ISO标准(参考译文)单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法

单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定引言单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的食源性致病菌，可引起严重的食物中毒和感染疾病。

为了及时诊断和控制该菌的传播，对其进行准确的生化鉴定非常重要。

本文将介绍单核细胞增生李斯特氏菌的生化鉴定方法及相关实验步骤。

实验材料与方法实验材料•单核细胞增生李斯特氏菌培养基•Listeria Enrichment Broth（LEB）•Listeria Agar Base（LAB）•乳清素蛋白水解物培养基（Trypticase Soy Broth，TSB）•乳清素蛋白水解物琼脂培养基（Trypticase Soy Agar，TSA）•碱性亮绿液实验方法1.取一份食物样品，如肉类、奶制品等，加入适量LEB中，并在37℃孵育24小时。

2.取0.1ml培养液，在TSB中进行预培养，37℃孵育24小时。

3.从TSB中取出适量菌液，用胶体金法进行菌落计数，并将菌液稀释至10-4倍。

4.取适量的稀释液分别接种于LAB和TSA琼脂培养基上，并在37℃孵育24小时。

5.观察菌落形态、颜色等特征，并记录下来。

生化鉴定实验单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定步骤如下：1.琼脂凝胶双扩散试验：将单核细胞增生李斯特氏菌抗原与相应的抗血清共同扩散于琼脂凝胶板上，观察是否发生免疫反应。

若有明显的线条或沉淀形成，则说明存在抗原-抗体反应，可以初步判断为单核细胞增生李斯特氏菌。

2.碱性亮绿液试验：将培养基中的单核细胞增生李斯特氏菌与碱性亮绿液接触，观察是否产生绿色荧光。

若产生绿色荧光，则说明菌株具有单核细胞增生李斯特氏菌的特性。

3.单核细胞增生李斯特氏菌脂多糖（LPS）鉴定：采用酚-硫酸法或酚-硝基苯法，将培养基中的单核细胞增生李斯特氏菌进行LPS提取，然后进行比色反应。

若出现红色或紫色沉淀，则说明存在LPS，可以进一步确认为单核细胞增生李斯特氏菌。

结果与讨论通过上述实验方法，我们可以对食物样品中的单核细胞增生李斯特氏菌进行生化鉴定。

单增李斯特氏菌及其检测方法一、单增李斯特氏菌单增李斯特氏菌，学名Listeria monocytogenes，一种革兰氏阳性菌，是李斯特菌属。

李斯特菌属(Listeria)共分为2个群，7个种：第一群包括单核细胞增生性李斯特菌(L monocytogenes，LM)(亦称产单核细胞李斯特菌)、伊氏李斯特菌(L ivanovii)(亦称绵羊李斯特菌)、英诺克李斯特菌(L innocua)(亦称无害李斯特菌)、韦氏李斯特菌(L welshimei)、塞氏李斯特菌(L seeligeri)，第二群包括格氏李斯特菌(L grayi)和莫氏李斯特菌(L mulTayi)。

其中，单增李斯特菌是唯一能引起疾病的人畜共患病的病原菌。

它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

二、单增李斯特氏菌检测方法1.细菌培养法该菌营养要求不高，兼性厌氧，最适在含有CO2的微需氧环境中生长，生长温度范围-1.5℃-45℃，最适温度为30℃-37℃，能在普通冰箱冷藏室生长，是一种典型的耐冷性细菌，同时还具有耐盐性。

LM在普通琼脂平板上呈细小直径约0.2-0.4μm、半透明露水样菌落。

在血琼脂平板上有β溶血环。

在显色培养基上呈蓝绿色。

2.生化鉴定法该菌主要生化特性如下：①触酶阳性；②氧化酶阴性；③发酵多种糖类；④产酸不产气；⑤不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二塘；⑥不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解；⑦吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性；⑧VP、甲基红试验和精氨酸水解试验阳性；⑨对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20分钟可杀死，70%酒精5min、2.5%石碳酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min可杀死此菌。

⑩该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。

3.血清凝集法根据菌体抗原和鞭毛抗原，LM分为16个血清型：1／2a、1／2b、1／2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。

乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析单核细胞（monocytes）是一类存在于人体血液和组织中的白细胞（leukocytes）。

它们作为免疫系统中的重要成分，具有很强的吞噬能力和免疫调节功能。

李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性杆菌，它能够引起严重的人类食物中毒，尤其是婴儿和免疫缺陷患者。

乳粉作为婴幼儿的主要食物，其安全性尤为重要。

为了对乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌的能力进行验证，可以进行以下步骤：1.材料准备:-乳粉样品- 特定培养基（如Listeria Enrichment Broth）-李斯特氏菌（已知培养物）-离心管-培养皿2.试验步骤:a.预处理乳粉样品:-取适量的乳粉样品，加入适量的特定培养基-将混合物在摇床上以适当速度摇匀-使用离心机将样品离心，以除去悬浮的杂质b.培养李斯特氏菌:-取一定量的已知培养物，加入特定培养基中-在适当的温度和湿度下，培养李斯特氏菌至适宜的生长期c.接种乳粉样品:-取适量的乳粉样品，加入特定培养基中-添加已培养的李斯特氏菌（适量）到乳粉样品中-使混合物充分混合d.孵化和观察:-将接种混合物接种到适当的培养皿中-将培养皿置于适当的环境中（温度、湿度等）-在一定时间内观察培养皿中是否有李斯特氏菌的生长3.结果与分析:通过观察培养皿中的生长情况，可以得出以下结论和分析：-如果培养皿中出现了李斯特氏菌的生长，说明乳粉样品中存在单核细胞增生的李斯特氏菌能力。

-如果培养皿中未观察到李斯特氏菌的生长，说明乳粉样品中不存在单核细胞增生的李斯特氏菌能力。

-结果应与对照组进行比较，以确定是否存在显著差异。

需要注意的是，这是仅仅通过培养方法进行初步验证，不能判断乳粉样品的感染风险和食用安全性。

为了更准确地评估乳粉中李斯特氏菌的存在和潜在传播风险，还需要进一步的实验和分析方法，如PCR检测、测定菌群数量等。

同时还应结合临床和流行病学调查数据，做出综合评估和判断。

单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定
李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性杆菌，是一种常见的细菌性食物中毒病原体。

单核细胞增生组织均为生化鉴定的一种常见方法。

以下是李斯特氏菌生化鉴定的一些特征：
1. 嗜冷性：李斯特氏菌生长适宜温度为2-45℃，菌株能够在4℃下生长，并在冷藏食品中繁殖。

2. β-溶血素产生：李斯特氏菌能够产生β-溶血素，可以通过血琼脂（Blood agar）培养基上的溶血环进行观察。

3. 乳酸发酵：李斯特氏菌是一种革兰氏阳性乳酸菌，能够进行乳酸发酵。

可以使用乳糖发酵基质（Lactose fermentation medium）进行鉴定，如果产生乳酸则为阳性。

4. 半胱氨酸脱羧：李斯特氏菌具有半胱氨酸脱羧酶活性，可以将半胱氨酸转化为硫代氨基酸。

可使用兰氏差异培养基（LDC medium）进行鉴定。

5. 半乳糖酶活性：李斯特氏菌具有半乳糖酶活性，可以将乳糖转化为半乳糖。

可使用半乳糖发酵基质（Rhamnose fermentation medium）进行鉴定。

此外，李斯特氏菌还可以进行PCR扩增目标基因进行鉴定，
如16S rRNA基因、Internal Transcribed Spacer（ITS）区域等。

需要指出的是，单纯进行生化鉴定可能存在一定的误判率，结合其他检测方法可以提高鉴定的准确性。

此外，由于李斯特氏菌在环境中广泛存在，饮食中也常常带菌，所以对于临床病例的确诊还需要结合患者的临床表现、流行病学调查等综合分析。

单核增生李斯特氏菌检测概述单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性的致病菌，能够在低温下生存繁殖，并在恶劣环境中形成生物被膜，使其对抗不良条件。

该菌可引起人类的李斯特菌病（Listeriosis），也是一种可以通过食品传播的重要病原体。

李斯特菌病在免疫功能低下的人群中很容易引起严重感染，包括孕妇、老年人、免疫抑制患者和新生儿。

检测单核增生李斯特氏菌的方法主要包括传统的培养方法和现代的分子生物学方法。

1.传统培养方法传统的培养方法是检测单核增生李斯特氏菌的主要方法之一、常用的培养基包括PALCAM（Polymyxin, Acriflavine, Lithium chloride and Cycloheximide）和OXOID Listeria Selective Agar等。

培养温度通常在30-37℃之间，因为单核增生李斯特氏菌可以在低温下生长。

在培养过程中，从食品样品或其他可能受污染的样品中提取菌落，并在培养基上进行培养。

培养时间通常为1-2天，培养过程中需要注意去除其他菌落的干扰。

2.分子生物学方法分子生物学方法是现代检测单核增生李斯特氏菌的常用方法，主要包括聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR等。

这些方法的优势在于其高度敏感性和特异性。

通过检测单核增生李斯特氏菌特有的基因或序列，可以快速准确地鉴定与检测其存在。

3.培养与分子生物学相结合的方法为了更好地检测单核增生李斯特氏菌，有些方法将传统培养与分子生物学相结合。

这种方法通常先进行培养，然后使用PCR或实时荧光定量PCR等技术进行进一步检测和鉴定。

这种方法较为耗时，但能够进一步提高检测的准确性。

需要注意的是，由于单核增生李斯特氏菌能够在低温下生存，因此在食品或样品中的检测非常重要。

常见的食品样品包括生肉、海鲜、冷冻食品、奶制品等。

对于食品企业来说，建立完善的食品安全管理体系和进行规范的监测是防止单核增生李斯特氏菌传播的重要措施。

国标标准 ISO11290-1 1996（E）食品和动物饮料微生物学----单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法------第一部分检测方法1.范围2.参考标准3.定义4.原理5.培养基和试剂6.设备和玻璃器皿7.取样8.待检样品前处理9.程序10.结果表达11.检测报告附录：A.检测程序图B.培养基和试剂的组成和配制C.亨氏斜射光镜检食品和动物饮料微生物学----单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法------第一部分检测方法警告：为了保障实验室人员的健康，强烈推荐在适当装备、由有经验的微生物专家控制以及检测中的所有培养物得以谨慎处理的实验室进行单核增生李斯特氏菌检测；尤其是强烈建议孕妇不要从事单核增生李斯特氏菌的培养工作。

1.范围本ISO11290详细说明了单核增生李斯特氏菌检测和计数方法。

在绪论中受讲座的局限性，本ISO11290适用于供给人类消费或作为动物饲料的产品。

2.参考标准下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

IEC和ISO成员保留目前有效的国际标准的注册。

ISO6887：1983微生物学—微生物检测中稀释液制备的一般导则ISO：1996，食品及动物饲料微生物学—微生物检测通则3.定义本部分ISO11290提供以下定义：3.1单核增生李斯特氏菌：在因体选择性培养基上形成典型菌落，并且当进行鉴定和确认其形态的、生理的和生化特征与本部分ISO11290的描述一致的微生物。

3.2单核增生李斯特氏菌的检测：依据本部分ISO11290实施细则确定单核增生李斯特氏菌在给定单位质量或体积的样品中存在与否。

4.原理在本部分ISO11290的限定范围内，检测单核增生李斯特氏菌需要四个连续的阶段（见附录A检测程序图）。

单增李斯特氏菌及其检测方法一、单增李斯特氏菌单增李斯特氏菌，学名Listeria monocytogenes，一种革兰氏阳性菌，是李斯特菌属。

李斯特菌属(Listeria)共分为2个群，7个种：第一群包括单核细胞增生性李斯特菌(L monocytogenes，LM)(亦称产单核细胞李斯特菌)、伊氏李斯特菌(L ivanovii)(亦称绵羊李斯特菌)、英诺克李斯特菌(L innocua)(亦称无害李斯特菌)、韦氏李斯特菌(L welshimei)、塞氏李斯特菌(L seeligeri)，第二群包括格氏李斯特菌(L grayi)和莫氏李斯特菌(L mulTayi)。

其中，单增李斯特菌是唯一能引起疾病的人畜共患病的病原菌。

它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

二、单增李斯特氏菌检测方法1.细菌培养法该菌营养要求不高，兼性厌氧，最适在含有CO2的微需氧环境中生长，生长温度范围-1.5℃-45℃，最适温度为30℃-37℃，能在普通冰箱冷藏室生长，是一种典型的耐冷性细菌，同时还具有耐盐性。

LM在普通琼脂平板上呈细小直径约0.2-0.4μm、半透明露水样菌落。

在血琼脂平板上有β溶血环。

在显色培养基上呈蓝绿色。

2.生化鉴定法该菌主要生化特性如下：①触酶阳性；②氧化酶阴性；③发酵多种糖类；④产酸不产气；⑤不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二塘；⑥不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解；⑦吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性；⑧VP、甲基红试验和精氨酸水解试验阳性；⑨对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20分钟可杀死，70%酒精5min、2.5%石碳酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min可杀死此菌。

⑩该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。

3.血清凝集法根据菌体抗原和鞭毛抗原，LM分为16个血清型：1／2a、1／2b、1／2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。

食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法的探讨张慧珍（谱尼测试集团股份有限公司，北京 100194）摘 要：单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种人畜共患病的病原菌，是一种常见的土壤细菌，能引起严重食物中毒，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

单核细胞增生李斯特氏菌广泛存在于自然界中，食品中存在的单核细胞增生李斯特氏菌对人类的安全具有一定的威胁，该菌在4 ℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品中威胁人类健康的主要病原菌之一。

本文通过采用国家标准检测方法《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30—2016）对大量肉、奶、蛋和水产品等产品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测，总结了一些食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测经验，主要从试剂准备、增菌、划线分离及生化鉴定等方面阐述了对单核细胞增生李斯特检测的一些理解，以期为食品检测工作中单核细胞增生李斯特氏菌的检测提供部分参考。

关键词：食品；单核细胞增生李斯特氏菌；国标检测方法Discussion on Detection Method of Listeria monocytogenes in FoodZHANG Huizhen(Pony Testing Group International Co., Ltd., Beijing 100194, China) Abstract:Listeria monocytogenes is a zoonotic pathogen. It is a common soil bacterium that can cause serious food poisoning. After infection, it is mainly manifested in sepsis, meningitis and mononucleosis. It exists widely exists in nature. Listeria monocytogenes in food is dangerous to human safety. The bacteria can still grow and reproduce in the environment of 4 ℃, and it is one of the main pathogenic bacteria that threaten human health in refrigerated food. By using the national standard detection method GB 4789.30—2016 to detect Listeria monocytogenes in a large number of meat, milk, eggs and aquatic products, this paper summarizes the detection experience of Listeria monocytogenes in some foods, and expounds some understandings of Listeria monocytogenes detection mainly from the aspects of reagent preparation, enrichment, lineation separation and biochemical identification, in order to provide some reference for the detection of Listeria monocytogenes in food testing.Keywords: food; Listeria monocytogenes; national standard detection method李斯特氏菌属隶属革兰氏阳性细菌中厚壁菌门，李斯特氏菌属可划分为6个菌种，即单核增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）、英诺克李斯特氏菌（L. innocua）、斯氏李斯特氏菌（L. seeligeri）、威尔斯特氏菌（L. welshimeri）、伊氏李斯特菌（L. ivanovii）和格氏李斯特菌（L. grayi）[1]。

单核细胞增生李斯特氏菌检验检测细则1、目的根据《中华人民共和国国家标准》GB/T4789.30-2003单核细胞增生李斯特氏菌检验进行单核细胞增生李斯特氏菌检验。

2、适用范围适用于食品和食物中毒样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。

3、职责检测人员负责按照本规程对被测样品进行检测；校核人员负责对检测操作人员是否规范以及检测结果是否准确进行审核；授权签字人负责综合管理和检测报告的签发。

4、试剂及器材4.1 单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株4.2 马红球菌4.3 小白鼠：16-18g4.4 TSB-YE4.5 TSA-YE4.6 EB增菌液4.7 李氏增菌液（LB1，LB2）4.8 三糖铁琼脂4.9SIM动力培养基4.10 琼脂4.11 改良的Mc Bride琼脂（MMA）4.12 硝酸盐培养基4.13 缓冲葡萄糖蛋白胨水4.14 糖发酵培养基4.15 过氧化氢4.16 1%盐酸丫啶黄溶液4.17 1%萘啶酮酸盐溶液5、仪器设备5.1 恒温培养箱：30±1℃、24℃±1℃5.2 恒温水浴锅：46±1℃5.3 离心机：4000r/min5.4 显微镜5.5 均质器6、检测步骤6.1样品的收集及处理：无菌取样25g（ml）放灭菌均质器中加225mlEB和LB1增菌液中，充分搅拌成均质。

如不能及时检验，可暂存4℃冰箱。

6.2增菌培养：EB增菌液30℃培养48小时，LB1增菌液225ml放30℃培养24小时，吸取0.1ml，加入10ml LB2增菌液中二次增菌。

6.3分离培养：将EB增菌液和LB2二次增菌分离于选择培养基MMA琼脂平板上，培养30℃48小时，挑选可疑菌落，用白织灯45。

角斜光照射平板。

6.4选五个以上的上述可疑菌落接种三糖铁琼脂和SIM动力培养基，培养于25℃。

一般观察2天-7天，阳性者可做下一步鉴定。

6.5纯培养：将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培养基上层、下层的产酸而不产硫化氢的可疑培养物接种于TSA-YE上纯培养，做以下鉴定。

ISO李斯特菌1、国标标准ISO11290-11996〔E〕食品和动物饮料微生物学----单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法------第一部分检测方法1.范围2.参考标准3.定义4.原理5.培育基和试剂6.设备和玻璃器皿7.取样8.待检样品前处理9.程序10.结果表达11.检测报告附录：A.检测程序图B.培育基和试剂的组成和配制C.亨氏斜射光镜检食品和动物饮料微生物学----单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法------第一部分检测方法警告：为了保障试验室人员的健康，剧烈推举在适当装备、由有阅历的微生物专家掌握以及检测中的全部培育物得以谨慎处理的试验室进行单核增生李斯特氏菌检测；尤其是剧烈建议孕妇不要从事单核增生李斯特氏菌的2、培育工作。

1.范围本ISO11290具体说明了单核增生李斯特氏菌检测和计数方法。

在绪论中受讲座的局限性，本ISO11290适用于供给人类消费或作为动物饲料的产品。

2.参考标准以下文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后全部的修改单〔不包括勘误内容〕或修订版均不适用于本标准，然而，鼓舞依据本标准达成协议的各方讨论是否可使用这些文件的最新版本。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

IEC 和ISO成员保存目前有效的国际标准的注册。

ISO6887：1983微生物学—微生物检测中稀释液制备的一般导则ISO：1996，食品及动物饲料微生物学—微生物检测通则3.定义本部分ISO3、11290提供以下定义：3.1单核增生李斯特氏菌：在因体选择性培育基上形成典型菌落，并且当进行鉴定和确认其形态的、生理的和生化特征与本部分ISO11290的描述一致的微生物。

3.2单核增生李斯特氏菌的检测：根据本部分ISO11290实施细则确定单核增生李斯特氏菌在给定单位质量或体积的样品中存在与否。

4.原理在本部分ISO11290的限定范围内，检测单核增生李斯特氏菌需要四个连续的阶段〔见附录A检测程序图〕。