荧光分光光度法测定维生素B2的含量

荧光分光光度法测定维生素B2的含量

实验项目：

荧光法定量测定维生素B2的含量

实验目的：

1. 掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理

含有荧光基团的化学物质维生素B2，在吸收光能而被激发以后发射荧光，因此溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质吸收光能的程度以及荧光效率有关。溶液中维生素B2被入射光（I0）激发后，可以在溶液的各个方向观察荧光强度（If）。在低浓度时，溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系。标准曲线法是取一定已知量的维生素B2的对照品与待分析试样溶液经过相同的处理后，将对照品配制成一系列浓度的对照溶液，测定其荧光强度，并以荧光强度为纵坐标，以对照溶液浓度为横坐标绘制工作曲线，然后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度，由工作曲线求出维生素B2片试样中荧光物质的含量。

2. 了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，基本操作

荧光分光光度计的基本原理：由氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接收，然后以图或数字的形式显示出来。物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光.。 荧光分光光度计的主要部件：光源：为高压汞蒸气灯或氙灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。激发单色器：置于光源和样品池之间的为激发单色器，筛选出特定的激发光谱。发射单色器：置于样品池和检测器之间的为发射单色器，常采用光栅为单色器，筛选出特定的发射光谱。 样品池：通常由石英池组成。检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器，可将光信号放大并转为电信号。光源发射的激发光通过入射狭缝，经激发单色器分光后照射到被测物质上，发射的荧光再经发射单色器分光后用光电倍增管检测，并经信号放大系统放大后记录。

实验原理：

1. 荧光分光光度法的原理

当被测物质受到光照后，被测物分子吸收了具有特征频率的辐射能，分子从基态上升到激发态，分子在较高能级的激发态时，它可能处于激发态中各种振动状态的一种。然而由于分子通过与溶剂分子，同类分子或其他分子的碰撞，而失去振动能级，降低至激发态时的最低振动能级，在此过程中并不发光。但当分子从激发态的最低振动能级，即第一电子激发态的最低振动能级降落至基态的各个不同的振动能级时，则以光的形式辐射出能量，所辐射出的光即是荧光。

当固定激发光波长和强度不变，而记录荧光强度随波长变化的曲线，称为荧光光谱。若固定荧光最强处的荧光波长不变而改变激发光波长，记录荧光强度随激发光波长变化的曲线，称为激发光谱。 当荧光物质分子受到光辐射后，不但产生荧光而且还将产生荧光分析中所不希望的瑞利散射光及其倍频光谱。对于液体样品不但会产生瑞利散射光及其倍频光谱，还同时会产生拉曼光谱，这些光谱构成了对荧光光谱的干扰，在荧光光谱的测定和荧光物质的定量分析中必须给以识别和消除。

2. 维生素B2的理化性质，以及可以用荧光分光光度法测定的原因

维生素B2也称核黄素，是橘黄色无臭的针状结晶。其分子式为：C17H20N4O6，分子量：376.4，结构式为：

由于分子中有三个芳香环，具有平面刚性结构，因此它能够发射荧光。维生素B2易溶于水，而不溶于乙醚等有机剂。光照易分解，对热稳定，在中性或酸性溶液中稳定，在碱性溶液中较易被破坏。维生素B2水溶液在430～440 nm蓝光或紫外光照射下会发出绿色荧光，荧光峰在525 nm附近，在pH为6-7的溶液中荧光强度最大，在pH=11时，荧光消失。最大激发波长λex=465 nm，最大发射波长λem=520 nm。维生素B2在水溶液中稳定，在稀溶液中，其荧光强度与维生素B2溶液浓度呈线性关系。因此可以用荧光光谱法测维生素B2的含量。 仪器与试剂：

1. 仪器：荧光分光光度计，1cm石英比色皿，电子分析天平；吸量管1ml，5ml；棕色容量瓶25ml，100ml

2. 试剂：维生素B2对照溶液（13.0μg/ml），维生素B2片；配制的1%的HAc

实验内容与步骤：

1. 激发光谱和荧光发射光谱的绘制（用浓度为0.52μg/ml的标准溶液）

设置λEm=520nm为发射波长，在250-400nm范围内扫描，记录激发波长强度和激发波长的关系曲线，便得到激发光谱，记录最大激发波长λEx。

设置λEx为最大激发波长460nm，在400-600nm范围内扫描，记录发射波长强度和发射波长的关系曲线，便得到荧光发射光谱，从荧光发射光谱上找出最大发射波长λEm。

2. 系列标准溶液

取维生素B2(13.0μg/ml)对照溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml分别置于25mL的棕色容量瓶中，加蒸馏水标定，摇匀。

3. 标准溶液的荧光测定

将激发波长固定在460nm，荧光发射波长为520nm，测量上述系列浓度溶液的荧光发射强度，按浓度从低到高测定。

在同样条件下测定未知溶液的荧光强度，并由标准曲线确定未知试样中维生素B2的浓度。

4. 样品前处理 样品储备液：取维生素B2片（5mg/片）共20片，精密称量总重ω总=1.24866g，计算平均片重ω平均=0.062433g，置于研钵中，研细，从中取出ω=0.06276g样品，以1%的HAc溶解，并稀释至100ml，超声助溶10min，将此溶液过滤，弃去初滤液，接续滤液，放置待用。

待测样品溶液：平行量取样品储备液0.5ml 3次置于3个25ml的容量瓶中，以蒸馏水稀释至刻度。测定此溶液的荧光值，用回归方程或在工作曲线上求得其浓度，并求算出维生素B2片剂的标示含量。

实验结果：

1. 激发波长λEx=460nm；发射波长λEm=520nm

2. 标准溶液及待测溶液的浓度和荧光强度记录

维生素B2溶液浓度（μg/ml） 0.52 1.04 1.56 2.08 2.60 待测溶液

相对荧光强度 2.038 3.946 5.742 7.370 8.988 3.549 3.993 3.424

标准曲线方程：y=3.3315x+0.4196，相关系数r=0.9993，理论r值为1，相关度很接近，说明准确度比较高，溶液配制比较准确。

计算维生素B2的浓度以及标示量的百分含量见下表： y = 3.3315x + 0.4196R² = 0.998601234567891000.511.522.53相对荧光强度维生素B2溶液浓度（μg/ml）样品号 F1 F2 F3 平均F 浓度（μg/ml） 标示量百分含量(%)

RSD(%)

1 3.551 3.550 3.546 3.549 0.939 89.6

9.13% 2 3.993 4.001 3.985 3.993 1.070 106.4

3 3.432 3.421 3.418 3.424 0.902 93.4

3. 实验图谱

结果分析与讨论：

1. 石英皿是四面透光的？

答：在激发光源照射作用下，试样基态原子受激发产生荧光，而入射光源和检测器的方向是垂直的，所以石英皿是四面透光的。

2. 本次实验中需要注意的地方？

(1)吸量管、容量瓶的正确使用及移液、定容须规范操作，配制标准溶液时，为了减少误差，取不同体积的同种溶液应用同一移液管。

(2)使用荧光分光光度计时，须按照既定程序进行。在进行检测时，需用溶剂做空白，保证该实验的专属性，用以消除其他物质荧光的影响。在测定系列浓度标准溶液的荧光强度时，必须按浓度由低到高的顺序放入测定。测待测液前，石英皿要用蒸馏水清洗，再用待测液润洗，才能进行测定。

(3)拿取石英池时，应用手指捏住池体的上部棱角处，不能接触下部。清洗样品池后，应先用吸水纸吸干四个面的液滴，再用擦镜纸往同一方向轻轻擦拭。

3. 维生素B2在pH=6~7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液测定？

答：因为在碱性溶液中维生素B2经光线照射后，会发生分解生成光黄素，其荧光比维生素B2的荧光强的多。因此，本实验要在酸性溶液中进行测定维生素B2。