时间分辨荧光分析法 副本ppt课件

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加样本
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振荡、洗板11加入E Nhomakorabea标12
Eu 标 记 物
轻链 螯合剂
Eu
V
重链
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振荡、洗板
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加入解离增强液
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仪器检测
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标记物为稀土金属---镧系元素
铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝(Tb) 镧系元素荧光特点： 1、荧光寿命极长 • 镧系元素螯合物（60~900 us) <铕：714us> • 普通荧光免疫中荧光团：1~100us • 样本中蛋白质荧光：1~10us，易猝灭 2、Stokes位移大（大约290nm）有利于排除非特异荧光的干扰，增强测 量的特异性。 • 铕：激发光340nm、发射光613nm
TRFIA的反应模式目前应用最广泛的是固相双位点夹心法和竞争法 。 竞争法又有两种：(1)标记抗原与未标记抗原竞争抗体；(2)固体抗原和游 离抗原竞争标记抗体。夹心法一般用于测定蛋白质类大分子化合物，竞 争法多用于检测小分子半抗原。 无论何种反应类型，最终都要形成结合有镧系离子的抗体 - 抗原免疫复 合物。因为稀土离子很难直接与抗原或抗体结合，这就需要在标记待测 物质时采用双功能基团结构螯合剂，此螫合剂必须一端与镧系稀土离子 结合，另一端则与抗体上的自由氨基连接，形成免疫复合物。 由于水的淬灭效应，该免疫复合物在弱碱性缓冲液中经紫外光激发产 生的荧光信号相当弱，可以通过加入增强液解决此问题。该增强液能使 镧系元素从免疫复合物中解离，并和增强液中非离子型的表面活性剂形 成大分子微囊，这种微囊可以最大限度地传递能量，阻断水的淬灭效应 。此时，再用紫外光激发就会产生很强的荧光，增强效果可达上百万倍 。
微生物诊断
由于TRFIA灵敏度高，目前TRFIA已广泛用于各种传染病的诊断及研 究，包括甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、脑炎病毒、A型流感、呼吸道 合胞病毒、轮状病毒、免疫缺陷病病毒及出血热病毒等。

三、HTRF 技术原理
能量受体：XL665和 第二代受体d2
XL665是一种105 kDa的大型杂六聚体，经过分离后交联，以便在HTRF分析中获得更好的稳定性 并保持其光物理特性。与荧光素不同，它与Eu cryptates完全兼容。它是红移的，其发射更可能远离 可能的中等和复合干扰。
d2 是第二代受体，具有与XL665非常相似的一系列光物理性质，但其特征在于比XL665小100倍
五、HTRF 技术实验方法
HTRF的操作步骤
HTRF操作步骤非常简单，只需要将实验所需试剂 加进去，然后孵育，检测即可。
HTRF实验数据分析
HTRF采用了比值法来处理数据，可以去除溶液通透 率、细胞大小、细胞数量不同引起的误差。
PART 03
应用
HTRF 技术的应用
G蛋白偶联受体研究
受体第二信使检测 受体配体结合
三、HTRF 技术原理
HTRF 技术的能量供体和能量受体
HTRF 的供体是铕穴状化合物（ Eu3+ cryptate）（图a） 或Lumi4™铽穴状化合物（ Tb2+ cryptate） （图b，未发表结构），后者是近年与Lumiphore 公司合作的结果，激发效率更高。两者的能量受体 均可为 XL665 和 d2。 XL665 和 d2 激发波长为620nm，发射波长为 665nm，位于红外光区，进一步降 低了生物溶液对实验的影响（生物学成分很少在红外光区有自发荧光）。
胞内信号分子检测
生物标志物检测
基于抗体的夹心法 竞争法检测
01 02
03 04
激酶活性检测
胞外激酶活性检测 胞内激酶活性检测
抗体检测
抗体重链含量测定 抗体轻链含量测定

内部能量转换
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
（二）长共轭结构
λex 205nm 286nm
356nm
λem 278nm 321nm
404nm
φf
0.11
0.29
0.36
结论：π电子共轭程度越大，荧光强度（荧 光效率）越大，荧光波长长移
（三）分子的刚性和共平面性
联苯φf 0.2
C H2
芴φf 1.0
OH O
N
NM g 1 /2
（三）分子的刚性和共平面性
1. 一般情况下，随着温度的升高，溶液中荧光物 质的荧光效率和荧光强度将降低。 2. 原因: 温度升高时，分子运动速度加快，分子 间碰撞几率增加， 使无辐射跃迁增加， 从而降低 了荧光效率
3 酸度对荧光的影响
苯胺在下列哪种条件下荧光强度最强？
A pH＝1
B pH＝3
C pH＝13
D pH＝8
当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的酸 度对荧光强度有较大影响，主要是因为在不同 酸度中分子和离子间的平衡的改变。
硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱
荧光光谱的特征
1、荧光光谱的形状与激发波长无关 产生原因： 荧光发射是从特定的激发态返回基态 荧光光谱的强度与激发波长有关

根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓 度，达到定量分析的目的
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什么是时间分辨免疫荧光技术？
例如：
三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐（Sm)，铽 (Tb) ，镝 (Dy)等，它们的荧光 光谱具有特异性强﹑ Stokes位移大﹑寿命长的特点；
在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异性荧光的抗原抗体复 合物及其存在的部位。
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什么是时间分辨免疫荧光技术？
概念： 时间分辨免疫荧光技术指利用具有双功能基团结构
的螯合剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原）上，经 免疫反应形成复合物，由于镧系元素能发出荧光，故 分离除去未结合的成分后，利用时间分辨荧光仪即可 测定荧光强度，从而推测待测物含量。
钌 无 无 28种临床, 无科研试剂 高
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时间分辨免疫荧光技术优点总结
零本底、灵敏度高 线性范围宽 试剂有效期长 标准曲线稳定性好 易于自动化 对环境及人体没有任何影响
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时间分辨免疫荧光技术的应用
甲状腺功能检测
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特点
技术上的先进性
时间、光谱分辨
特异性荧光与非特异 性荧光分离度高
发射荧光与激发荧 光分离度高
零背景、高特异性
解离、增强
荧光性大大提高 稳定的荧光螯合物
线性范围更宽 重复性更好
标记位点 标记方法
标记位点多 对标记物结构及活性影响小 无衰变 受环境影响小
高稳定性，高精确度 试剂保存时间长 标准曲线保留时间长