能会对细胞产生致瘤性。
因此，需要对牛血清进行病毒检测以确保其安全性。
6. 活性
牛血清应具有一定的活性，即能够支持细胞的生长和维持细胞的活力。
具体活性应符合行业标准或规定。
7. 安全性
牛血清应安全使用，即不会对使用者或接受者产生不良反应。
这一方面可以通过进行动物试验来确定。
8. 稳定性
牛血清应具有一定的稳定性，以保证在使用过程中不会出现质量问题。
稳定性可以通过在一定温度和湿度条件下进行储存和使用试验来确定。
牛血清的质量检测（一）化学检测（1）渗透压（280-340mOsmol/kg）：使用凝固点降低的方法检测渗透压，使用国家标准技术研究所标定的标准溶液对我们的渗透压仪器进行校准；（2）PH值（7.0-7.5）：同样使用国家标准技术研究所标定的标准溶液对pH计进行校准；（3）蛋白含量：（电容法）样品被加到醋酸纤维素介质中并在缓冲溶液体系内迁移，条带经染色、清洁、干燥后用密度仪进行扫描以检测***和球蛋白组分的相对浓度。
***、球蛋白和血红蛋白随着牛年龄的增加血清中总蛋白含量相应增加，总的血清蛋白含量可以确认产品的规格和年龄。
（二）微生物检查（1）细菌和真菌:直接培养法（2）支原体：（培养法及DNA染色法）在支原体专业培养基上培养3-4周，培养温度34°C～36°C分别在需氧和厌氧的条件下进行，有的还需要在支原体琼脂培养皿上传4代，Hoechst 荧光素DNA染色检查哪些培养法无法检出的支原体如猪鼻支原体等。
（3）病毒：牛兰舌病毒Bovine blue tongue;牛腺病毒Bovine Adeovirus；牛细小病毒Bovine Parvovirus;牛病毒性腹泻病毒Bovine Viral Diarhea Virus;狂犬病病毒Rabies;呼肠狐病毒Reovirus；牛呼吸道合胞病毒BRSV;副流感病毒III型Parainfluenza。
检查方法：已证明无外源因子污染的牛细胞培养物，在细胞生长液中加15%待测血清，连传3代共21天。
阴性对照细胞培养液中价15%已知无病毒污染的牛血清，与试验组同条件下进行。
在观察期内注意细胞形态变化或细胞病变。
在观察期内第14天待检样品和对照样品用标准病毒检测方法检查。
如待检细胞培养物经胰酶消化后分种到6个含盖玻片的容器内。
阴性对照品按同样方法。
再将牛腹泻病毒、牛细小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼肠弧病毒分别加入待检培养物盖玻片容器内作为阳性对照，在培养7天，用荧光抗体技术进行检查。
生物制品生产和检验用新生牛血清质量标准用于生物制品生产的牛血清应为从出生14小时内未进食初乳的新生小牛采血分离血清，经除菌过滤制成。
主要用于细胞培养。
【性状】为淡黄色澄清稍黏稠的液体，无溶血或异物。
【无菌检验】按附录页进行检验，应无菌生长。
【支原体检验】按附录页进行检验，应无支原体生长。
【外源病毒检验】将被检血清按10%浓度加入MEM培养基中，接种48孔细胞培养板培养的VERO、BHK21、PK15、牛睾丸细胞单层，每种细胞接种8孔，同时设立牛病毒性腹泻／粘膜病病毒（BVDV）对照各2孔，37℃培养5日，观察细胞病变，细胞均不得出现细胞病变。
培养至第5日时，对每种细胞的2孔及病毒对照孔，用PBS洗涤3次，每孔加入80%丙酮0.5ml，4℃以下固定30分钟，弃丙酮后自然干燥，每孔加入BVDV荧光抗体染色0.3ml，室温染色30分钟，弃荧光抗体并用PBS洗涤3次，荧光显微镜观察，被检血清孔不得出现荧光染色。
剩余的6个细胞孔,前3孔，每孔加入0.2%豚鼠、人O型、鸡红细胞等量混合液0.3 ml，2～8℃作用30分钟，另3孔同样加入红细胞后室温作用30分钟。
倒置显微镜观察，均不得出现红细胞吸附现象。
【特异性抗体测定】生产企业应根据血清的使用对象确定测定的抗体种类，测定方法采用中和抗体测定法，如有适用的的ELISA方法，也可采用。
如用于生产口蹄疫疫苗的血清不得含有口蹄疫病毒抗体，用于生产猪瘟疫苗的血清不得含有BVDV抗体等。
【细菌内毒素测定】用凝胶法或细菌内毒素检测仪测定，按照鲎试剂或内毒素检测仪操作程序测定，每毫升血清的内毒素含量应低于10 EU。
【细胞增殖试验】取生长良好的Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，弃营养液，用无血清MEM配成每毫升30万～50万细胞悬液，计数细胞后，用无血清MEM在96孔细胞板上作1:200、1:400、1:800、1:1600稀释，每稀释度加8孔，每孔0.1ml，每孔再分别补加0.1ml含20%标准血清或20%被检血清MEM营养液，置5％CO2培养箱37℃培养至48小时，倒置显微镜下计数，取每孔克隆数均在30～50之间的稀释度的8个孔，求和计为总克隆数。
兽医实验室诊断试剂验收和质量验证作业指导书制订日期 2003年08月23日修订日期 2018年11月23日实施日期 2018年11月23日兽医实验室诊断试剂验收和质量验证作业指导书更改记录目录项目、标题页次更改记录 (2)目录 (3)1.总则 (4)1.1适用范围 (4)1.2起草、更改、作废 (4)1.3目的 (4)1.4权责 (4)1.5.定义 (4)2. 作业内容 (5)3．相关文件 (8)4.相关表单 (8)5.流程图 (9)总页数：9页一、目的为确保本中心购进的诊断试剂的质量，应及时进行验收和质量验证，特制定本作业指导书。
二、适用范围：本中心计划购进的所有诊断试剂。
三、职责1.仪器设备室人员负责诊断试剂的验收、记录。
2．检测室人员负责对诊断试剂的质量验证。
3．资料档案管理人员负责相关记录的存档，建立年度对供应商的评价表和合格服务方名录。
四、工作程序1．诊断试剂的验收：诊断试剂送至中心后，由诊断试剂管理人员进行验收。
诊断试剂管理人员对试剂盒的包装、数量、有效期等内容进行逐一核对，并填写“供应品验收记录”。
诊断试剂应保持包装完好、无破损、试剂在有效期内、数量符合订货数量。
验收合格的诊断试剂按说明书要求进行入库保存。
如发现有破损、超过有效期、数量与订货数量不符等情况，一律按不合格诊断试剂处置（见3不合格诊断试剂的处置）。
2．诊断试剂的质量验证：诊断试剂入库后，诊断试剂管理人员及时通知相关检测人员进行诊断试剂的质量验证。
对于采购数量大、价格相对便宜的诊断试剂，如间接血凝试剂、血凝和血凝抑制试剂等，每到一批试剂后，同一批次随机抽取一盒（套）进行验证试验。
对于采购数量少、价格昂贵的诊断试剂，如PCR、ELISA试剂盒等，不单独做质量验证，将第一次检测样品的试验结果作为质量验证的依据。
验证试验严格遵照相关程序，由两名检测人员进行，试验设立阴性、阳性对照，并做好原始记录。
如试验对照成立，判为试剂质量合格；试验对照不成立，判为试剂质量不合格。
黑龙江维远生物工程有限公司超级新生牛血清质量检验报告单产品批号：规格：400ml/瓶数量：1840L 检测依据：根据《中华人民共和国药典》2010年版三部新生牛血清检测要求检测项目检测方法检测标准检测结果项目结论蛋白含量凯氏定氮法 3.5-5.0% 3.9% 符合规定血红蛋白氰化高铁法＜0.02% 0.016% 符合规定大肠杆菌噬菌体噬斑法和增值法应阴性阴性（-）符合规定渗透压摩尔浓度渗透压摩尔浓度的测定渗透压摩尔浓度比的测定250—400m O smol/kg 278m Osmol/kg符合规定无菌检查培养法应无菌生长10/10阴性（-）符合规定支原体检查培养法DNA染色法3 应无支原体生长阴性、阳性对照成立时，指示细胞的细胞核呈现黄绿色荧光，阴性。
无支原体生长阴性（-）符合规定细菌内毒素检查凝胶法应≤10EU/ml<10EU/ml 符合规定病毒检查细胞培养法免疫荧光抗体检查法牛腹泻病毒、牛腺病毒.牛细小病毒.呼肠孤病毒.狂犬病毒.牛副流感病毒均不产生病变和没有红细胞吸附现象。
免疫荧光结果应未见特异性荧光，阴性。
细胞不产生病变和没有红细胞吸附现象，均阴性（-）。
未见特异性荧光，阴性（-）符合规定支持细胞增殖检查细胞生长曲线的测定细胞倍增时间测定法克隆率（有限稀释法）细胞最大增殖浓度≥1×106/ml细胞倍增时间≤20小时克隆率＞70%1.3×10617小时＞85%符合规定内控检测项目外观检查目测及灯检应无可见异物无可见异物符合规定牛腹泻病毒抗体试剂盒应阴性（-）阴性（-）符合规定口蹄疫（O型、亚Ⅰ型）抗体检测试剂盒阴性＜1： 4阴性＜1： 4阴性（1：4）符合规定综合判定：合格检验人：复核人：2012年01 月09日2012年01 月09日。
新生牛血清药典标准新生牛血清是一种重要的生物制品原料，广泛应用于医药、保健品、生物技术等领域。
为了保证新生牛血清的质量和安全性，制定了一系列的药典标准，以规范其生产和使用。
本文将对新生牛血清的药典标准进行介绍，希望能够对相关行业人士有所帮助。
首先，新生牛血清的药典标准主要包括对其生产过程、质量指标、储存条件等方面的规定。
在生产过程中，必须符合相关的生产规范和操作流程，确保产品的纯度和活性。
质量指标方面，主要包括对蛋白质含量、内毒素水平、微生物菌落等指标的要求，以及对可能存在的有害物质的限量标准。
此外，新生牛血清在储存和运输过程中，也有一系列的条件要求，以确保其在使用前的质量稳定性。
其次，新生牛血清的药典标准是根据国际上的相关规定和标准进行制定的，以确保其在国际贸易中的通用性。
这些标准的制定是经过了广泛的讨论和专家的审查，具有很高的权威性和科学性。
因此，符合药典标准的新生牛血清可以更好地满足国际市场的需求，提升产品的竞争力。
再者，新生牛血清的药典标准对于生产企业和使用单位都具有重要的指导意义。
对于生产企业来说，遵循药典标准可以帮助其建立健全的质量管理体系，提高产品质量，降低生产风险。
对于使用单位来说，选择符合药典标准的新生牛血清可以更好地保证实验结果的准确性和可重复性，降低实验风险，提高工作效率。
最后，新生牛血清的药典标准是一个动态的过程，随着科学技术的发展和行业的需求，会不断地进行修订和更新。
因此，生产企业和使用单位都需要密切关注最新的药典标准，及时调整生产和使用的相关流程，以确保产品的质量和安全性。
总之，新生牛血清的药典标准对于保证产品质量和安全性，提升产品竞争力，促进行业健康发展具有重要的意义。
希望本文对相关行业人士有所帮助，也希望大家能够共同遵守药典标准，共同推动新生牛血清行业的发展。
2017年第04期近年来,生物制品在生产以及应用方面取得了不小的进展,与社会生活的联系也愈发紧密。
由于新生牛血清中病毒来源广、种类多,因此针对新生牛血清的病毒检测十分必要。
本文通过研究新生牛血清病毒检测的特点和概况,简要分析了常用的病毒检测方法,以期提高牛血清中病毒的检出率,提高我国生物制品质量以及行业水平。
1新生牛血清病毒检测概况新生牛血清指的是在一段时间未进食的牛身上经过采血以及除菌过滤后制成的血清,常用于疫苗以及单克隆抗体的制备,是影响生物制品质量的关键因素。
尽管新生牛血清由于个体差异性导致质量参差不齐,但仍是细胞培养的关键,决定着生物制药工业化的整体进程。
现今生产新生牛血清的企业众多,为了统一品质,国家出台了相关政策和规范,加大了监管力度,力求从源头上控制牛血清中的病毒,保证原材料质量。
获得新生牛血清的最佳时机应为胎牛的下一时期,即血液循环系统刚刚完成的新生期,这时牛通常为8个月大,牛血清质量较高。
除了对新生牛的选择,采血过程也十分重要。
由于采血源众多,因此需要时刻注意新生牛体内抗体等的变化,其次,采血室及采血过程应时刻保持洁净,且保证新生牛血清在采血前后无菌环境下的保存。
对采血车间设计以及操作规范,我国在相关条例中都有明确的要求,确保新生牛血清的产品质量。
新生牛血清的病毒通常为4种,能够引起生物体的不同病变。
(1)牛细小病毒,常发生于我国从国外引进种牛的地区,是一种接触性传染病。
(2)狂犬病病毒,感染狂犬病病毒的动物常表现为极度兴奋和狂躁,病死率高,且由于该种病毒可感染所有温和动物,因此对于疫苗生产的危害极大。
(3)牛副流感病毒是通过感染牛体,引起呼吸道疾病的一种病毒,多发于欧美等国家。
(4)牛腹泻病毒是目前较为严重的外源性病毒,其极高的抗体检出率以及感染持续性严重危害着动物以及婴幼儿的健康,受到全世界的广泛重视。
我国对新生牛血清病毒的检测从牛体到检测过程都有明确的要求。
包括要求新生牛牛龄,多种病毒检测类目,如牛腹泻病毒阴性,以及支原体、大肠杆菌噬菌体,各类蛋白如血红蛋白等的含量检测,此外,细胞生长曲线以及倍增时间也纳入到了牛血清质量检查范围中。
