荧光分光光度法测定维生素B2片的含量

荧光分光光度法测维生素B2的含量

一、 实验目的

1. 了解荧光分析法的原理

2. 学习荧光公光光度计的使用方法

二、 实验原理

维生素B2在230—490nm范围波长的照射下，激发出峰值在526nm左右的绿色荧光，在pH=6-7的溶液里荧光最强，在pH=11时荧光消失。

三、 仪器与试剂

荧光分光光度计、容量瓶、玻璃棒

10.0ug/ml维生素B2标准液：称取10.0mg维生素B2，先溶解于少量的1%乙酸中，然后用1%乙酸定容至1000ml。溶液应该保存在棕色瓶中，置于阴凉处。

四、 实验步骤

1. 标准系列溶液的配制

取6个25ml比色管，分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0ml及2.5ml维生素B2标准溶液，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。

2．测定荧光激发光谱和发射光谱

取上述第3号标准系列溶液，测定激发光谱和发射光谱。先固定发射波长为525nm，在400—500nm区间进行激发波长扫描，获得溶液的激发光谱和荧光最大激发波长λex再固定激发波长为λex，在480—600nm区间进行发射波长扫描，获得溶液的发射光谱和荧光最大发射波长λem。

3. 标准曲线的绘制

（1） 波长的设定：将激发波长和发射波长分别设定为上述得到的λexT和λem值。

（2） 绘制标准曲线：用1号标准系列溶液将荧光强度“调零”，然后分别测定2—6号标准系列溶液的荧光强度。

4. 未知试样测定

取未知试样溶液2ml置于25ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，测定此溶液的荧光强度。 五、 实验数据及结果

（1）从绘制的维生素B2的激发光谱和发射光谱曲线上，确定其最大激发波长和最大发射波长；

（2）从绘制维生素B2的标准曲线，并从标准曲线上确定未知试样溶液中维生素B2的浓度；

（3）计算出原始未知试样中维生素B2的浓度。

六、 注意事项

测定的顺序要从稀到浓，以减小测量误差。

七、 思考题

（1）什么是荧光激发光谱？如何绘制荧光激发光谱？

紫外分光光度法测定维生素B1片的含量

李刚

（四川大学华西药学院 四川成都）

摘 要 本试验采用紫外分光光度法对维生素B1片的含量进行测定，对此法进行方法验证，证明了此法具有专属性高，回收率高、精密度高，线性好、测定范围宽的特点，并对数据处理方法进行了比较，发现采用对照品比较法进行数据处理受仪器波动影响较小，测定结果可信度较高。

关键词 维生素B1 紫外分光光度法 含量测定 方法验证 对照品比较法

维生素B1及其制剂及其制剂常采用的方法有非水滴定法，紫外分光光度法和硫色素荧光法。中国药典用非水溶液滴定法测定原料药，片剂和注射剂采用紫外分光光度法，USP采用硫色素荧光法。采用非水溶液滴定法可能受到氢卤酸盐的干扰，对操作人员要求较高，采用硫色素滴定法不受氧化破坏产物的干扰，测定准确但操作繁琐，且荧光测定受干扰因素较多，本实验采用紫外分光光度法进行含量测定。

1 实验装置及试剂

1.1 仪器 BS210S型天平，UV751GD型紫外/可见分光光度计。

1.2 实验材料 维生素B1片（来源：成都第一制药，规格：1--00片*10mg，批号：061204），维生素B1标准品（分析纯），维生素B1对照品（200ug/ml，2.0mg/ml），维生素B1标准溶液（0.250mg/ml），空白辅料，盐酸溶液（9→1000）。

2 实验方法

2.1 测定波长的选择：分别称取维生素B1标准品，维生素B1片粉，维生素B1空白辅料各10mg，平行配制：加盐酸溶液适量溶解后，用盐酸溶液定容至50ml，摇匀后精密量取1ml，盐酸溶液定容至25ml，摇匀后在紫外/可见光区进行全波长扫描，测得不同波长下的吸光度值。

2.2 线性与范围：取五个100ml的容量瓶，精密量取维生素B1对照品（200ug/ml）4.00、5.00、6.00、7.00、8.00ml，用盐酸溶液定容至刻度，摇匀，每瓶中对照液浓度分别为8.00、10.00、12.00、14.00、16.00ug/ml，在246nm波长处进行吸光度测定，以吸光度与维生素B1对照液浓度进行最小乘法回归分析，得到回归方程，此为标准曲线。

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XX医科大学

生物化学自主实验设计

紫外分光光度法测定饮料中的的核黄素

实验小组成员：

专业： - 2 -

紫外分光光度法测定饮料中的的核黄素

摘要：利用紫外分光光度法测定市场上贩卖的几种常见品牌饮料中维生素B2的含量。使用444nm波长的紫外光测定对其进行测定。

关键词：紫外分光光度法；核黄素；测定含量

正文：

维生素B2（核黄素）是人体中许多重要辅酶的组分。测定核黄素含量的方法很多，本实验小组采用紫外分光法,以市售美国原装Puritan's Pride核黄素维生素B2片中核黄素含量为标准，测定市场上贩卖的几种常见品牌饮料中维生素B2的含量，为各种饮料的营养含量提供了实验依据。

1 实验部分

1.1实验目的：采用紫外分光光度法测定市场上抽选的5种品牌饮料中维生素B2的含量，探讨各种品牌的饮料是否具有其描述的功能。从中学习核黄素的检测技术并了解直接提取样品的原理与方法。

1.2实验原理：核黄素（维生素B2）分子式为C17H20N4O6，结构式如图1.2.1，微溶于水，可溶于氯化钠溶液，易溶于稀的氢氧化钠溶液，遇光容易分解。样品中加入1.4%的冰醋酸后，在444nm的波长处可以测定其吸收结果 从而根据标准曲线得出样品浓度。 - 3 -

图 1.2.1

1.3实验用品：

仪器：紫外分光光度计，层析管，棕色容量瓶，50mL锥形管，脱脂棉，比色管。

试剂：硅镁吸附剂A、B，蒸馏水，冰醋酸，洗脱液（丙酮：冰醋酸：水=5：2：9），3%高锰酸钾溶液，3%过氧化氢溶液，1.4%醋酸钠，维他奶样品（图1.3.1），“蒙牛”纯牛奶样品（图1.3.2），“椰树”椰汁样品（图1.3.3），“冰露”机能水样品（图1.3.4），“燕京”啤酒样品（图1.3.5）,市售美国原装Puritan's Pride核黄素维生素B2片（每1图1.3.1 图1.3.2 图1.3.3

图1.3.4 图1.3.5 - 4 -

实验一 荧光光度分析法法测定维生素B2

一、实验目的

1.学习和掌握荧光光度分析法的基本原理和方法。

2.熟悉荧光分光光度计（或荧光光度计）的结构和使用方法。

二、实验原理

经紫外光或波长较短的可见光照射后，一些物质会发射出比入射光波长更长的荧光。荧光光谱能反映物质的特性。以测量荧光强度和波长为基础上的分析方法称为荧光分光光度分析法。

对同一物质而言，在稀溶液 (即 A = abc <<0.05 ) 中，荧光强度 F

与该物质的浓度 c 有以下关系：

(35.1)

式中 φf 为荧光过程的量子效率，a 为荧光分子的吸光系数，b 为试液的吸收光程，I0为入射光的强度。当I0及 b 不变时，上式为

F=Kc (35.2)

式中 K 为常数。因此在低浓度的情况下，荧光物质的荧光强度与浓度呈线性关系。

在 430~440 nm 蓝光照射下，维生素 B2 就会发生绿色荧光，荧光峰值波长为 535 nm。在 pH = 6~7 的溶液中其荧光最强，在 pH

= 11 时其荧光消失。

三、仪器及试剂

1、仪器：

国产930型（或其它型号）荧光光度计；容量瓶 （50 mL，6 个）； 吸量管（5 mL ，1支）；棕色试剂瓶（500 mL）；洗瓶（500 mL）；

冰箱（1台）

2、试剂：（除特别注明，所有试剂均为分析纯）

(1) 100.0mg·mL-1 维生素 B2 标准贮备液

准确称取0.1000g维生素 B2，将其溶解于少量的1 %的乙酸中，转移至1 L容量瓶中，用1 %的乙酸稀释至刻度，摇匀

(2) 5.00 mg·mL-1维生素 B2 工作标准溶液

准确移取50.00 mL 100.0mg/L维生素B2标准贮备液于1 L 容量瓶中，用1%乙酸稀释至刻度，摇匀

(3)待测液

取市售维生素B2一片，用1 %乙酸溶解，在1 L 容量瓶中定容。