PH1498 Western Blot一抗二抗去除液实验使用方法与步骤

Western Blot技术详细步骤蛋白质印记（Western Blot）是一种常用的生物技术，用于检测特定蛋白质在细胞提取物中的存在。

Western Blot基本步骤如下：1. 准备样品和设备：收集细胞或组织样品，然后使用适当的细胞裂解缓冲液将细胞破碎。

前处理样本并测定蛋白质浓度。

准备凝胶电泳设备，包括聚丙烯酰胺凝胶和Tris-glycine SDS运行缓冲液。

2. 凝胶电泳：将处理好的样品与样品缓冲液混合并加热，然后将其加载到凝胶孔中。

接着将预染蛋白质分子量标记也加载至凝胶中。

开始分子量依赖的电泳，使蛋白质在凝胶中分离。

3. 转印：将蛋白质从凝胶转移到结构更加稳定的膜载体，如聚偏氟乙烯 （PVDF）或者硝酸纤维素膜。

使用电转印或半干转印设备进行转移。

4. 封闭：为防止非特异性结合，使用5%无脂奶粉或BSA溶于TBST （Tris-缓冲的盐水加Tween 20）在膜上进行封闭。

一般封闭时间约为1小时，根据实验需求可调整。

5. 第一抗体孵育：将特异性的一抗稀释 （通常为多克隆或单克隆抗体），然后在封闭液中孵育膜。

根据抗体浓度与孵育时间进行相应优化。

6. 清洗：使用TBST清洗膜，以去除未结合的一抗。

通常需要清洗3次，每次5-10分钟不等，避免一抗非特异性结合。

7. 第二抗体孵育：将标记有荧光或酶的二抗稀释后，再次孵育膜。

封闭液中的二抗通常是与一抗长在不同宿主动物中的特异性抗体。

孵育时间需要优化。

8. 清洗：再次清洗膜，以去除未结合的二抗。

重复步骤6的清洗方法。

9. 检测：将膜放入检测设备中，如化学发光仪、荧光扫描仪等。

等待信号产生并记录结果。

测定蛋白质相对表达量的强度并进行定量分析。

10.数据分析：使用图像处理软件进行定量分析，如ImageJ等软件，并进行归一化处理，一般以内参蛋白（如β-actin, GAPDH等）数据为基准。

以上就是蛋白印记的基本操作步骤，具体细节及操作条件可能因实验室环境和试剂不同而有所差异。

WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤Western Blot详细实验步骤及试剂配方1. 溶液配置1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）药品用量1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mLSDS 0.5 gBPB（溴酚蓝，有毒）25 mg甘油 2.5 mL去离子水up to 5 mL分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。

1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）药品用量Tris 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144.2 gSDS 10 gddH2O up to 1 L室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。

1.3 Tris-HCl缓冲液（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶Tris (MW: 121.14) 45.43 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 8.8（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶Tris (MW: 121.14) 30.29 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 6.8二者高压灭菌后，置于室温保存即可。

1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)SDS 10 gddH2O up to 100 mL室温保存即可。

1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g超纯水up to 1 mL混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。

1.6 30% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 150 g甲叉双丙烯酰胺 4 gMilli-Q水 30 mL滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。

1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)Tris (MW: 121.14) 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144 g去离子水 up to 1 L室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。

免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和鉴定蛋白质的存在以及其在不同样本中的表达水平。

下面将详细介绍WB实验的具体步骤。

1.细胞裂解和蛋白质提取：首先将待检测的组织样本或细胞样本通过离心将其收集，并添加适量的裂解缓冲液。

使用超声波或机械破碎手段将细胞打乱，使蛋白质溶解在裂解缓冲液中。

再通过离心去除细胞碎片和细胞核等。

2.蛋白质浓度测定：根据实验需要，采用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法测定蛋白质浓度，以确定后续实验的载体中待加载的蛋白质量。

3.蛋白质电泳：将相同量的蛋白质样品加入SDS-凝胶槽中，进行电泳。

电泳时蛋白质在凝胶中向阴极迁移，分子量小的蛋白质迁移速度较快，分子量大的较慢。

电泳结束后，将凝胶转移到膜上。

4.膜上瞬时染色：在转移至膜上后，可以使用Ponceau S染色或其他瞬时染色方法，以确认蛋白质在膜上的存在和转移效果。

5.阻断：在膜上的蛋白质检测之前，需要对膜进行阻断处理，以防止非特异性结合。

常用的方法是在膜上加入牛血清蛋白或脱脂奶粉的溶液，进行阻断。

6.一抗反应：加入已稀释好的一抗抗体，与目标蛋白质特异性结合。

一抗的选择要根据待检测蛋白的特异性来确定。

7.清洗：一抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的一抗抗体。

8.二抗反应：9.清洗：二抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的二抗抗体。

10.显色和成像：使用显色剂（如ECL）使膜上的蛋白质发生化学发光反应，然后将膜放入X射线片中，进行曝光。

最后使用化学显影废片机或Gel Doc System等设备进行成像。

11.数据分析：使用专业的成像软件分析成像结果，计算蛋白质的相对表达水平，并与内参蛋白进行比较。

需要注意的是，在进行WB实验的过程中，要严格操作，避免污染和交叉反应的出现。

同时，应根据实验需求选择适当的试剂和抗体，并进行标记、保存和储存等操作。

Western blotting步骤一：配胶用具：玻璃板（厚板和薄板），海绵垫，梳子，移液枪（1000ul、200ul、20ul等）。

试剂：分离胶成分10%（水、Tris8.8、40%丙烯酰胺、10%APS、TEMED），浓缩胶5%（水，Tris6.8、40%丙烯酰胺、10%APS、TEMED），压线液异丙醇。

过程：1.配制40%的丙烯酰胺溶液，放4℃保存，配制10%APS溶液（0.1g/ml)，备用2.用一蒸水清洗玻璃板，海绵垫和梳子用自来水冲洗，必须冲洗干净，放入烘箱中烘干。

3.组装玻璃板，放入架子中夹紧，注意板一定要平齐后再放入，将各个量程的移液枪调至所需的量程，先配分离胶，加入各组分至50ml离心管中（最后加TEMED），充分混匀后，立即加入板中，注意沿着玻璃板壁加入，加至液面与板子凹槽平齐，立即加入0.5ml 高度的压线液异丙醇赶走气泡，并及时清洗配胶用的管子以防凝固，30min后待出现折光线即可倾倒去除异丙醇，用吸水纸将残留液体吸净，再配浓缩胶。

4.浓缩胶配制类似分离胶，配好后加入到玻璃板中，至顶部加满即可，插入梳子，及时洗配液管，待凝固后拆板，用双蒸水浸泡，现用或放入4℃冰箱中存放平衡，待第二天取用。

注意：APS，为白色粉末，常温保存，10%APS存于-20℃冰箱配置时提前半小时取出放置室温预热。

TEMED需4℃保存丙烯酰胺粉末，常温保存即可，而40%的丙烯酰胺溶液则需4℃避光保存步骤二、电泳用具：移液枪（20ul，100ul)，上样枪头试剂：marker，蛋白样品（已加上样缓冲液和100℃，5min加热处理）准备工作：配制10*电泳液保存，电泳时稀释成1*的电泳液1L现用过程：将玻璃板装入电泳架中，放入电泳槽中，垂直拔出梳子，先在两板内侧加满电泳液，外侧加一些，不得影响上样，吹打胶丝，去除样品孔中的气泡，上样20ul每孔，左端和右端不加样组分别加多（5ul）和少（2.5ul）的marker，枪头可以看出界线，主要是使marker 的量不一样，右端的多颜色深，左端的量少颜色浅，能区分左和右。

献给初学者：westernblot操作步骤详解（下）上回说到如何进行蛋白质的样品制备、蛋白质定量及 SDS－PAGE 电泳，如果你还没看过，点此详见：《献给初学者：western blot 操作步骤详解（上）》。

下面就跟大家讲讲接下来的步骤。

四、转膜我们实验室使用的是半干转膜电泳槽。

对于转印90 kd 以下的蛋白，转膜液都不用加SDS,如果是蛋白分子量大的话可以加入0.037% 的 SDS。

1.在电泳结束前20 min 开始准备转膜所需的东西。

转一张膜需准备 6 张的滤纸（长一般为 8.1~8.3 cm，宽度根据裁的胶大小实际测量，但胶一般会缩水，所以裁 8 cm 就行）和 1 张 PVDF 膜。

切滤纸和膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。

PVDF 膜使用前用无水甲醇中浸泡 1 min~2 min。

目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

2.将玻璃板撬开才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。

撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附带的塑料除霜铲，效果出奇的好）。

除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。

也可取10 ml 注射器吸满转印缓冲液，往玻璃板与凝胶之间注水，使液体的压力将两者自然分开。

取出凝胶后应注意分清上下，可以在右上角裁一个小角。

之后有两种方法供选择，一是按照marker 指示，把含有自己感兴趣的蛋白的胶裁下来，二是把整张胶转膜，前一种方法更加节约材料，但操作稍微麻烦了一点。

在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇的PVDF 膜和滤纸，平衡10 min 左右，也是为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的 SDS。

3.带上手套，平放转移槽的底座，依次在石墨电极上叠放3 张浸泡过缓冲液的滤纸、PVDF 膜（此时可在PVDF 右上角减去一个角，以辨明转膜后的蛋白面与非蛋白面）、刚刚完成电泳的凝胶和另外3 张浸泡过缓冲液的滤纸。

Western blot 实验步骤及其注意事项一.实验步骤1. 组织块称重2. 利用液氮、研钵粉碎组织块3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液9. 沸水浴中3分钟10. 上样11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色14. Westernblot 试剂盒显色15. 分析比较记录western blot的实验步骤及注意事项的资料1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。

1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。

2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。

3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。

4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。

5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。

6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。

2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。

3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。

4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。

5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。

6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。

Western Blot 实验步骤及注意事项western blot的实验步骤及注意事项一、实验步骤1.缓冲液配制(1) Transfor Buffer: 2.9g Glycine, 5.8gTris, 0.37g SDS（可不加）, 200ml Methanol（临用前加）,ddH2O to 1L(2)10×TBS: 1 M Tris・HCl（pH 7.5）100 mL, 88 g NaCl, ddH2O to 1L (3)TBST: 1×TBS中加入1/1000的Tween (4)封闭液：脱脂奶粉5%(w/v),用TBST配制 2. SDS-PAGE电泳电压：积层胶电泳电压80V左右，分离胶电泳电压110V~120V 3.免疫印迹(1) SDS 聚丙烯酞胺凝胶电泳结束后，将胶放至转移缓冲液中浸泡15m in，切6张Whatman 3mm滤纸和1张PVDF膜，与凝胶大小相符合。

将PVDF膜事先用甲醇浸泡，再用转移缓冲液浸泡。

(2) 将凝胶及PVDF膜以“三明治”状(即3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸)逐层铺于转印仪上，凝胶一面连接阴极，100 V转移40 min（根据转移蛋白的分子量确定转移时间）。

(3) 将膜放入小盒中，加入5 mL封闭液，摇床上温育1 h。

(4) 以1/1000的比例，加入5 μL第一抗体，4 ℃温育过夜。

(5) TBST溶液洗膜10 min，轻倒，重复3次。

(6)加入 5 mL TBST溶液，以1/2000的比例，加入2.5 μL第二抗体，温育1 h。

(7) TBST溶液洗膜5min，轻倒，重复3次。

(8)加入2 mL显色底物温育3 min，将薄膜封入保鲜袋中，压平，尽可能不留空气，滤纸吸干显色底物。

放入夹板中。

(9)配制显影液和定影液。

暗室操作：将X光片放入夹板中，曝光5 s（根据荧光强度确定），然后放入显影液中，至出现明显的条带取出，水洗后放入定影液中，定影一段时间，取出用水冲洗干净。

Western-Blot操作流程试剂配制蛋白提取试剂1. RIPA裂解液：50mM Tris（MW121.14，PH7.5） 3.02g150mM NaCl 4.38g1%TritonX-100 5ml1%脱氧胆酸钠5g0.1%SDS 0.5g蒸馏水至500ml。

调pH值至7.5。

混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。

使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。

2. 蛋白酶抑制剂cooktail所需母液成分：（1）100mmol/L PMSFPMSF 17.4mg异丙醇1ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。

（2）10mM 亮肽素leupeptin: -20℃保存（3）2.1mg/ml 抑肽素Aprotinin: 4℃保存配制：成分终浓度每ml裂解液所加母液量PMSF 1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ulLeupeptin 0.1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ulAprotinin 1ug/ml （储存浓度稀释2000倍）0.5ul各成分直接加入所用的RIPA裂解液中，之后按照60ul/孔（12孔板）提取蛋白。

蛋白定量试剂1. G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）考马斯亮蓝G250 100mg95％乙醇50ml85％磷酸100ml蒸馏水至1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存于棕色瓶中。

2．牛血清白蛋白BSA储存液（1mg/ml）：100mg BSA粉末溶于20 ml双蒸水，定容至100 ml，加少量防腐剂，4℃保存。

上样用试剂1．4X上样缓冲液1.0 mol/L Tris·HCl（pH6.8）2mlSDS 0.8g溴酚蓝0.04g甘油4ml去离子水定容至10ml。

混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。

使用时稀释成1X。

2．1.0 mol/L二硫苏糖醇（DTT）（10X）用20 ml 0.01 mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT,分装成1ml小份储存于-20?C。

Western blotting一般操作流程及注意事项Biotnt技术中心1．检查仪器及试剂检查各仪器是否完好可用，各试剂是否在使用期限内，各耗材是否准备充分。

2. 样本前处理及蛋白定量将保存好的样本（注意避免反复冻融）取出，用剪刀和镊子将其剪成实验所需大小，置于离心管中，在管壁上标识样本名称，注意取不同样本时的取样工具要在PBS中清洗，避免交叉污染，在天平上称量样品重量，记录，根据所称重量加入5倍体积的单去污裂解液，用电动匀浆机进行匀浆，在匀浆不同样本时要在PBS中清洗，避免交叉污染，匀浆后在离心机中12000转离心15分钟，取上清液测定蛋白浓度，（注意要尽快测蛋白浓度防止降解），测定用BCA试剂盒，做法依说明书所示。

3. 蛋白变性将测好蛋白浓度的样本进行均一化处理，按照测量蛋白浓度的结果，以样本中最小蛋白含量为参照值，拉平所有样本蛋白浓度，计算在16ul体系下需要加的样本和补足的缓冲液的体积数，（若需要多次试验则准备160ul体系的各体积数），置于90℃金属浴中15分钟。

变性结束后，及时保存好样本，供后续试验使用。

4. 电泳4.1配胶将配胶用的玻璃板置于有洗涤剂的清水中（每周一换）用棉条轻轻擦拭（不可用布，防止划伤玻璃），洗好后用清水冲干净，标准是在玻璃板面上有凝聚的水珠而非大滩的水渍，在操作台上铺一层纸巾，将两块玻璃板放在纸巾上，互相结合面朝上，用吹风机吹干板上水珠，若有残留，用纸巾将水珠点干，避免大面积擦拭划伤玻璃。

手持已经干燥的玻璃板，注意手持玻璃板边缘，将其重合好后，置于制胶器中，用楔子固定，注意观察两玻璃底面与制胶器底部是否水平，缝合良好，将做好的制胶器置于制胶架上，（制胶架擦拭干净），固定时将两侧的固定轴同时往里挤压，然后双手同时顺时针转动至所需标的角度上（1.0mm的胶转至1.0mm刻度以此类推），听到双手转至咔的一声，固定结束。

配置分离胶，按照试剂配置表，准备好相应的试剂，注意试剂的保存条件，配胶时要迅速，防止时间过长凝胶，若温度过低导致试剂沉淀，凝结，则需在37℃水浴中将其混合均匀，配好后，用900ul的枪在一面玻璃板上加5枪，注意加的时候要缓慢加，避免漏胶，避免混入气泡，然后用枪在板面各处滴加水滴压胶，至与板面水平，制好后等待20分钟以便凝胶，若温度过低，需要置于室温20℃环境中凝胶，或者延长凝胶时间。

【分享】个人整理Western Blot！！！1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。

)储于棕色瓶，4℃避光保存。

严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。

使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。

如有沉淀，可以过滤。

2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。

3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL 混合，加水稀释到100ml终体积。

过滤后4°C保存。

4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。

过滤后4°C保存。

这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。

5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。

PH太低时，聚合反应受到抑制。

AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。

去离子水配制数ml，临用前配制.6. 10%过硫酸铵溶液：称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。

7、SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。

8、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀释10倍。

PH8.39、转移缓冲液： 2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS(可不加)，200ml 甲醇(临用前加)，加水至总量1L。

一抗处理（his-tag抗体）①用平头镊子将PVDF膜夹至小饭盒中（蛋白面朝下），加适量PBS缓冲液，将小饭盒置于摇床上，摇晃五分钟。

再重复两次。

②称取牛血清蛋白40mg溶于2mlPBS中，配成浓度为2%的溶液。

③将PVDF膜轻轻夹取到密封的小袋中，加入②中配好的溶液，排去气泡，封好袋口。

将小袋子放在小饭盒中，冰浴摇晃1h。

④按稀释倍数为1:1000将适量的his-tag抗体加入小袋中，轻轻混匀，封好袋口。

（无需换袋，直接加入即可，此次试验我们加入了2μl抗体）⑤将装置放在摇床上，冰浴，过夜处理。

二抗处理（辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG）①用PBS洗一抗后的膜，每次5分钟。

再重复两次②以二抗抗体：PBS=1:1000的比例配好二抗体系③用平头镊子将PVDF膜放入干净，密封性良好的小袋中，加入二抗体系，轻轻混匀，排去气泡，封上袋口。

④将装置放在摇床上，冰浴，摇晃2h。

DAB辣根过氧化物酶显色①用PBS洗二抗后的膜，每次5分钟。

再重复两次②按照DAB显色液A：DAB显色液B=1:1的比例配制成DAB染色工作液。

③最后一次洗涤完毕后，去除洗涤液，将蛋白面朝上置于干净的保鲜膜上，加入适量DAB染色工作液，确保能充分覆盖样品。

④室温避光孵育3-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅。

⑤去除DAB染色工作液，用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应。

⑥显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。

BeyoECL Plus (超敏ECL化学发光试剂盒)染色①用PBS洗二抗后的膜，每次5分钟。

再重复两次②用平头镊将膜取出，用吸水纸略吸去过多的液体(切勿接触膜的蛋白面)，然后置于一洁净保鲜膜上。

③按BeyoECL Plus A液：BeyoECL Plus B液=1:1的比例配置BeyoECL Plus工作液。

④根据膜的大小，按每10平方厘米膜加1ml BeyoECL Plus工作液的比例，滴加BeyoECL Plus工作液到膜上，确保使工作液均匀覆盖在膜上，放置1-2分钟。

蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项实验方法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。

5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸 2 ml；ddH2O118 ml。

Western印迹法这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。

Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。

这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。

仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。

试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。

杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，试剂配制：（一）母液1.0mol/L Tris·HClTris (MW121.14) 30.29g蒸馏水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

PH HCl7.4 约17ml7.5 约16m7.6 约15ml8.0约10ml1.74mg/ml (10mmol/L)PMSFPMSF 0.174g异丙醇100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。

0.2mol/L NaH2PO4NaH2PO4（MW119.98）12g蒸馏水至500ml溶解后，高压灭菌，室温保存。

0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO4·12H2O（MW 358.14）71.6g蒸馏水至1000ml溶解后，高压灭菌，室温保存。

蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。

平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。

重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。

将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。

4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。

（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。

（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。

二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。

蛋⽩质免疫印迹（WesternBlot）实验步骤和原理及注意事项蛋⽩质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋⽩样品(Protein sample preparation)可以使⽤适当的裂解液。

收集完蛋⽩样品后，为确保每个蛋⽩样品的上样量⼀致，需要测定每个蛋⽩样品的蛋⽩浓度。

根据所使⽤的裂解液的不同，需要采⽤适当的蛋⽩浓度测定⽅法。

因为不同的蛋⽩浓度测定⽅法对于⼀些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很⼤。

BCA法。

2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋⽩样品中加⼊适量浓缩的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液。

使⽤5X的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液可以减⼩上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋⽩样品。

100℃或沸⽔浴加热3-5分钟，以充分变性蛋⽩（根据蛋⽩分⼦的⼤⼩，煮沸时间可适当变化，⼀般不低于5min。

煮沸只是变性蛋⽩，⽽不是分解，⼀般加了抑制酶不会分解。

煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋⽩质的⽴体⼆级结构,伸展为⼀维线性结构,所以⼀般来讲⼆聚体都会解体,才能完全按照分⼦量跑电泳,加的蛋⽩Marker才有指⽰分⼦量的意义。

蛋⽩样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋⽩呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离⼼5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另⼀管,4度可以放⼀周备再次电泳）。

(3)电泳i.清洗玻璃板：⼀只⼿扣紧玻璃板，另⼀只⼿蘸点洗⾐粉轻轻擦洗。

两⾯都擦洗过后⽤⾃来⽔冲，再⽤蒸馏⽔冲洗⼲净后⽴在筐⾥晾⼲。

ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放⼊夹中卡紧。

然后垂直卡在架⼦上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

）（2）配10%分离胶，加⼊TEMED后⽴即摇匀即可灌胶。

PH1498|Western Blot一抗二抗去除液（中性）Western Blot Stripping Buffer（Neutral）Catalog No：PH1498Size：☐250mL Store at4℃去除液简介Western Blot一抗二抗去除液（Stripping buffer）可以充分去除结合在印迹膜上的一抗和二抗，使同一张膜可进行多次抗体检测，无需反复电泳和转膜，节省样品和时间，适用于使用NC或PVDF膜进行Western Blot检测时条件的优化或同一样品不同蛋白的检测。

本品经过多个抗体的检测试验，通常可以重复利用3次，每次大约只需15-30min，并且在室温条件下就可以进行。

本类型Western一抗二抗去除液主要在去除结合的一抗二抗的原理方面略有不同。

分别依靠去垢剂、酸性、碱性、还原剂、螯合剂、盐浓度以及一些特殊试剂等的不同组合来解除一抗二抗的结合，同时又不会导致转移到膜上的蛋白的损失。

试剂保存4℃保存，一年有效，如长期不用请放置-20℃保存。

使用参考1.在完成Western化学发光检测后，用蒸馏水或TBST缓冲液漂洗5-10min。

2.弃蒸馏水，加入适量的Western一抗二抗去除液（中性），至少需把膜完全覆盖。

在摇床上室温缓慢漂洗25min左右（漂洗时间应根据不同的目的蛋白来调整：比如内参抗体等表达量较高的蛋白，可以延长漂洗时间至30min）。

3.弃Western一抗二抗去除液，用蒸馏水或TBST缓冲液洗膜3次，每次10min，室温振摇。

4.剥脱后的膜加入封闭液进行封闭，进行下一轮的WB实验。

注意事项1、用辣根过氧化物酶(HRP)，任何一次封闭(blocking)都应当使用5%脱脂牛奶，如果使用碱性磷酸酯酶，任何一次封闭都应当使用酪蛋白(casein)。

2、本Western一抗二抗去除液仅适用于PVDF膜。

用于硝酸纤维素膜时会导致转移到膜上的蛋白有非常显著的损失。

3、使用ECL等类似的化学发光试剂进行的Western检测适用本试剂。