成年大鼠骨骼肌成肌细胞的原代培养(一)解读

大鼠骨骼肌细胞培养骨骼肌是一种横纹肌，通常是通过肌腱固定到骨骼上，其伸缩可以带动骨骼的移动，促进机体运动。

肌细胞呈纤维状，不分支，有明显横纹，核很多，且都位于细胞膜下方。

肌细胞内有许多沿细胞长轴平行排列的细丝状肌原纤维，每一肌原纤维都有相间排列的粗肌丝及细肌丝。

肌纤维收缩并不是肌纤维中肌丝本身的缩短或卷曲，而是细肌丝在粗肌丝之间滑行的结果，肌丝滑行使肌节长度缩短，肌原纤维缩短表现为肌纤维收缩。

体外培养大鼠骨骼肌细胞，为临床肌肉损伤的治疗提供理论依据.一、实验前准备实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。

按照含0.2%的XI胶原酶、0.2%的中性蛋白酶、0.1%的胶原酶进行配制消化液，用0.22微米的PES微孔滤膜进行过滤除菌，置于50毫升离心管中，可直接用于组织消化。

瓶口消毒后室温待用。

取出无菌培养皿，分别作好标记，吸取适量PBS置于相应标记的培养皿中。

无菌条件下，准备好各种大小的眼科剪刀、止血钳、眼科镊子和手术刀。

将断颈处死后浸泡于体积分数为 75%乙醇的SD大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。

二、骨骼肌提取眼科剪刀剪开大鼠后肢皮肤，暴露腿部肌肉，用手术刀小心割取后肢大腿肌肉，同样方法分离另一后肢大腿肌肉。

小心剪取表面无附着膜和脂肪组织的肌肉，置于装有PBS的无菌培养皿中。

吸取适量消化液于相应标记的培养皿中。

将剪取的骨骼肌在无菌PBS浸泡清洗，去除脂肪组织后放置于含消化液的培养皿中，采用眼科剪刀剪碎骨骼肌组织，成1平方毫米不规则碎片。

轻轻摇匀，室温静置消化30分钟收集组织悬液于50毫升离心管中，用消化液反复冲洗培养皿，直至将全部组织块收集到离心管内。

轻轻吹打混匀组织块悬浮液。

配平离心：每分钟1000转，室温离心十分钟。

三、骨骼肌悬液制备及培养离心后小心去除上清，不要吸到底部的组织块沉淀，用含20%胎牛血清的DMEM培养基重悬，轻轻吹打混匀，制成悬液，均匀转移至六孔板中，轻轻摇匀，标记时间后放于37 ℃、体积分数为 5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。

骨骼肌细胞原代培养骨骼肌细胞是我们身体中最重要的肌肉组织之一，通过细胞的原代培养可以帮助我们更好地研究肌肉的生理和病理过程。

本文将介绍骨骼肌细胞原代培养的方法和意义。

一、骨骼肌细胞原代培养的方法1. 细胞来源骨骼肌细胞可以从人体或动物体内获得。

人体来源的骨骼肌细胞可以通过手术获取，动物来源的骨骼肌细胞可以通过解剖或抽取组织获得。

2. 细胞分离将获得的骨骼肌组织进行消化，分离出单个的骨骼肌细胞。

常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶，通过适当的温度和时间来进行消化。

3. 细胞培养将分离出的骨骼肌细胞放入培养皿中，加入适当的培养基，提供细胞所需的营养物质和生长因子。

培养基的配方和组成会因实验目的的不同而有所差异。

4. 细胞传代原代培养的骨骼肌细胞会在培养过程中逐渐增殖，达到一定的细胞数量后，可以进行细胞传代。

传代可以保持细胞的稳定性和生物学特性。

二、骨骼肌细胞原代培养的意义1. 生理研究通过骨骼肌细胞原代培养，可以研究肌肉的生理功能和调控机制。

例如，可以研究肌肉收缩机制、肌肉代谢和能量平衡等方面的问题。

2. 病理研究骨骼肌细胞原代培养还可以用于研究肌肉疾病的发生机制和治疗方法。

例如，可以利用培养的肌肉细胞模拟某些疾病的发生过程，寻找治疗的靶点和药物。

3. 药物筛选骨骼肌细胞原代培养可以用于药物的筛选和评价。

通过在培养的肌肉细胞中加入不同的药物，观察细胞的反应和变化，可以评估药物的疗效和毒副作用。

三、骨骼肌细胞原代培养的注意事项1. 细胞来源的选择在进行骨骼肌细胞原代培养前，需要选择合适的细胞来源。

不同的细胞来源可能会影响培养结果和实验的可行性。

2. 培养条件的优化骨骼肌细胞原代培养需要适宜的培养条件，包括培养基的配方、温度、湿度和CO2浓度等。

这些条件需要根据实验的要求进行优化。

3. 细胞的纯度和活性在骨骼肌细胞原代培养过程中，需要保证细胞的纯度和活性。

细胞的纯度可以通过筛选和分离的方法进行提高，细胞的活性可以通过细胞活力试剂盒进行检测。

成年大鼠骨骼肌成肌细胞的原代培养(一)【摘要】目的探索成年大鼠骨骼肌成肌细胞的原代培养方法。

方法取成年Wistar大鼠的后肢肌肉,利用组织块法培养成肌细胞。

并对培养细胞进行形态学研究和细胞鉴定。

结果采用组织块培养成肌细胞的密度可达118/ml, 成肌细胞的分化鉴定显示94%以上的细胞呈骨骼肌特异的肌细胞。

结论利用组织块法成功培养成年大鼠原代骨骼肌成肌细胞,该方法实用性强,所得成肌细胞纯度高,为深入研究心力衰竭骨骼肌成肌细胞自体移植奠定了基础。

【关键词】骨骼肌成肌细胞原代培养大鼠成年【Abstract】 Objective： To explorean experimental method for primary culture of adult rat skeletalmuscle sarcoblast Methods: Muscle of posterior limb from wistar rat were cultured by tissue culture method. The cells were counted and observed by light microscopy combined with identification. Results:The number of skeletalmuscle sarcoblast118per millilitre. skeletalmuscle sarcoblast cell differentiation accredit showed that over 94% cells were stained positive for myogenin.Conclusions: Tissue culture method conveniently permits the purification and Proliferation of myoblast. These esults provide the basis for future studies to assess the ability of the cells to repair heart failure.【Key words】skeletalmuscle sarcoblast primaryculture rat adult心肌细胞是终末化组织，不能再生。

上海交通大学学报(医学版)Vol .28No .7Jul .2008Journal of Shanghai J iaotong University (Medical Science )基金项目:上海市科委基金(044119605)(Shanghai Science and Technol ogy Comm ittee Foundati on,044119605)。

作者简介:徐　可(1975-),男,上海人,主治医师,博士;电子信箱:huashanxuke @medmail 。

通讯作者:方祖军,电子信箱:huashanfangzujun @ 。

文章编号:　0258-5898(2008)07-0775-04・论　著・大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性徐　可,　方祖军,　李映川,　郑　捷,　丁　强(复旦大学　华山医院泌尿外科,上海　200040)摘　要:目的建立大鼠骨骼肌卫星细胞分离和纯化方法,并观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖和成肌特性。

方法采用改良两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得高纯度的骨骼肌卫星细胞。

免疫组化染色鉴定体外培养的骨骼肌卫星细胞;MTT 法检测体外培养骨骼肌卫星细胞的生长情况;倒置显微镜观察不同培养条件下骨骼肌卫星细胞的分化特性。

结果获取的骨骼肌卫星细胞纯度高,细胞中肌源性标志中间丝蛋白des m in 呈强阳性表达。

体外培养时,骨骼肌卫星细胞有1～2d 的潜伏期,5～6d 进入平台期。

细胞汇合至60%～70%或降低培养基血清浓度时,开始相互融合形成肌管细胞。

结论酶两步消化法和差速贴壁技术是一种简便易行、获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞的方法。

骨骼肌卫星细胞体外培养时无需特殊诱导即可相互融合,形成具有骨骼肌收缩特性的肌管细胞。

关键词:骨骼肌卫星细胞;　培养;　增殖;　分化中图分类号:Q 813.11 文献标志码:ACharacter isti cs of proli fera ti on and m yotube cell forma ti on of ra t skelet a l m uscle s a tellite cells cultured in vitroXU Ke,FANG Zu 2jun,L I Ying 2chuan,ZHENG Jie,D I N G Q iang(D epart m ent of U rology,Huashan Hospital,Fudan U niversity,Shanghai 200040,China )Abstract:　O bjective To establish a method of is olation and purificati on of rat skeletal muscle satellite cells,and observe the characteristics of p r oliferati on and my otube cell for mati on of skeletal muscle satellite cells cultured in vitro .　M ethods Purified skeletal muscle satellite cells were obtained by i mp r oved t wo 2step enzy matic digesti on method and p re 2p lating technique .I m munohistochem ical staining was emp l oyed t o identify the skeletal muscle satellite cells cultured in vitro .The gr owth of skeletal muscle satellite cells cultured in vitro was exam ined by MTT assay .The differentiati on of skeletal muscle satellite cells was observed by inverted m icr oscopy .　Resu lts The skeletal muscle satellite cells with higher purity were obtained and confir med by the high exp ressi on of des m in .W hen cultured in vitro ,the latent phase of skeletal muscle satellite cells was the first t o the second day,and the p latfor m phase was the fifth t o the sixth day .My otube cells gradually for med when cell confluence was more than 60%t o 70%or differential medium with l ower fetal bovine serum was used .Conclusion The co mbinati on of i mp r oved t wo 2step enzy matic digesti on method and p re 2p lating technique serve as an easyand p ractical way to obtain skeletal muscle satellite cells with higher purity .Skeletal muscle satellite cells can for m myotube cells with contraction characteristics without any s pecial induction .Key words:　skeletal muscle satellite cell;　culture;　p r oliferation;　differentiation 骨骼肌卫星细胞是存在于骨骼肌肌膜和基底膜之间的一些单个核细胞,被认为是一种具有一定自我更新能力[1]及已发生某种程度定向分化的成体组织内的专能干细胞[2],因此在组织工程和基因治疗领域有着良好的应用前景。

[1] 。

大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定血管平滑肌细胞（VSMC 的异常增殖是许多心血管疾病的共同病理基础， 在高血压、 动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等 许多血管性疾病中，都涉及到血管平滑肌细胞的异常增殖 血管由 3 个部分组成，自内向外依次是内膜层、 中膜层和外膜层，内膜层主要由血管内皮细胞和少量的平滑肌细胞组成， 外膜层由要收缩调节机体的血流和血压， 其功能障碍在心血管疾病中起着 非常重要的作用， 因此， 对血管平滑肌细胞的生物学特性进行深 入研究，才能探明上述血管疾病的发病机制。

在VSMC 勺研究中， 组织块贴壁法培养 VSM （和胶原酶消化法是目前采用的非常广泛的技术。

本实验采用组织块贴壁法进行大鼠胸主动脉平滑肌细胞 的培养，并采用平滑肌细胞的3种标记分子（SMASM22Calponin ） 进行免疫细胞化学鉴定。

1 材料与方法成纤维细胞组成， 中膜层由血管平滑肌细胞组成， 平滑肌细胞主1.1 材料。

动物来源：健康 Wistar 大鼠，由第三军大学实验动物中心提供，雌雄不限，体重180 〜200g 。

DM EMS 糖培养 基 （美国 Gibco 公司） ， Hepes 索莱宝） ， 优质胎牛血清 （原 代培养浓度 20%，传代培养浓度 10%，美国 Hyclone ），胰蛋白酶，鼠单抗肌动蛋白 SMA 、SM22、Calponin 北京博奥森生物），DAB 显色试剂盒，通用型免疫组化检测试剂盒北京中杉金桥生物技术XX公司）其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法1.2.1 取材：断颈法处死Wistar 大鼠，消毒胸腹部，大组织剪、组织镊剪开胸腹部皮肤，更换器械，切开胸腹部，并切除部分胸壁以利于暴露胸主动脉，用眼科弯镊和眼科剪分离胸腹主动脉并放入盛有无菌PBS的细胞培养皿中。

转入超净工作台上，眼科直镊和弯镊清除结缔组织和血块，剥除动脉外膜。

放入另一盛有PBS的细胞培养皿中，减去血管外的细小分支，并放入含10%台牛血清的DMEI中，眼科直剪纵向剖开血管腔，用眼科弯镊轻轻刮除内膜面，以去除内皮细胞，放入另一含10%台牛血清的DMEM中，用眼科弯剪反复剪切成1mm*1m大小的组织块。

骨骼肌线粒体的提取 [160]麻醉取材,迅速分离相应骨骼肌,区分红肌和白肌。

分别用介质Ⅰ(0.12M KCl , 20mM Hepes, 5mM MgCl2, pH 7.4冲洗肌组织两遍,剔除脂肪及结缔组织、置于盛有适量介质Ⅰ的小烧杯中, 用剪刀剪碎, 加 100毫升介质 I , 分成 4-5份,电动匀浆器匀浆 1200转 /分钟,上下三次,加 40毫升介质 I , 0-4℃离心, 600g 离心 10分钟, 弃沉淀, 上清用两层薄纱布过滤以去除脂肪, 滤过液于 17000g 离心 10分钟,沉淀用 5毫升介质Ⅰ悬浮,混匀,加入 20毫升介质Ⅰ, 7000g 离心 10分钟,沉淀悬浮在 20毫升介质Ⅱ(0.3M Sucrose , 2.0mM Hepes , 0.1mM EDTA , 2mg 脱脂 BSA/ml, pH 7.4中, 3500g 离心 10分钟,沉淀悬浮于 1毫升介质Ⅱ中。

以上操作均在冰浴中进行。

2.6心肌线粒体的提取在每一个运动时间点即刻断头处死,迅速取出心脏,用分离介质 (0.25M Succose, 3.0mM Hepes, 0.5mM EDTA, pH 7.4冲洗两遍,剔除脂肪及结缔组织、剪碎,加 100ml 分离介质,分成 4-5份,电动匀浆器匀浆 800转 /min,上下三次,加 40ml 分离介质, 0-4℃离心, 800g 离心 10min , 弃沉淀, 上清液于 10000g 离心 10min , 沉淀用 1ml 分离介质悬浮,混匀,加入 20ml 分离介质, 10000g 离心 10min ,沉淀悬浮于 1ml 分离介质中。

以上操作均在冰浴中进行。

大鼠肝脏线粒体的制备运动后即刻敲击鼠头部处死 , 迅速取出肝脏 , 置于冷生理盐水中洗净 , 称重后置于液氮中冷冻 , 低温保存待用。

采用同样的方法处死对照组动物并取样。

将样品在 0~4 ℃放置 10min ,然后将其移至预冷的匀浆缓冲液中剪碎 , 组织 / 缓冲液为 1∶ 10 (w/ v ,用电动匀浆器制备匀浆液。

骨骼肌成纤维细胞分离培养
骨骼肌成纤维细胞（skeletal muscle fibroblasts）的分离和
培养是一种常用的实验技术，用于研究骨骼肌相关的生物学过程以及
肌肉疾病等。

以下是骨骼肌成纤维细胞分离培养的一般步骤：
1.准备离体骨骼肌组织。

从小鼠或人的骨骼肌中取出组织，最好是新鲜组织以确保细胞的活力。

2.组织消化。

将骨骼肌组织切成小块，用胶原酶或胰蛋白酶等消化酶进行消化，使细胞从组织中释放出来。

3.细胞筛选。

通过过筛网或离心的方式将消化后的细胞悬浮液筛选，去除大部分的纤维束和其他细胞类型。

4.细胞培养。

将筛选后的细胞悬浮液转移到培养皿中，添加含有合适培养基和补充物的培养液，将培养皿放置在适当的培养箱中。

5.培养条件。

骨骼肌成纤维细胞通常在37°C的孵育箱中，与5% CO2的空气保持湿润的环境中培养。

6.细胞生长和传代。

骨骼肌成纤维细胞会在培养皿中黏附并开始增殖。

当细胞达到一定密度时，可以进行传代，将细胞分离并分散到
新的培养皿中。

需要注意的是，分离和培养骨骼肌成纤维细胞需要一定的实验技巧和设备，以保证细胞的存活和生长。

同时，细胞的培养基选择和培
养条件的控制也对细胞的生长和功能有重要影响。

因此，在进行这项
技术时，需要按照具体实验要求和相关文献中的方法进行操作。

实验二大鼠CM的体外分离、培养及鉴定1、材料与方法1.1 材料1.1.1实验动物新生3天清洁级Wistar大鼠乳鼠（中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk2005-0001）。

1.1.2主要仪器与试剂 5％CO2恒温培养箱（model TC2323 CO2incubator）；倒置相差显微镜（XD-101 98010）；PH计（mettler toledo320-s）；立式自动电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-40BI），上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD型单人双面净化工作台；微量移液枪（法国Gilson）；血球记数板（上海市沪江医疗器材经营部）；HH-6数显恒温水浴锅；离心机（LDZ5-2）；75cm2培养瓶、50ml离心管（美国corning公司）；无菌手术器械；磁力搅拌器；电子天平板（BS1101S 德国）；一次性滤器（22μm, GILSON）；DMEM/F12培养基 (美国GIBCO)；特级胎牛血清（FBS， Hyclone）；青、链霉素（Hyclone）；D-Hank’s液（NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、NaOH、NaHCO3，苯酚红,南京化学试剂厂）；心肌肌钙蛋白T(Santa cruz) ;FITC连接的兔抗山羊IgG(Santa cruz);Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(Sigma)；Triton-X-100(AMRESCO);BrdU(solarbio)。

1.2方法于无菌操作下开胸取出心脏，仔细去除心脏相连大血管和心房组织（留心尖部），于4℃的D-Hank’S液中漂洗3～4次，以去除残存血液，眼科剪将心尖部组织剪成1 mm3碎块后，加入4 ml的0.0625%胰蛋白酶液，于37℃恒温水浴箱中消化3 min，然后弃上清。

于剩余沉淀中加入混合消化液5 ml（0.0625％胰蛋白酶+0.1％Ⅱ型胶原酶），置37℃水浴消化8～10 min，其间振荡2～3次，静置后将上清液移入离心管中，加含10％胎牛血清预冷的DMEM/F12培养液终止消化。

骨骼肌的原代培养一.试剂1.包被用多聚赖氨酸poly-lysine的配制与包被1）准备0.94%硼酸溶液称取0.94硼酸粉末溶于80ml水中，用NaOH将pH值调至8.4，再定容。

2）按每4.9mg多聚赖氨酸粉末溶解于98ml0.94%硼酸溶液配制100ml.3）0.22µM过滤分装，-20°C储存，避免反复冻融。

4）包被：按10cm皿用4ml包被液进行包被，4°C过夜或37°C 2 小时后，吸干，回收包被液，包被过的皿置4°C保存可达一个月，临用前用PBS或灭菌的去离子水洗3遍再使用，整个包被过程均为无菌操作。

多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。

也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。

多聚赖氨酸包被培养板使用前是用灭菌的去离子水稀释，最好不要用双蒸水或别的，因为多聚赖氨酸包被的原理是通过改变器皿表面的电荷而促进细胞的黏附。

2. 0.1% I型胶原酶（1mg/ml）100mg I型胶原酶溶于100ml D-hank’s液中，过滤后4°C保存。

3. D-hank’s液（可以直接购买使用）KCl 0.40g，KH2PO4 0.06g，NaCl 8.00g, NaHCO30.35g, NaH2PO4·7H2O 0.09g，酚红0.01g。

以上均为分析纯，加三蒸水定容至1L后高压灭菌，4℃分装备用;4. 血清的灭活:常用的血清要先在56℃水浴中灭活30min方可使用。

灭活后-20℃保存备用;5. 细胞生长液的配制(100mL):即含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液。

取20ml灭活的血清，再加青、链霉素各100IU，然后用DMEM/F12培养基补充到100 mL，4℃保存备用。

6. 0.1%胶原酶II(100 mL)的制备:称取胶原酶II 100mg用100mL DMEM/F12液充分溶解，0.22µM过滤后分装备用，-20℃保存;7. 75%乙醇8. Mini-Q(超纯水)--灭菌无离子水二.实验器械1、培养皿2、培养瓶3、直剪和眼科剪4、眼科镊和止血钳5、烧杯6、15ml离心管三、正常小鼠原代骨骼肌细胞培养实验流程取肌肉于平皿，Hank’s洗3次↓剔除脂肪、结缔组织↓肌肉标本剪约0.1cm3小块↓移至离心管，Hank’s洗3次↓静置1min，弃去上层液及漂浮组织↓0.25%胰酶，37度水浴消化20min，每5min摇动或吹打1次↓生长培养基终止消化，反复吹打，依次100，200，400目过筛↓离心，1000rmp,10min，弃去上清↓重悬，计数细胞，接种密度以5 × 105个/ml↓悬液加入未经PPL包被培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37度，1h↓转移包被瓶中，生长培养基培养，培养37℃，5%CO2↓4d换液，以后每天换四、实验操作1、新生小鼠拉颈椎处死，乙醇消毒腿部，在超净工作台内，取肌肉于平皿，Hank’s 洗3次，剔除脂肪、结缔组织，将肌肉标本剪约0.1cm3小块；2、将剪碎的肌肉移至离心管，Hank’s洗3次，静置1min，弃去上层液及漂浮组织；3、向上述离心管中加入0.25%胰酶，37度水浴消化20min，每5min摇动或吹打1次离心管，然后加入生长培养基终止消化；4、反复吹打后，依次100，200，400目过筛，滤液收集后，1000r/min离心10min；5、弃去清夜，用生长培养基重悬细胞，悬液加入未经PPL包被的培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37度培养1h后，转移包被瓶中，生长培养基培养，4d 换液，以后每天换液1次。