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新生大鼠缺氧缺血性脑损伤时Ｂｃｌ－2蛋白表达的研究【摘要】目的：通过研究新生大鼠脑缺血时bcl-2蛋白在海马区的表达特点，探讨bcl-2蛋白在缺血缺氧性脑损伤（HIBD）的作用。
方法：56只7日龄新生SD大鼠随机分为1个对照组和7个实验组。
给动物吸入含有92％氮气和8％氧气混合气体建立新生大鼠HIBD动物模型，分别在脑损伤后不同时间点(0.5、1、3、6、12、24、48、72 h等)断头处死动物，取海马组织，用免疫组织化学方法检测海马脑神经细胞凋亡及bcl-2蛋白表达情况。
结果：TUNEL染色的阳性细胞数与bc1-2蛋白阳性的细胞数在HIBD后的不同时间点出现分别有显著差异，海马区bcl-2蛋白阳性细胞在HIBD后立即出现，6 h达到高峰，之后渐下降。
结论：bcl-2蛋白强表达于海马缺血区和缺血周边区的神经元，与神经元的存活或死亡有一定联系。
【关键词】新生大鼠；脑缺氧缺血；bcl-2基因；细胞凋亡脑组织对缺氧极为敏感，神经细胞极易因低氧缺血而受到损伤，如何提高脑组织对低氧缺血损伤的耐受性，是当前一个热门研究课题。
新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(hypoxic ischemic brain damage，HIBD) 导致的继发性神经元死亡、丢失与细胞凋亡有关。
Bcl-2(称为B细胞淋巴瘤/白血病-2) 是从小鼠细胞淋巴瘤中分离得到的原癌基因，是已被发现的与细胞凋亡关系密切的基因，可在中枢神经系表达[1]。
本研究用新生大鼠HIBD模型，采用免疫组织化学法来研究Bcl-2蛋白在缺氧缺血（hypoxic ischemic，HI）后脑海马区组织中表达的动态变化，探讨bcl-2基因在HIBD后神经元凋亡中的作用，对HIBD的临床治疗提供理论依据。
1 资料与方法1．1 实验动物与分组：7日龄SD大鼠56只(由沈阳医学院实验动物中心提供)，体重（15±1．6）g，雌雄兼用，随机分为1个对照组和7个实验组，每组7只。
含抵当汤脑脊液对海马神经元阿尔茨海默病细胞模型Bcl-2、Bax基因表达的影响李国徽;贾孟辉;宋秀娟;陈凌;彭莉君【摘要】目的研究含抵当汤脑脊液对离体海马神经元阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)模型Bcl-2、Bax基因表达的影响.方法选用体外培养成熟的大鼠海马神经细胞,经Aβ25～ 35老化处理为AD细胞模型,用含不同浓度抵当汤的脑脊液进行干预后,提取总RNA.应用RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳方法测定Bcl-2、Bax mRNA的表达.结果含抵当汤脑脊液能上调Bcl-2 mRNA、下调Bax mRNA表达水平,以含中剂量抵当汤脑脊液组(1g· mL-1)效果优于高剂量组(2g ·mL-1)、低剂量组(0.5g· mL-1)和维生素E组.结论含抵当汤脑脊液对经Aβ25 ～35老化处理的海马神经元AD细胞模型Bcl-2、Bax的mRNA表达有影响.【期刊名称】《宁夏医科大学学报》【年(卷),期】2014(036)008【总页数】4页(P846-848,852)【关键词】抵当汤;阿尔茨海默病;Bcl-2;Bax【作者】李国徽;贾孟辉;宋秀娟;陈凌;彭莉君【作者单位】宁夏医科大学附属银川市中医医院,银川750001;宁夏医科大学第二附属医院,银川750001;宁夏医科大学附属银川市中医医院,银川750001;宁夏医科大学总医院,银川750004;宁夏医科大学附属银川市中医医院,银川750001【正文语种】中文【中图分类】R592阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是一种进行性的神经系统退行性疾病，其主要临床特征为进行性记忆和认知功能的障碍。
随着人口老龄化的快速发展，AD已成为仅次于心血管病、癌症和脑卒中的一种危及老年人生命的疾病，因此，积极地研究和开发安全有效的防治方法和药物，提高AD患者的生存质量，具有重要的社会意义。
Bcl-2基因转染对骨髓间充质干细胞体外模拟缺血性损伤保护作用的实验研究Bcl-2基因转染对骨髓间充质干细胞体外模拟缺血性损伤保护作用的实验研究目的观察Bcl-2基因转染对骨髓间充质干细胞(MSCs)体外模拟缺血性损伤的保护作用,从而为下一步Bcl-2基因修饰的MSCs移植治疗脑缺血的实验研究奠定基础.方法采用密度梯度离心结合贴壁法分离、培养大鼠MSCs,对培养第5代的MSCs进行鉴定;用脂质体转染法对MSCs行人Bel-2(hBcb2)基因转染,转染后用G418进行筛选,然后用免疫荧光细胞化学技术检测其蛋白的表达;采用血清剥夺和缺氧(SOD)处理建立MSCs体外模拟缺血性损伤模型,通过流式细胞术和TUNEL原位细胞凋亡检测评价转染hBcl-2基因的MSCs和未转染的MSCs的凋亡及存活情况.结果密度梯度离心结合贴壁法能有效分离、纯化大鼠MSCs,免疫组化检测显示培养的细胞CD44、CD71表达阳性,而CD45表达阴性;转染hBcl-2基因的MSCs经G418筛选后有hBd-2蛋白的稳定、高效的表达;流式细胞术检测显示和MSCs相比,转染hBcb2基因的MSCs在SOD后及9h凋亡细胞较少,存活细胞较多.TUNEL原位细胞凋亡检测也显示转染hBcl-2基因的MSCs的凋亡明显减少(P<0.05).结论转染hBcl-2基因的MSCs有其蛋白的稳定表达,hBcl-2基因转染可对抗MSCs体外模拟缺血性损伤引起的细胞凋亡,从而具有保护性作用.作者：张小乔梅元武张红郑丽芳郭远瑾徐江华作者单位：张小乔(郧阳医学院附属十堰市太和医院神经内科)梅元武,张红,郑丽芳,郭远瑾,徐江华(华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科,武汉,430022)刊名：卒中与神经疾病ISTIC英文刊名：STROKE AND NERVOUS DISEASES 年，卷(期)：2008 15(3) 分类号：Q813 R743 关键词：Bcl-2 基因转染骨髓间充质干细胞缺血性损伤保护作用。
脂肪来源的干细胞移植对大鼠脑缺血神经细胞凋亡及bcl-2、caspase-12 表达的影响硕士研究生：林小惠导 师： 刘 楠 教授中文摘要目的：观察脂肪来源的干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)移植对大鼠脑缺血后神经细胞凋亡的影响，以探讨ADSC移植对大鼠脑缺血后神经细胞凋亡的影响及其机制，为ADSC移植治疗脑缺血性疾病及其机理提供实验依据。
方法：1、体外分离培养ADSCs，流式细胞仪检测其表面标志。
2、实验动物分组：大鼠随机分为假手术组（Sham组），局灶性脑缺血组（MCAO 组），溶剂对照组（vehicle组）和MCAO +ADSC治疗组（ADSC组）。
每组再分4 d、7 d、14 d三个亚组，每组6只。
3、参考改良Zea-Longa线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）局灶性脑缺血模型。
4、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)，体外标记ADSC。
5、ADSC移植：ADSC组于造模成功1d后经侧脑室注射入ADSC（内含1×106细胞数），vehicle组注射等量磷酸缓冲盐溶液（phosphate-buffered saline，PBS）。
6、取材与检测：术后4d、7d和14d大鼠大脑灌注、取材、切片；荧光显微镜观察DAPI标记的ADSC在体内存活情况；采用TUNEL法检测神经细胞凋亡；半定量RT-PCR法和免疫组织化学法检测bcl-2、caspase-12表达情况。
7、统计学分析。
结果：1、所培养的第3代细胞流式细胞仪检测高表达ADSC表面标志分子CD90,而极低表达造血细胞表面分子CD106和CD34。
2、ADSC组缺血周边区的纹状体及额顶皮质下脑组织中可观察到DAPI标记的的阳性细胞。
3、TUNEL法检测神经细胞凋亡结果显示大鼠脑缺血后缺血周边区即可见大量细胞凋亡。
银杏达莫对大鼠局灶性脑缺血神经细胞凋亡及Bcl－2、Bax蛋白表达的影响【摘要】目的观察银杏达莫对局灶性脑缺血大鼠大脑缺血坏死区周边抑凋亡基因蛋白Bcl2和促凋亡基因蛋白Bax表达的影响。
方法①选用健康成年Wistar大鼠20只。
体质量270~300 g。
②按随机抽签法将大鼠分为2组：缺血对照组、银杏达莫治疗组，每组10只。
③术后6 h用免疫组化染色统计Bcl2和Bax表达阳性细胞数。
结果银杏达莫治疗组较缺血对照组缺血坏死区周边脑组织Bcl2的含量有明显增加，而Bax的含量则明显减少。
结论银杏达莫可对局灶缺血性脑损伤起到预防性保护作用，其保护作用发生可能与提高Bcl2表达、抑制Bax表达有关。
【关键词】银杏达莫；凋亡；Bcl2；Bax缺血性脑血管疾病在临床上发病率、致残率高，是我国临床患者主要的病死原因之一。
凋亡是脑缺血后神经元死亡的重要方式，目前认为细胞凋亡受Bcl2、Bax等多种凋亡相关基因的调控。
而银杏达莫能减轻神经细胞凋亡，但机制尚不完全清楚。
本实验研究银杏达莫对大鼠局灶性脑缺血后神经细胞凋亡及Bcl2、Bax蛋白表达的影响。
现报告如下。
1资料与方法11一般资料材料选用鼠龄3个月左右，体重270～300 g的健康雄性Wistar大鼠20只(由山东大学医学院动物实验中心提供)，随机分为缺血对照组、缺血6 h组，每组10只动物。
缺血后6 h组于术后20 min经腹腔注射银杏达莫(山西普德药业股份有限公司)04 ml/kg；对照组腹腔注射生理盐水，注射总量皆为04 ml／kg。
皆于术后6 h断头取脑。
12方法121动物模型制备大鼠大脑中动脉缺血模型参考改良Nagasawa法。
122切片的制备实验动物在缺血6 h后以多聚甲醛经心脏灌注固定，断头取脑，再以多聚甲醛固定24 h。
常规脱水、透明、石蜡包埋，视交叉平面冠状切开制成2 mm 厚的组织块。
123①常规HE染色病理检查。
②Bcl2和bax免疫组化染色Bcl2及Bax 试剂盒购于武汉博士德公司，具体操作按说明书进行。
大鼠脑皮层冲击伤中BCL-2、BAX的表达变化任东青;王琦;赵涛;张杰;曾桂英【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2008(028)004【摘要】目的探讨爆炸冲击伤中大鼠脑皮层BCL-2、BAX基因表达的变化规律.方法应用爆炸冲击波致伤大鼠,致伤后不同时间(12～96h),光镜和电镜观察脑皮层形态变化;免疫组织化学方法观察BCL-2和BAX蛋白在脑皮层表达;凝胶电泳法观察大鼠脑组织DNA电泳结果.结果爆炸后12～96 h,光镜和电镜观察脑皮层细胞凋亡改变增多;爆炸后24 h脑组织曰BCL-2、BAX基因表达阳性细胞率均最高(P<0.01),BCL-2/BAX表达比值随时间延长而降低(P<0.01);脑组织DNA电泳在爆炸后12、24和48 h组形成典型阶梯状条带;上述改变以24 h组最明显.结论爆炸冲击伤可导致部分脑皮层神经元的细胞凋亡,BCL-2和BAX表达比值下降.【总页数】5页(P335-339)【作者】任东青;王琦;赵涛;张杰;曾桂英【作者单位】解放军第四军医大学军事预防医学系放射医学教研室,陕西,西安710032;解放军第四军医大学西京医院,急诊科,陕西,西安,710033;解放军第四军医大学军事预防医学系放射医学教研室,陕西,西安710032;解放军第四军医大学军事预防医学系放射医学教研室,陕西,西安710032;解放军第四军医大学军事预防医学系放射医学教研室,陕西,西安710032【正文语种】中文【中图分类】R826【相关文献】1.Bcl-2、Bax及caspase-9在鼻息肉组织中的表达变化 [J], 徐芬;康健;陈冬;马晓峰2.全身亚低温对全脑缺血再灌注大鼠脑保护作用与Bcl-2、Bax表达变化的关系[J], 孙茂军;董瑞国;袁宝强;耿德勤;沈霞;曾因明3.环烯醚萜苷对大鼠脑梗死后NF-κB与凋亡调节因子Bcl-2/Bax表达变化的影响[J], 李春阳;李林;李宇航;艾厚喜;张丽4.乳腺浸润性导管癌组织中Bag-1、Bcl-2、Bax的表达变化及意义 [J], 张印春;张丽娜;齐立强;顾林;付丽;范宇5.Bax/Bcl-2表达变化在HDAC抑制因子TSA诱导脑胶质瘤细胞凋亡中的作用机制研究 [J], 周飞; 夏伟伟; 孙王男; 史美燕; 齐福; 王凤芹; 王宪伟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
严重颅脑损伤后细胞凋亡状态及相关基因Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ表达的研究浙江大学医学院研究生研究生导师中文摘要外科学（神经外科）李谷刘伟国教授随着经济和交通手段的日益发展，颅脑损伤的发生率和因伤致死率、致残率均逐年增加。
从分子水平对颅脑损伤后可能存在的基因和蛋白表达异常进行研究，有助于进一步阐明颅脑损伤的机理，从而指导ｌ临床治疗，提高颅脑损伤的治愈率、降低死亡率和致残率。
细胞凋亡（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ），又称程序性细胞死亡（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈ，Ｉ＇ＣＤ）。
它是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的生理性死亡。
细胞凋亡是多细胞生物生命过程中不可缺少的部分，它是保证多细胞生物个体正常发育成熟和维持正常生理过程所必须的。
当组织细胞凋亡异常（过高或过低）时，可导致各种疾病的发生。
Ｂｃｌ．２（Ｂｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｍａ／ｌｅｕｋｅｍｉａ２）和Ｂａｘ（Ｂｃｌ一２ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｘ）均为细胞凋亡的调控基因，在细胞凋亡发生中起重要作用。
Ｂｄ－２基因编码２６ＫＤ的膜蛋白，主要存在于线粒体外膜上，Ｂｄ－２的过量表达能抑制多种因素诱导的细胞凋亡。
Ｂａｘ基因编码一个２１ＫＤ的蛋白，Ｂａｘ蛋白以同源二聚体的形式存在，但Ｂａｘ的作用与Ｂｅｌ－２完全相反，［划Ｂｓｘ二聚体在体内过量表、达时，可促进细胞凋亡。
｛本课题采用５０只健康ＳＤ雄性大鼠并用改进的Ｆｅｅｎｅｙ自由ｌ落体损伤装置进行致伤打击，应用分子生物学方法——脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（ｔｅｒｍｉｎａｌ－ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｍｅｄｉａ钯ｄｎｉｃｋｅｎｄｌａｂｅｌｉｎｇ，ＴＵＮＥＬ）以及免疫组织化学方法（ＳＰ法），分别于损伤后６小时、１２小时、２４小时、７２小时和１６８小时（７天）对损伤脑组织中的细胞凋亡状态和Ｂｃｌ一２、Ｂａｘ免疫反应阳性的细胞进行观察、计数、并进行统计学处理，从分子水平来探讨细胞凋亡状态及Ｂｃｌ．２、Ｂａｘ蛋白的表达与严重颅脑损伤的关系，以阐明创伤性颅脑损伤的损伤机理，为临床上颅脑外伤的救治提供新的思路。
观察大鼠全脑缺血后脑组织Bcl-2 Fas基因表达相关性的进展全脑缺血在临床上多发生于心律失常、心肌梗死以及休克等造成的脑部血液灌流量低,缺血范围广。
大鼠全脑缺血动物模型与临床上脑缺血虽不完全相同,但全脑缺血后Bcl-2、Fas蛋白表达情况的研究对于临床上在脑缺血后的治疗方面具有指导意义。
同时研究Bcl-2和Fas蛋白在缺血损伤细胞中的表达,并发现二者在表达上存在的内在相互关系,目前在国内还是首例,如果能将研究结果运用到临床实践工作中,在损伤细胞中促进Bcl-2蛋白表达,阻止Fas蛋白在损伤细胞中的表达,那么就能够挽救“半暗带”中的细胞生命,使缺血损伤细胞数量减少在最小范围内,这正是本实验的价值和临床意义所在。
1材料与方法1.1实验材料1.1.1实验动物健康成年雄性Wistar大鼠77只,体重 280～340g。
1.1.2主要试剂麻醉剂、光镜灌注液及固定液、染色剂、免疫组化试剂:兔抗大鼠Bcl-2抗体、兔抗大鼠Fas抗体、SABC试剂盒。
1.2实验方法1.2.1分组将77只大鼠随机分为:正常组、假手术组、单次缺血8min组,分别于缺血后2h、6h、14h、24h、2天、3天、5天、7天、14天,于不同时间点处死大鼠,每组7只,总共分组11组。
1.2.2手术称重、麻醉、暴露并分离颈总动脉和迷走神经、电凝椎动脉、夹闭缺血:24h后夹闭双侧颈总动脉,造成4血管闭塞全脑缺血,缺血8min。
处死:在缝合后2h、6h、14h、24h、2天、3天、5天、7天、14天,不同时间点处死大鼠,取脑进行48h外固定。
正常组7只大鼠不做任何处理。
假手术组7只,手术操作程序与实验组相同,电凝椎动脉后,不做颈总动脉夹闭,亦于不同时间点处死大鼠。
1.3免疫组化标本制备取材、脱水、透明、浸蜡、包埋粘块、切片、免疫组化采用SABC法,Bcl-2单克隆抗体,Fas单克隆抗体,Ⅰ抗和Ⅱ抗工作液均购于武汉博士德公司。
1.4光镜下观测2结果2.1免疫组化结果Bcl-2和Fas蛋白表达,在放大400倍的显微镜下,观察同一位的皮层、海马的神经细胞及神经胶质细胞的阳性细胞情况,表示结果的方法是:(-)表示:几乎没有Bcl-2和Fas蛋白表达,阳性细胞数≤10%;(+)表示:少量Bcl-2和Fas蛋白表达,阳性细胞数在10%～40%之间;(++)表示:中等度、较多Bcl-2和Fas蛋白表达,阳性细胞数在40%～70%之间;(+++)表示:最强烈Bcl-2和Fas蛋白表达,阳性细胞在70%～100%之间。
雌激素对大鼠颅脑创伤后脑组织伤区Bcl-2和Bax表达的影响【摘要】目的探讨雌激素是否通过影响大鼠颅脑创伤后脑组织伤区Bcl-2和Bax表达,起到脑保护作用。
方法采用改良的Feeney自由落体脑损伤模型, 将60只Wistar健康雄性大鼠随机分为治疗组、对照组和外伤组,治疗组的大鼠用苯甲酸雌二醇治疗。
应用HE染色检测脑组织和应用免疫组织化学方法检测伤区脑组织Bcl-2及Bax的表达变化,并且计算出Bcl-2和Bax表达的比值。
结果治疗组Bcl-2表达高于对照组和创伤组(P＜0.05),创伤组和对照组差异无统计学意义(P ＞0.05)。
三组的Bax表达相互比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
治疗组Bcl-2和Bax表达的比值高于对照组和外伤组。
结论雌激素可能是通过促进Bcl-2表达来减少颅脑损伤后神经细胞的凋亡,发挥脑保护作用。
【Abstract】Objective To investigate whether estrogen do have the brain protective function,by regulated the expression of Bcl-2 and Bax on the impaired brain tissue of rats with traumatic head injury(TBI). Methods TBI model was established according to Feeney’s method. Sixtymale rats were divided into 3 groups, i.e. treatment group, control group and wound group. The male rats were treatment by injection of estrogen in the treatment group. The brain tissue was determined by Hematoxylin and eosin(HE)staining and image analysis. Expressions of Bcl-2 and Bax in the brain tissue were determined respectively by immunohistochemical technique in all the rats and Bcl-2 and Bax expression’s ratio is calculated. Results The expression of Bcl-2 was significantly higher in the treatment group than the control group and the wound group (P＜0.05).There was no significant difference between the expression of Bcl-2 in the control group and that of Bcl-2 in the wound group (P＞0.05). There were no significant differences in the expression of Bax among the three groups at every stage (P＞0.05). The expression’s ratio of the treatment group’s Bcl-2 and Bax is higher than that of the control group and that of the wound group. Conclusion Estrogen can reduce the neural apoptosis of impaired brain tissue after TBI in rats through promoting the expression of Bcl-2.【Key words】Traumatic head injury; Estrogen; Bcl-2; Bax越来越多的证据表明,性别差异对脑损伤预后有明显影响,并认为雌激素可能具有脑保护作用[1,2]。
・实验研究・大鼠脊髓急性损伤后bax 和bcl 22的表达△傅 强 侯铁胜 鲁凯伍 李 明 赵 杰 贺石生 石志才 摘 要 目的:检测大鼠脊髓损伤后凋亡相关基因的表达,以探讨神经细胞凋亡的分子机制。
方法:大鼠脊髓(T 8.9)经中度压迫损伤后,分别在30min 、2h 、4h 、8h 、24h 、48h 和72h 处死取材(n =6)。
主要应用免疫组化及原位杂交技术对脊髓组织进行标记,以检测bcl 22和bax 的表达。
结果:损伤4h 后bax 蛋白大量表达,而bcl 22蛋白仅有少量表达,bcl 22mRNA 未见表达。
结论:脊髓损伤后凋亡基因bax 大量表达,并可能在神经细胞的凋亡过程中起重要作用。
关键词 凋亡; bax ; bcl 22; 脊髓损伤中图分类号 R683.2 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2001)03-0259-02Expression of b ax and bcl 22after Acute Compression Injury to R at Spinal Cord ∥FU Qiang ,HOU Tie 2sheng ,L U Kai 2w u ,et al.Depart ment of Orthopaedics ,Changhai Hospital ,the Second Military Medical U niversity ,S hanghai ,200433.Abstract Objective :We determined the expression of apoptosic correlative genes after spinal cord compression injury ,to study the molecular mechanism of neuronal a poptosis.Methods :Following a controlled ,moderate degree compression injury to the lower thoracic s pinal cord (T 8、9),rats were killed at 30min ,2,4,8,24,48or 72hours after injury (n =6per group ).Three segments of every spinal cord were cut for morphological studies ,including hematoxylin and eosin staining ,Nissl staining ,im 2munohistochemical staining and in situ hybridization methods.Results :Proteins Bax ex pressed at 4h after s pinal cord injury.But Bcl 22immunoreactivity was present in the lesion region with low expression ,and bcl 22mRNA without expression.Conclu 2sion :There exist high expression of apoptosic correlative genes bax after s pinal cord injury ,it may play an important role in in 2duction of neuronal cells to apoptosis.K ey w ords Apoptosis ; bax ; bcl 22; Spinal cord injury (SCI )△本课题受上海市科委基金资助 项目号:97XD14015作者单位:第二军医大学附属长海医院骨科,上海 200433作者简介:傅 强(19712),男,江苏南京人,主治医师,医学博士。
DMSO对脑损伤后Bcl-2基因表达影响的实验研究李旭光1 陈 光1 游 潮2摘 要 目的:探讨二甲基亚砜(DMSO)对颅脑损伤后细胞凋亡调控基因Bcl-2变化的影响。
方法:采用自由落体撞击脑损伤模型造成中度颅脑损伤,治疗组伤后经尾静脉给予DMSO50mg/kg。
损伤对照组、治疗组分别于损伤后6h、12h、24h、48h、72h和168h随机点杀动物6只,空白对照组于6小时一次处死。
采用免疫组织化学方法检测凋亡基因Bcl-2表达情况。
结果:治疗组Bcl-2蛋白表达平均阳性细胞数明显增加,与损伤对照组对应时相比较P<0.01。
结论:DMSO的应用可以阻止抗凋亡基因Bcl-2的下调,从而抑制脑损伤后所致的细胞凋亡。
关键词 二甲基亚砜;颅脑损伤;抗凋亡基因Bcl-2中图分类号 R392.2 文献标识码 A 文献编号1006-(2003)02-0081-03 近年来,颅脑损伤已成为威胁人类健康的主要疾患之一。
如何减少颅脑损伤死亡率和伤后的神经功能废损,一直是神经外科研究的热点课题。
关于脑外伤后继发性神经细胞的死亡,过去一直认为是一种细胞的坏死,1993年,Kure等[1]学者研究提出了神经细胞在损伤缺血等情况下存在细胞凋亡,并在继发性神经细胞的死亡中占10%～50%。
目前研究表明:Bcl-2是最重要的凋亡调控基因,其中Bcl-2是凋亡抑制基因。
本实验建立SD大鼠脑损伤模型,给予抗氧化剂即氧自由基清除剂二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide;DMSO)处理,探讨损伤组与治疗组各时间段脑组织内凋亡调控基因Bcl-2的变化及表达,为颅脑损伤的治疗探索新的方法及思路。
1 材料与方法1.1 实验动物雄性SD大鼠84只,体重250g～300g。
由四川大学实验动物中心提供并代为饲养。
1.2 主要实验1.2.1 主要实验仪器:①自由落体颅脑损伤模型(包括:外周导管、击锤和撞杆头)。
②307-6型台式牙钻车(开颅用)。
上海齿科医械厂生产。
③PYX-DHS-40×50隔水式电热恒温培养箱。
上海跃进医疗器械一厂生产。
④SAMSUNG BCD-265WM冰箱。
上海跃进医疗器械一厂生产。
⑤WD750AS L23微波炉。
格林氏集团公司生产。
1.2.2 主要试剂:①二甲基亚砜(DMSO),从美国Sigma公司购进。
②Bcl-2一抗,均从北京中山公司购进。
1.2.3 实验方法1.2.3.1 动物分组:84只大鼠随机分为空白对照组、损伤对照组和治疗组,动物分别为12只、36只、36只。
后两组再分为伤后6h、12h、24h、48h、72h和168h6个亚组,各组6只。
治疗组在伤后10min内经尾静脉注射DMSO50mg/kg,每日一次。
1.2.3.2 损伤模型的建立:参照Feeney[2]自由落体脑损伤装置,由撞杆、下落击锤和外周导管三部分组成,均为不锈钢材料。
撞杆头端直径4.5mm,头端高度2.5mm,外周导管高度40cm,每隔1cm 有一气孔。
致伤时,用2%的戊巴比妥钠40mg腹腔内注射麻醉后,将动物置于平台上,俯卧位固定头部,消毒后矢状切开头皮,暴露右顶骨,用牙科钻在冠状缝后1.5mm,中线旁2.5mm处钻一直径约5mm的骨窗,将撞杆头端置于骨窗硬膜外,用20g 重的击锤沿外周导管从30cm高处自由坠落冲击撞杆头,冲击力为0.048NS,造成右顶叶脑挫裂伤,骨窗用骨蜡封闭后缝合头皮结束手术。
1.2.3.3 处死及取材:分别按各时间点将动物断头处死,立即取全脑组织,置于4%的中性甲醛溶液中固定备用。
2 免疫组织化学(Inmun ohistochem istry IHC)染色检测Bcl-2结果判定:判定标准根据石群立等研究文献报道[3],细胞浆内或核模上出现棕黄色颗粒或斑片为阳性细胞。
400高倍光学显微镜下,每张切片任选18第17卷 第2期2003年 6月 长治医学院学报 JOURNAL OF CHANGZHI MEDICAL COLLEGE Vol.17 No.2 J un. 2003 作者单位 1附属和平医院神经外科(046000) 2四川华西医科大学附属医院5个视野,计算平均阳性细胞数。
3 统计学分析处理实验数据均在四川大学卫生统计学教研室进行统计分析,对各时间点数据均采用t 检验,应用SPSS 统计软件包进行分析,结果用“均数±标准差”表示。
4 Bcl -2免疫组化检测结果Bcl -2阳性表达主要在胞浆着色,胞核也可见到,呈弥漫性或散在性棕黄色颗粒,免疫反应阳性细胞主要位于伤侧大脑半球损伤区及周围水肿区域,早在伤后6h ,伤侧Bcl -2蛋白下降,伤后1d ～3d ,Bcl -2的表达下降相对缓慢,其表达值低谷在损伤后3d (12.67±1.53)。
而治疗组Bcl -2蛋白表达下降在各个时间点无显著变化如表1、图1,2。
表1 损伤对照组与治疗组Bcl -2平均阳性细胞数表达(x ±s ,个)0h 6h 12h 24h 48h 72h 168h 空白对照组 4.26±0.75损伤对照组 19.50±0.8917.57±1.9716.37±2.0114.57±1.9812.67±1.5315.32±2.26治疗组24.78±1.2223.33±1.4521.57±2.6519.82±0.9419.13±1.8820.90±2.18 注:脑损伤后两组间相同时间点比P <0.05图1 损伤后3d 天损伤对照组Bcl-2蛋白表达(400×)图2 损伤后3d 天治疗组Bcl-2蛋白表达(400×)5 讨论DMSO 是一种具有自由基清除功能的还原剂,又称为抗氧化剂,分子量为78.13,它具有减轻软组织水肿、抑制组织炎症、诱导利尿等作用[4]。
但是,有关抗氧化剂与颅脑外伤后神经细胞凋亡的研究较少,DMSO 对颅脑外伤后神经细胞凋亡的影响国内外更罕见报道。
DMSO 抑制神经细胞凋亡的机理尚不清楚,通过本实验研究并结合国内外报道,我们推测DMSO 可能通过对凋亡相关基因的调控抑制细胞凋亡:DMSO 是一种水溶性和脂溶性都很好的物质,能分布到膜的脂质双分子层中,保护和稳定细胞膜、线粒体膜和溶酶体膜的完整性,并且稳定膜上的Bcl -2蛋白,减缓伤后Bcl -2的下调,充分发挥其抗凋亡的作用。
Kulah 等[5]观察了十例闭合性颅脑损伤后继发性脑水肿的病例,发现应用DMSO 后能够阻止脂质过氧化反应的发生,清除氧自由基,并通过抑制磷酸二脂酶的活性而稳定和保护细胞膜,迅速降低颅内压,增加脑灌注压并且改善神经功能和预后。
氧自由基介导脑损伤后细胞凋亡,氧自由基很容易与细胞内的大分子反应,或直接损伤它们,或启动一个链反应。
在该链反应中,自由基从一个大分子到另一个大分子,从而导致细胞结构广泛损伤。
氧自由基介导细胞凋亡的证据有[6]:加入活性氧或耗竭细胞内抗氧化剂能导致细胞凋亡,细胞凋亡能被具有抗氧化能力的物质阻断。
大量研究证实:脑外伤后存在凋亡调节基因的表达,调节基因表达的非平衡状态可导致创伤性神经细胞凋亡。
1994年,Strauss 等[7]研究脑外伤后Bcl -x 和Bax的表达发现:(1)在颅脑损伤的早期,Bcl -xmRNA 下调及Bcl -x 蛋白下降,即凋亡的抑制因子降解,可危及细胞的生存;(2)后期BaxmRNA 上调及Bax 蛋白水平升高,即凋亡促进因子上调,与神经细胞凋亡的发生有关。
Hockenbery 等[8,9]提出Bcl -2可通过抗氧化途径抑制凋亡的发生。
与膜结合的Bcl -2蛋白主要位于核膜、内质网和线粒体膜上,它可能通过改变线粒体功能来消除活性氧自由基并减少氧化损伤引起的细胞凋亡。
因此,哺乳动物细胞线粒体和细胞质中反应氧中间产物水平的调节,可能部分是通过Bcl -2基因产物来实现的。
Bcl -2基因是公认的凋亡抑制基因[10],Bcl -2蛋28长治医学院学报白可以减少自由基的产生,阻止脂质过氧化反应,增加还原性辅酶I 谷胱甘肽,使细胞对缺血缺氧有更强的耐受性[11],Bcl -2蛋白作为抗氧化因子可以阻止神经细胞的凋亡。
Lawrence 等[12]研究表明,过度表达Bcl -2转基因大鼠中,Bcl -2蛋白能保护脑缺血所致的神经细胞损害,并且过度表达Bcl -2的细胞培养中,Bcl -2蛋白能降低谷氨酸所致的海马神经细胞损害,Bcl -2蛋白是脑组织中的抗凋亡基因。
因此,颅脑损伤所致的损害与凋亡调控基因表达密不可分[13]。
本实验研究显示:在高倍镜下,表达Bcl -2蛋白的神经细胞核形态正常,很少见到凋亡或坏死的形态特征,早在损伤后6h ,损伤对照组伤灶Bcl -2蛋白表达较治疗组显著下降(19.50±0.89,27.48±1.22,P <0.01),而二甲基亚砜治疗组大鼠损伤后的各个时间点Bcl -2蛋白表达比较无显著性差异,即下调不明显,说明二甲基亚砜可阻止Bcl -2蛋白的下调,从而证明自由基清除剂二甲基亚砜可阻止脑伤所致的细胞凋亡,保护脑组织。
二甲基亚砜对颅脑外伤后神经细胞凋亡的研究国内外尚未见报道,并且抗氧化剂与颅脑外伤后神经细胞凋亡的研究亦少见。
因此,通过对使用广谱的协同的抗氧化物预防氧化应激反应诱导细胞凋亡的研究具有重要的意义。
参考文献1.K ure S ,T ominaga T ,Narisawa A ,et al.Evidence of apoptosis celldeath after focal cerebral ischemia.Brain Res.1993,624(1):322.Feeney DM ,Boyeson MG ,Linn RT ,et al.Methodology and local effects of contusion in the rat.Brain Res.1981,211(1):67-773.石群立,张泰和,钱源澄,等.原发性中枢神经系统淋巴瘤Bcl -2蛋白表达.中华病理杂志,1996,25:1714.G orog P.E ffect of DMSO on various experimental inflammation.Curr Therap.1968,10:4865.K ulah A.Dimethyl sulfoxide in the management of patients with brain swelling and increased intracranial pressure after severe closed head injury.Neurochir Stuffg.1990,33:1776.Zhong LT ,Sarafian R ,K ane D J ,et al.Bcl -2inhibits death of central neural cells induced by multiple agents.Proc Natl Acad Sci USA ,1993,90:4533-4541.7.Strauss RI.High -sensitivity capillary electrophoresis of double -stranded DNA fragments using m ononmeric and dimeric fluorescent in 2tercalating dyes.Anal Chem ,1994,66:1948.H ockenbery DM ,Oltvai ZN ,Y in X M ,et al.Bcl -2functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis.Cell.1993,75:2419.Quillet -Mary A ,Jaffrezon J P ,Mansat V ,et al.Implication of mito 2chondrial hydrogen peroxide generation in ceramide -induced apopto 2sis ,J Biol Chem.1997,272:21388～2139510.H ockeuberry D.Bcl -2is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death.Nature.1990,348:33411.T ocobson MD ,Raff MC.Programmed cell death and Bcl -2protec 2tion in very low oxygen.Nature.1995,374:wrence MS.J Neurosci.1996,16:48613.Bolse LH ,G onzalez -G arcfa M ,Postema CE ,et al.Bcl -x ,a Bcl -2-related gene that function as a dominant regulator of apoptotic cell death.Cell.1993,74:597～608(收稿日期:2003-02-04)Experimental Study of The E ffect of The Dimethyl Sulfoxide on The Expression of Bcl -2G ene After Traumatic Brain Injury In R atsLi Xuguang ,Chen Guang ,Y ou ChaoHeping Hospital to Affiliatedof Changzhi Medical CollegeAbstract Objectives :T o investigate the effects of the dimethyl sulfoxide on the varieties of the gene of Bcl -2after traumatic brain injury.Methods :Both injuries and treatment with dimethyl sulfoxide were given to the trial group.The control group only received injuries and neither was given to the normal group.The free -falling -body impact device was used to cause local moderate contusion and laceration in the rats.Every rat of the trial group was given dimethyl sulfoxide (50mg/kg )by venipuncture after traumatic brain injury.Rats of the control group and the trial group were killed at 6h 12h 24h 48h 72h 168h after injury respectively.All of the rats from the normal group were killed at 6h after injury.The expression of Bcl -2was evaluated by immunohistochemical detection.Results :The average positive cells expressing Bcl -2protein in the trial group are obviously higher than that of the control group (p <0.01).C onclusion :Dimethyl sulfoxide can prevent Bcl -2from downregula 2tion and apoptosis after traumatic brain injury.K ey words Dimethyl sulfoxide ;Traumatic brain injury ;Bcl -238李旭光等.DMSO 对脑损伤后Bcl -2基因表达影响的实验研究。
