核内参PCNA抗体

·实验研究 ·福建中医药 2023 年 6 月 第 54 卷 第 6 期Fujian Journal of TCM June 2023，54（6）壮骨健膝方对脂多糖诱导兔滑膜成纤维细胞炎症模型的影响张英杰1，张鹏1，肖艳2，刘俊1，陈雨1，邱梦婷1，苏友新1*（1.福建中医药大学中医学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学康复医学院，福建 福州 350122）摘要： 目的 探讨壮骨健膝方对兔滑膜成纤维细胞炎症模型的影响及作用机制。

方法 采用脂多糖（LPS ）刺激兔滑膜成纤维细胞（FLS ）建立炎症模型，筛选壮骨健膝方干预炎症模型的最佳条件（浓度10%，时间48h ）后，采用随机数字表法随机分为空白组、模型组和壮骨健膝方组，分别给予相应条件干预后采用ELISA 法检测各组细胞上清液中白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）含量，qPCR 法检测各组细胞中IL-1β、TNF-α、IL-6、增殖细胞核抗原（PCNA ）、I κB α、NF-κB p65 mRNA 表达，Western blot 法检测各组细胞中PCNA 、核因子κB 抑制因子α（I κB α）及核内核因子κB （NF-κB ）p65蛋白表达。

结果 与空白组比较，模型组IL-1β、TNF-α、IL-6含量，IL-1β、TNF-α、IL-6、PCNA 、NF-κB p65 mRNA 及核内NF-κB p65蛋白表达均显著升高（P 均＜0.05），I κB α mRNA 及蛋白表达显著降低（P 均＜0.05）；与模型组比较，壮骨健膝方组IL-1β、TNF-α、IL-6含量，IL-1β、TNF-α、IL-6、PCNA 、NF-κB p65 mRNA 及核内NF-κB p65蛋白表达均显著降低（P 均＜0.05），I κB α mRNA 及蛋白表达显著升高（P 均＜0.05）。

抗pcna抗体弱阳性抗pcna抗体也叫做增殖细胞核抗原，这种检查的方法是比较多的，pcna属于一种蛋白质，它是在细胞核内进行合成的，并且存在于细胞核里面，是DNA的辅助的一种蛋白，近些年来对于pcna的研究是比较热的，主要是因为在肿瘤方面，毕竟现在肿瘤患者越来越多，对于这种研究有助于患者早期发现。

★特点PCNA是一种分子量为36KD的蛋白质，在细胞核内合成，并存在于细胞核内，为DNA聚合酶δ的辅助蛋白。

在细胞核内存在可溶性与不溶性两种PCNA，可溶性PCNA在细胞周期各期中均有表达，其量在DNA合成过程中不发生明显变化，易被去污剂提取、甲醇破坏；不溶性PCNA较稳定，不易被去污剂洗脱、甲醇破坏，这种PCNA在G0～G1期细胞中无明显表达，G1晚期，其表达大幅度增加，S期达到高峰，G2～M期明显下降，其量的变化与DNA合成一致，检测其在细胞中的表达，可作为评价细胞增殖状态的一个指标[1,2,4]。

★肿瘤中PCNA的研究肿瘤细胞具有旺盛的增殖活性，而PCNA可作为评价细胞增殖状态的指标。

因此，国内外在许多肿瘤中进行了PCNA的研究，涉及PCNA与肿瘤发生发展[5,6]、分级[1,7～10]、分期[1,10]、放疗敏感性[11,12]、预后[1,7,8,10,13～20]、复发和转移[1,21]、死亡原因[20]、肿瘤标志物[18,22]等各个方面的相关性，得出了许多结论，但在某些方面因作者和所研究肿瘤的不同，还存在一些争议，即使尚没有争议的结论，也是从一种或几种肿瘤中得出的，这些结论是否适用于所有肿瘤，仍有待进一步研究。

肺癌中PCNA的研究PCNA在肺癌中的研究也较多，许多作者致力于这方面的探讨，期望找到有意义、有价值的结果，但到现在为止，PCNA在肺癌中研究所得出的一些结果也同样存在争论。

抗pcna抗体弱阳性
文章导读
抗pcna抗体也叫做增殖细胞核抗原，这种检查的方法是比较多的，pcna属于一种蛋白质，它是在细胞核内进行合成的，并且存在于细胞核里面，是DNA的辅助的一种蛋白，近些年来对于pcna的研究是比较热的，主要是因为在肿瘤方面，毕竟现在肿瘤患者越来越多，对于这种研究有助于患者早期发现。

特点 PCNA是一种分子量为36KD的蛋白质，在细胞核内合成，并存在于细胞核内，为DNA聚合酶δ的辅助蛋白。

在细胞核内存在可溶性与不溶性两种PCNA，可溶性PCNA在细胞周期各期中均有表达，其量在DNA合成过程中不发生明显变化，易被去污剂提取、甲醇破坏；
不溶性PCNA较稳定，不易被去污剂洗脱、甲醇破坏，这种PCNA在G0～G1期细胞中无明显表达，G1晚期，其表达大幅度增加，S期达到高峰，G2～M期明显下降，其量的变化与DNA合成一致，检测其在细胞中的表达，可作为评价细胞增殖状态的一个指标124。

肿瘤中PCNA的研究肿瘤细胞具有旺盛的增殖活性，而PCNA可作为评价细胞增殖状态的指标。

因此，国内外在许多肿瘤中进行了PCNA的研究，涉及PCNA与肿瘤发生发展56、分级17～10、分期110、放疗敏感性1112、预后1781013～20、复发和转移121、死亡原因20、肿瘤标志物1822等各个方面的相关性，得出了许多结论，但在某些方面因作者和所研究肿瘤的不同，还存在一些争议，即使尚没有争议的结论，也是从一种或几种肿瘤中得出的，这些结论是否适用于所有肿瘤，仍有待进一步研究。

肺癌中PCNA的研究
PCNA在肺癌中的研究也较多，许多作者致力于这方面的探讨，期望找到有意义、有价值的结果，但到现在为止，PCNA在肺癌中研究所得出的一些结果也同样存在争论。

WB检测抗体如何选择WB检测之二抗二抗选择二抗是用一抗免疫动物制备的抗一抗的抗体，选择范围较窄，基本是商品化的，在不考虑二抗修饰类型的前提下，二抗的选择需要遵循以下原则：二抗来源种属、一抗来源种属和抗原来源种属互不相同。

例如如果研究对象是人的蛋白X，选择了鼠抗X一抗，则可选择兔抗鼠二抗或者羊抗鼠二抗。

二抗选择要考虑的问题有：①对单抗类一抗，二抗需与一抗的类别或亚类相匹配（多抗类一抗主要是IgG类免疫球蛋白故相应二抗就是抗IgG F(ab’)2二抗，避免各种Ig保守结构域导致的交叉反应。

然而各种Ig仍具有保守的轻链结构域，因此还是有一定程度的交叉反应。

WB检测之内参抗体Western Blot检测方法不仅能检测靶蛋白存在与否，还能比较不同条件下或者不同组织中靶蛋白的相对表达量，可作为蛋白表达水平最直接的证据。

在WB实验中有众多不确定因素影响靶蛋白表达水平的测定，如方法学本身性质、操作误差等。

为准确衡量靶蛋白表达水平，需要精确一致的上样量，使用内参的意义即是保证上样量的一致。

内参即内部参照（Internal Control），对哺乳动物细胞一般指管家基因的表达蛋白(Housekeeping Proteins)。

此类蛋白在各组织和细胞中的表达相对恒定，可作为检测蛋白表达水平变化的参照物。

当内参条带亮度基本一致时，基本可以确定上样量是一致的，通常采用比较靶蛋白和内参蛋白条带亮度比值来进行相对定量。

WB实验中涉及到的蛋白-抗体结合是一个复杂的活性生物大分子间的相互作用，众多因素都会影响实验的结果。

例如时间、温度、浓度、离子强度等，在实验设计时就需要有严谨的对照方案，通过对照就容易判断问题所在，严谨的WB实验中需要设立蛋白分子量标准、空白载体对照、未诱导对照、已知量标准物正对照和内参。

内参使用方法1.标记内参：酶标的内参抗体可避免二抗结合总蛋白中某些免疫球蛋白产生的杂带，使用时只需在二抗孵育时加入酶标内参抗体，按照正常操作即可。

1性能指标
1.1外观
试剂盒各组份应齐全、完整，标签清晰，易识别；液体无渗漏。

1.2准确度
对准确度参考品进行检测，双链DNA（dsDNA）IgG抗体的相对偏差应在±20%范围内。

1.3最低检测限
对检测限参考品进行检测，dsDNA IgG抗体的检测限应不高于10 IU/mL；其它定性指标对应的各指标的L1应为阳性、L2应为阳性或阴性、L3应为阴性。

1.4线性
dsDNA IgG抗体在10~ 600 IU/mL范围内，其线性相关系数（r）r2应不小于0.950。

1.5阴性参考品符合率
对10份阴性参考品进行检测，对应指标的阴性参考品符合率应为100%。

1.6阳性参考品符合率
对12份阳性参考品进行检测，对应指标的阳性参考品符合率应为100%。

1.7重复性
对重复性参考品检测10次，同一指标的变异系数（CV）应不大于15%。

1.8批间差
用三个批号试剂盒检测同一份重复性参考品，批间差应不大于20%。

1.9dsDNA 校准品均匀性
1.9.1瓶内均匀性
校准品的瓶内均匀性（变异系数，CV）应不大于15%。

1.9.2瓶间均匀性
校准品的瓶间均匀性（变异系数，CV）应不大于15%。

重症急性胰腺炎(SAP)是一种以高发病率、高致死率为特征的消化系统疾病［1］，目前发病机制尚不明确。

主流观点认为多种原因导致的胰腺自身消化可引起全身炎症反应综合征，进而诱发多器官功能衰竭，是导致患者死亡的主要原因［2］。

本课题组前期研究证实，引流SAP 早期产生的胰源性腹水（PAAF ）即行腹腔穿刺引流术（APD ）可显著降低重症急性胰腺炎病人的全身炎症反应［3］，对重要脏器起到保护作用［4］。

然而APD 减轻胰腺损伤的具体机制目前尚不完全明了。

既往研究表明，受损的自噬介导腺泡细胞空泡化及胰蛋白酶原的激活，是导致急性胰腺炎（AP ）发生与恶化的重要因素［5］，而APD 与自噬间是否存在联系尚未得到证实。

核因子E2相关因子2(Nrf-2）作为内源性抗氧Abdominal puncture drainage alleviates severe acute pancreatitis in rats by activating Nrf-2/HO-1pathway and promoting autophagyLU Yichen 1,2,WU Jun 1,2,JIANG Wen 1,2,LIU Jiangtao 1,2,QIE Huaji 1,2,SUN Hongyu 1,2,TANG Lijun 1,21School of Clinical Medicine,Southwest Jiaotong University,Chengdu 610063,China;2Center of General Surgery//Sichuan Provincial Key Laboratory of Pancreatic Injury and Repair,General Hospital of Western Theater Command,Chengdu 610083,China摘要：目的探讨早期腹腔穿刺引流术（APD ）对大鼠重症急性胰腺炎（SAP ）自噬及Nrf-2/HO-1通路的影响及其可能机制。

WB检测抗体如何选择WB检测之二抗二抗选择二抗是用一抗免疫动物制备的抗一抗的抗体，选择范围较窄，基本是商品化的，在不考虑二抗修饰类型的前提下，二抗的选择需要遵循以下原则：二抗来源种属、一抗来源种属和抗原来源种属互不相同。

例如如果研究对象是人的蛋白X，选择了鼠抗X一抗，则可选择兔抗鼠二抗或者羊抗鼠二抗。

二抗选择要考虑的问题有：①对单抗类一抗，二抗需与一抗的类别或亚类相匹配（多抗类一抗主要是IgG类免疫球蛋白故相应二抗就是抗IgG F(ab’)2二抗，避免各种Ig保守结构域导致的交叉反应。

然而各种Ig仍具有保守的轻链结构域，因此还是有一定程度的交叉反应。

WB检测之内参抗体Western Blot检测方法不仅能检测靶蛋白存在与否，还能比较不同条件下或者不同组织中靶蛋白的相对表达量，可作为蛋白表达水平最直接的证据。

在WB实验中有众多不确定因素影响靶蛋白表达水平的测定，如方法学本身性质、操作误差等。

为准确衡量靶蛋白表达水平，需要精确一致的上样量，使用内参的意义即是保证上样量的一致。

内参即内部参照（Internal Control），对哺乳动物细胞一般指管家基因的表达蛋白(Housekeeping Proteins)。

此类蛋白在各组织和细胞中的表达相对恒定，可作为检测蛋白表达水平变化的参照物。

当内参条带亮度基本一致时，基本可以确定上样量是一致的，通常采用比较靶蛋白和内参蛋白条带亮度比值来进行相对定量。

WB实验中涉及到的蛋白-抗体结合是一个复杂的活性生物大分子间的相互作用，众多因素都会影响实验的结果。

例如时间、温度、浓度、离子强度等，在实验设计时就需要有严谨的对照方案，通过对照就容易判断问题所在，严谨的WB实验中需要设立蛋白分子量标准、空白载体对照、未诱导对照、已知量标准物正对照和内参。

内参使用方法1.标记内参：酶标的内参抗体可避免二抗结合总蛋白中某些免疫球蛋白产生的杂带，使用时只需在二抗孵育时加入酶标内参抗体，按照正常操作即可。

Bioss讲堂｜Westernblot内参抗体选择攻略大全Western Blot除了能证明某样品中含有某种蛋白之外，其最为重要的作用是比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少——即为蛋白表达水平最直接的证据。

要衡量蛋白的表达水平，前提条件就是等量的上样量。

内参的意义就是保证上样量的一致。

内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。

选择内参抗体应遵循的原则1、样本来源♠哺乳动物的组织或细胞：β-Actin、β-Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 等；♠植物样本：plant actin、Rubisco 等；♠其他来源样本，应参照已发表文献,选择合适蛋白作为内参。

2、目的蛋白定位▶全细胞蛋白和细胞质：β-Actin、beta Tubulin、GAPDH 等；▶细胞核蛋白：PCNA、LaminA、LaminB、HistoneH3，K70、K80、Erk2、TATAbindingprotein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等；▶胞膜蛋白：Na( )/K( ) ATPase 等；▶线粒体蛋白：VDAC1、COXIV等；▶血清：Transferrin等。

3、目的蛋白分子量目的蛋白分子量最好能与内参蛋白分子量相差5kd 以上，各内参蛋白分子量详见下方汇总表。

Tips: 内参的选择还需要考虑实际的试验环境：★在做多组织多细胞样本对比表达量时，最好选用 GAPDH作为内参，因为GAPDH是代谢类蛋白，在活组织中表达比较恒定。

而β-Actin和β-Tubulin是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性；★而在某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH 的表达增高，不适合做内参；★涉及细胞增殖的相关试验中，c-Jun由于自身表达变化不适合做内参；★凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参；★做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时，应选择结构蛋白作为内参，如β-Actin 和β-Tubulin。

核蛋白内参抗体的选择原则1) 核纤层蛋白核纤层蛋白是核纤层蛋白的结构成分，它们支持核膜，并在细胞周期中参与核膜的分解和重新形成。

在动物细胞中，三个基因编码至少七个Lamin。

LMNA基因通过交替剪接编码A和C型薄层蛋白，而LMNB1和LMNB2基因编码薄层蛋白B1和B2。

每个细胞中都存在B型Lamin。

胃泌乳后表达A型Lamin，而C型Lamin的表达是组织特异性的。

Lamins上发生了法尼基化和磷酸化等翻译后修饰，进而调节了核纤层的组装和层粘连蛋白的活性。

在Lamin中，Lamin B1最常用作加载控件。

Lamin B1在整个物种中都是保守的。

人Lamin B1与啮齿动物同源物具有95%的同一性，与果蝇对应物具有36%的同一性。

人Lamin B1与其他人Lamin的同一性超过50%。

Lamin B1蛋白不适合作为没有核膜包被的蛋白样品的上样对照。

2) TATA盒结合蛋白TATA盒结合蛋白TBP是一种通用转录因子，在通过RNA聚合酶II进行基因转录之前，它与TATA 盒DNA序列特异性结合。

TATA盒存在于10-20%的人类基因启动子中。

TBP是高度保守的。

人TBP与啮齿动物同源物具有约90%的同一性，而与真菌同源物具有超过60-70%的同一性。

TBP 的N端含有一串长的谷氨酰胺(TBP mRNA分子中的CAG重复序列)，可调节C端的DNA结合活性。

在健康个体中，TBP中N末端谷氨酰胺的数量有所不同(在25到42个重复之间)，在某些病理条件下会扩展到47-63个重复。

3) 热休克蛋白热休克蛋白(HSP)，也称为热休克认知(HSC)，是一组在某些压力下，特别是在高温下上调的蛋白。

这些蛋白质具有广泛的功能，包括提供针对此类应激源的保护和陪伴细胞周围的蛋白质。

某些HSP(例如HSC70和HSP90)有时用作Western印迹上样对照。

尽管某些HSP可能是组成型表达的，因此可以在某些蛋白印迹分析中用作可靠的上样对照蛋白，但切记治疗条件可能会改变某些HSP的表达，这一点至关重要。