荧光分光光度法测定维生素 B2的含量

1 实验 药片中维生素B2含量的荧光光谱法测定

1 实验目的

1.1 了解生物/药物分子的荧光光谱分析原理；

1.2 熟练掌握荧光分光光度计的使用；

1.3 探讨荧光光谱法用于生物药物如维生素B2的高灵敏检测方法。

2 实验原理

在一定波长的光照射下，物质会发出比入射波长更长的光，即荧光。利用其荧光的位置和强度（相对荧光强度），可以对物质如维生素B2进行定性和定量分析。对照标准曲线，即可得到药片中维生素B2的含量。

3 实验仪器与试剂

荧光分光光度计（LS-45型，美国Perkin Elmer公司），电位pH计（pHSJ-3F型，上海雷磁仪器厂），电子天平（BS124S，北京赛多利斯仪器系列有限公司），进样器（0-100μL，0-10mL，上海医用激光仪器厂）

维生素B2（核黄素，天津市光复精细化工研究所），维生素B2片 （山西省临汾健民制药厂）和复合维生素B片 （湖北绿金子药业有限责任公司），Tris-HCl缓冲液

4 实验步骤

4.1 溶液的配制

（1）缓冲溶液的配制： 0.1mol/L的Tris溶液与浓度为0.1mol/L的HCl溶液。按一定的体积比进行混合，用实验室pH计调节至最佳pH值，本实验pH控制为7.00。

（2）标准溶液的配制：称取0.0050g核黄素，溶于上述缓冲液，定容到100mL容量瓶，从中取5mL继续用缓冲液稀释到50mL容量瓶，得浓度为5μg/mL的贮备液。暗处储存。

（3）待测液的配制：

称取0.02g维生素B2药片，用缓冲液溶解稀释至50mL容量瓶，再稀释100倍，得待测液，暗处储存。

4.2 最佳激发波长及发射波长的确定

4.2.1全扫描，找出一些最大激发、发射峰所在的波长； 2 4.2.2分别用所找出的最大激发波长扫描发射波长，由于同一种物质其发射峰的位置不随激发波长的变化而变化，而只有强度的变化，故可以初步确定其发射波长；

4.2.3用所确定的发射波长反扫激发波长，得到激发波长的确切位置，即为最佳激发波长。

实验四 荧光分光光度法测定维生素 B2

一、实验目的

1．了解 F 96 荧光分光光度计的性能及操作。

2．掌握荧光分析法的基本原理。

3．学习荧光分析法测定维生素 B2 的含量。

二、实验原理

维生素 B2 是一种具有强烈荧光特性的化合物。其水溶液在 pH = 6～7 时荧光最强，其最大激发波长为 λex = 465 nm ，最大发射波长为 λem = 520 nm。在低浓度时，λex = 465 nm

时在 520 nm 处测得的荧光强度与维生素 B2 成正比。即：

IF＝Kc

采用校正曲线法可测定复合维生素片剂中维生素 B2 含量。

当 pH 在11以上时，荧光猝灭。

图 4 维生素 B2 的激发光谱（a）和荧光光谱（b）

三、仪器与试剂

1．仪器：F96 型荧光分光光度计；容量瓶；移液管。

2．试剂：1％HAc 溶液；维生素 B2；复合维生素片剂。

四、实验步骤

1．维生素 B2 标准溶液的配制

称取 10.0 mg 维生素 B2，先溶解于少量 1％HAc中，然后转移至 1 000 mL容量瓶中，用 1％HAc稀释至刻度，摇匀，即配制成 10.0 μg/mL的维生素 B2 标准溶液。溶液保存在棕色容量瓶中，置阴凉暗处。

2．标准系列溶液的配制

取 5个50 mL的容量瓶，分别加入 1.00、2.00、3.00、4.00 及 5.00 mL 维生素 B2 标准溶液，用水稀释至刻度，摇匀，待测。 3．未知样品溶液的配制

取复合维生素片剂适量，于100 mL小烧杯中，以 1％HAc溶解，转移至 50 mL容量瓶中，以水稀释至刻度，待测。

4．将标准系列溶液及未知样品溶液，分别置于 F96 荧光分光光度计上，选择合适的激发波长和测定波长，测定其荧光强度，绘制工作曲线，查出未知样品中维生素 B2 的含量。

五、数据处理

1．由记录仪记录所得荧光光谱图上查出标准系列不同浓度维生素 B2 相应的荧光强度，作工作曲线。

分子荧光法测定维生素B12含量实验报告

【实验项目】

分子荧光法定量测定维生素B2的含量

【实验目的】

1.掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理。

2.了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，掌握其基本操作。

【实验原理】

荧光是光致发光。任何荧光物质都具有激发光谱和发射光谱，发射波长总是

大于激发波长。荧光激发光谱是通过测定荧光体的发光通量随波长变化而获得的

光谱，反映不同波长激发光引起荧光的相对效率。荧光发射光谱是当荧光物质在

固定的激发光源照射后所产生的分子荧光，是荧光强度对发射波长的关系曲线，

表示在所发射的荧光中各种波长相对强度。由于各种不同的荧光物质有它们各自

特定的荧光发射波长，可用它来鉴定荧光物质。有些发荧光的物质其荧光强度与

物质的浓度成正比，故可用荧光分光光度法测定其含量。

维生素B2溶液在430~440nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535nm

附近。维生素B2在pH=6~7的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素B2

溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测维生素B2的含量。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质一光黄素，光黄素也是一

个能发荧光的物质，其荧光比维生素B2的荧光强得多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。

在稀溶液中，荧光强度F与物质的浓度C有以下关系：

F=2.303ΦT0Ebc

当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系：

F=Kc

【仪器与试剂】

1.仪器：荧光分光光度计（型号：F2500

HITA[H));1cm石英比色皿l:50mL容量瓶

2.试剂：维生素B2标准溶液(10.0μg/mL)(已加乙酸)》

【实验内容与步骤】

1.系列标准溶液和待测溶液的配制

取维生素B2(10.0μg/mL)标准溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL

维生素B2含量的测定

一、实验目的：

学习分子荧光产生的原理；利用荧光分光光度计绘制荧光激发与发射光谱图；学会判断谱图中各种峰的类型的方法。

二、实验原理：

分子吸收短波长（高能量）的光后，能量释放以光的形式出现，而发射较激发光波长更长的荧光。

三、实验内容：

1.维生素B2荧光激发光谱与发射光谱的绘制；

打开软件并打开Edit窗口，根据实验目的设置测定参数。

例如：绘制发射光谱，设定激发波长为377nm（或者454nm），发射波长范围400～700nm。 绘制激发光谱可设定发射波长为527nm，激发波长范围为200～500nm。

根据图形，确定激发光谱和发射光谱荧光峰的位置。

2.维生素B2系列标准溶液的配制；

分别取0.1000g/L标准溶液0.2 、0.4 、0.6 、0.8 、1.0ml定量转移至25ml容量瓶中，用去离子水稀释至25ml。

3.在选定激发波长（1）下测量系列标准溶液的荧光发射光谱，测定在选定波长（2）下的荧光强度并绘制标准工作曲线；

4.维生素B2片的处理：取维生素B2片（约0.065g）一片，用玻璃棒捣碎后定量转移至250ml容量瓶中，然后取5.00ml溶液稀释至25.00ml，在选定激发波长（1）下测量待测溶液的荧光发射光谱，测定在选定波长下（2）的荧光强度并计算维生素B2的浓度（g/L）；

5.根据以上数据，求出维生素B2的含量（以百分比浓度表示x％）。

四、注意事项：

1.绘制标准工作曲线与待测溶液所选定的波长1/2应一致；

2.能正确识别荧光光谱中的干扰峰（拉曼光等）

五、思考题

1. 为何荧光分析的灵敏度通常比紫外可见吸收光谱的灵敏度高2～4个数量级？

2. 具有哪些结构的分子通常具有较高的荧光量子产率？