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gapdh分子量内参 wb
GAPDH（糖酵解酶磷酸化酶-巯基磷酸化酶）是一种常用的内参蛋白，用于Western Blot（免疫印迹）实验中。
GAPDH分子量约为36 kDa。
在进行Western Blot实验时，GAPDH常被用作内参蛋白的选择，用来校正样品之间的蛋白负荷差异。
通过对GAPDH的检测，可以确定蛋白表达的相对水平，并将其与其他目标蛋白的表达进行比较。
要探究特定蛋白在不同条件下的表达变化，首先需要提取细胞或组织中的总蛋白，并经过电泳分离。
然后，将蛋白转移到膜上，并使用特定的抗体进行免疫反应。
最后，使用二抗结合的荧光标记或酶标记的二级抗体来识别并可视化蛋白。
在Western Blot实验中，将样品中的蛋白质进行电泳分离后，通过转移至膜上进行免疫检测。
GAPDH作为内参蛋白的存在，可以作为加载和转移效果的标准。
其分子量为约36 kDa，因此可以作为控制带的选择，帮助确定蛋白负荷的相对水平。
内参Beta-actin和GAPDH使用的局限性大部分科研新手接触到的第一个实验就是蛋白免疫印迹(Westernblot e Immunoblotting)。
做这个实验最基本的步骤就是内参的选择，但是各位小伙伴有没有想过你为什么要用Beta-actin，又或者是GAPDH。
我相信你一定听师兄师姐说过“都一样”，“哪个能和目的蛋白分开就用哪个”、要么就是“以前一直用的哪个所以就用哪个”。
那么小伙伴你们觉得，真的是这么随意选择的吗？今天我就跟大家一起探讨一下两大内参 Beta-actin 和 GAPDH 使用的局限性。
Beta-actin: 脊椎动物 actin 分为α、β 和γ 三种类型，α 型主要表达于心肌和横纹肌细胞中，β 及γ 型主要表达于非肌细胞中 (这句来自百度百科)。
那么Beta-actin 的局限性具体体现在哪里呢？Angela Dittmer 等人通过使用不同抗体配比浓度 Beta-actin (1:1000, 1:2000, or 1:4000, Cell Signaling #4967) 以及不同的总蛋白质量（3.8 μg、7.5 μg、15 μg）进行实验，结果发现：1:1000 稀释时，三种总蛋白浓度的条带区别不大；而当1:4000 稀释时，才能看到Beta-actin蛋白表达会随着总蛋白质量的升高而变化（Figure 1）。
之后作者采用不同蛋白质量（0.06 μg、0.12 μg、0.23 μg、0.47μg、0.94 μg、1.88 μg、3.75 μg、7.5 μg）继续进行实验，结果显示，当总蛋白超过一定质量时，Beta-actin 条带的灰度值将不会再随着总蛋白质量的升高而升高。
换而言之，你一个样品的总蛋白质量是1.88 μg，另一个样本的总蛋白质量是7.5 μg，结果两个样本的Beta-actin 条带一摸一样（Figure 2）[1]。
怎么样，意不意外，惊不惊喜。
WB检测抗体如何选择WB检测之二抗二抗选择二抗是用一抗免疫动物制备的抗一抗的抗体，选择范围较窄，基本是商品化的，在不考虑二抗修饰类型的前提下，二抗的选择需要遵循以下原则：二抗来源种属、一抗来源种属和抗原来源种属互不相同。
例如如果研究对象是人的蛋白X，选择了鼠抗X一抗，则可选择兔抗鼠二抗或者羊抗鼠二抗。
二抗选择要考虑的问题有：①对单抗类一抗，二抗需与一抗的类别或亚类相匹配（多抗类一抗主要是IgG类免疫球蛋白故相应二抗就是抗IgG F(ab’)2二抗，避免各种Ig保守结构域导致的交叉反应。
然而各种Ig仍具有保守的轻链结构域，因此还是有一定程度的交叉反应。
WB检测之内参抗体Western Blot检测方法不仅能检测靶蛋白存在与否，还能比较不同条件下或者不同组织中靶蛋白的相对表达量，可作为蛋白表达水平最直接的证据。
在WB实验中有众多不确定因素影响靶蛋白表达水平的测定，如方法学本身性质、操作误差等。
为准确衡量靶蛋白表达水平，需要精确一致的上样量，使用内参的意义即是保证上样量的一致。
内参即内部参照（Internal Control），对哺乳动物细胞一般指管家基因的表达蛋白(Housekeeping Proteins)。
此类蛋白在各组织和细胞中的表达相对恒定，可作为检测蛋白表达水平变化的参照物。
当内参条带亮度基本一致时，基本可以确定上样量是一致的，通常采用比较靶蛋白和内参蛋白条带亮度比值来进行相对定量。
WB实验中涉及到的蛋白-抗体结合是一个复杂的活性生物大分子间的相互作用，众多因素都会影响实验的结果。
例如时间、温度、浓度、离子强度等，在实验设计时就需要有严谨的对照方案，通过对照就容易判断问题所在，严谨的WB实验中需要设立蛋白分子量标准、空白载体对照、未诱导对照、已知量标准物正对照和内参。
内参使用方法1.标记内参：酶标的内参抗体可避免二抗结合总蛋白中某些免疫球蛋白产生的杂带，使用时只需在二抗孵育时加入酶标内参抗体，按照正常操作即可。
常用的标签抗体丨myc、HA、Flag、His、GST等三大内参：beta Actin，肌动蛋白，细胞骨架蛋白。
它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。
beta Actin 作为内参是得到公认的，针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞质内，表达量非常丰富。
但是在一些少量特殊的情况下比如脂肪组织和细胞内，beta Actin 的表达量就很少。
GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，该酶是糖酵解反应中的一个酶，几乎在所有组织细胞中都高水平表达，在同种细胞或组织中的表达量一般是恒定的，且很少受外部诱导物的影响。
但比如缺氧和糖尿病等疾病存在下，会增加 GAPDH 在特定细胞和组织中的表达。
beta Tubulin，微管蛋白，细胞骨架蛋白。
β-Tubulin小鼠单克隆抗体(3G6) 作为内参抗体，beta Tubulin 表达通常不会发生改变，因此被广泛用于 Western Blot 内参，也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。
标签抗体：Flag抗体-抗Flag标签抗体融合标签，如Flag、GST等标签的使用可以简化蛋白质的纯化过程、控制蛋白质固定的空间取向及方便检测、使体内生物事件可视化、提高重组蛋白质的产量、增强重组蛋白质的可溶性和稳定性等。
常用的标签包括myc、HA、Flag、His、GST等。
其中Flag标签系统利用一个短的亲水性八氨基酸肽（DYKDDDDK）融合到目标蛋白。
His抗体-抗His标签抗体融合标签根据其相对分子质量大小可以分为两大类：大的蛋白质分子和小的多肽片段。
融合标签的使用可以简化蛋白质的纯化过程、控制蛋白质固定的空间取向及方便检测、使体内生物事件可视化、提高重组蛋白质的产量、增强重组蛋白质的可溶性和稳定性等。
GST抗体-抗GST标签抗体随着越来越多的新基因的发现，基因融合蛋白表达体系以其在新发现蛋白研究中的显著优势已得到广泛应用。
其中GST标签体系具有蛋白表达产率高、表达产物纯化方便，以及利于GST抗体制备等特点。
GAPDH抗体WB, Western blot; IF, Immunofluorescence; IHC, Immunohistochemistry.Mam, mammalian, including human, mouse, rat, pig, rabbit, dog, cat; C, chicken; Fi, fish; Fr, frog. 不能用于检测bovine和yeast样品。
本GAPDH抗体(GAPDH antibody，也称为G3PDH antibody)为进口分装，用从兔肌肉纯化获得的GAPDH作为抗原制备而成的抗GAPDH小鼠单克隆抗体。
克隆号为6C5。
GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)是糖酵解(glycolysis)过程中的关键酶之一。
GAPDH由4个分子量约为36kD的亚基组成，总的分子量为146kD。
在SDS-PAGE凝胶电泳时解聚为单体，显示的分子量约为36kD。
哺乳动物的GAPDH除了在糖酵解过程中起作用外，还和membrane fusioin，microtubule bundling, RNA出核运输，DNA复制和DNA修复等有关，并和前列腺癌、神经细胞凋亡、神经退行性疾病等相关。
GAPDH几乎在所有组织和细胞中组成性高表达。
只有缺氧和糖尿病等情况可以在某些细胞中上调GAPDH的蛋白水平。
GAPDH在各种组织和细胞中都组成性高表达，因此被广泛用于Western时上样量是否一致的参照(loading control)。
配套提供了Western一抗稀释液，可以用于Western检测时的一抗稀释。
)：保存条件：GAPDH抗体-20℃保存，Western一抗稀释液-20℃或4℃保存，一年有效。
Western一抗稀释液优先推荐4℃保存，长期不使用可以考虑-20℃保存，但冻融可能会导致出现轻微的浑浊和少量不溶物。
小鼠常用内参基因
小鼠常用内参基因是进行实验研究时非常重要的工具，内参基因是一种用于标准化实验结果的参照基因，用于减少实验中因样本差异和反应效率的影响。
在小鼠实验中，常用的内参基因包括GAPDH、β-actin和18S rRNA等。
GAPDH（糖酵解酶）是一种广泛存在于细胞中的酶，参与细胞内的糖酵解代谢过程，同时也是常用的内参基因。
在小鼠实验中，GAPDH 的mRNA水平是相对稳定的，因此可以作为实验中的内参基因使用。
另一个常用的内参基因是β-actin（β-肌动蛋白），β-actin
是构成细胞骨架的主要成分之一，也是一种常用的内参基因。
在小鼠实验中，β-actin的mRNA水平也是相对稳定的，因此可以用来进行实验结果的标准化。
18S rRNA是小鼠细胞中的核糖体RNA，也是常用的内参基因之一。
18S rRNA的mRNA水平在细胞中是相对稳定的，因此可以用来进行实验结果的标准化。
除了上述几种常用的内参基因外，还有许多其他的内参基因可以用于小鼠实验中。
但无论选择哪种内参基因，都需要进行验证，确保其在实验条件下的稳定性和可靠性。
只有选择合适的内参基因，才能保证实验结果的准确性和可靠性。
- 1 -。
在western blot 实验中，内参的使用是个很重要的部分，看到很多站友对内参的选择经常有些疑问，鉴于此，希望能在一个帖子里面综合所有相关问题，展开讨论，共同学习。
我先提几个，抛砖引玉，希望大家继续。
1。
为什么一定需要内参？内参的重要性。
2。
常用的几种内参。
3。
不同的情况如何选择不同的内参。
支持一下！1：用内参照是为了评价你的各个上样孔内蛋白的总量是否基本一致，通常使用一些看家蛋白，比如β-actin、GAPDH等等。
这些蛋白在所有细胞中的表达量基本一致，所以用他们来作为你加样量的对照。
这样western结果中你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。
这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或是人为造成目的条带浓度的变化。
严格意义上说，内参事必须做的。
2：常用的内参有：b-actin，GAPDH，近2-3 年，更详细的研究发现，β-Tubulin (球管蛋白)，被广泛应用于Western Blotting，β－Tubolin分子量为55KD左右。
3：一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。
因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参！个人一些见解，供参考！内参的重要性，必要性：要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。
因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。
虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。
所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。
硕士：GAPDH作为原核及真核生物通用型内标蛋白的研究及相关生物技术研发,毕业,毕业专题,硕士：GAPDH作为原核及真核生物通用型内标蛋白的研究及相关生物技术研发GAPDH作为原核及真核生物通用型内标蛋白的研究及相关生物技术研发吴永红；【导师】张成岗；【基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，生物化学与分子生物学，2013，硕士【摘要】甘油酸-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)是生物体内一类十分保守的重要多功能酶类，广泛存在于原核及真核生物体内，如大肠杆菌、酵母、秀丽线虫、大鼠和小鼠等模式生物，主要参与生物体内糖代谢中糖酵解的第六步反应，即催化甘油醛-3-磷酸转化为1,3-二磷酸甘油酸并释放出能量(ATP)的过程。
生物界中GAPDH单体分子量大小在30kD-40kD之间，天然状态的GAPDH主要以四聚体形式存在，其氨基酸编码序列在原核及真核生物体内均高度保守，同源性高达76%。
原核及真核生物体内GAPDH蛋白是一类功能上十分保守的重要蛋白酶超家族，在不同的物种中分别由不同的基因编码，如微生物的gapA, gapB和gapC基因、酵母菌的TDH-1, TDH-2和TDH-3基因、秀丽线虫的gpd-1,gpd-2, gpd-3和gpd-4基因、大鼠的G3PDH基因等。
不同物种中多种编码基因的存在一方面提示了不同GAPDH变体之间的功能代偿性，另一方面反映了个体应对环境压力的高度可调控性，为其作为管家蛋白的功能保守性提供了重要依据。
内标蛋白是生物体内一类重要的管家蛋白，具有序列保守性高、组织分布广等特点。
目如常见的内标蛋白主要包括：细胞骨架蛋白肌动蛋白actin、微管蛋白Tubulin、细胞代谢相关蛋白GAPDH等。
其中，GAPDH在同种细胞或组织中的蛋白表达量相对恒定，且很少受外部应激因素的影响，已被广泛用作RT-PCR和Western blot等分子生物学实验标准化的内参分子，特别是其作为内标蛋白在组织或细胞内蛋白相对表达定量中的应用。
GAPDH抗体大全——总有一款合适的GAPD H抗体在Weste rn Blotin g实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确，或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差；这些误差可以通过测定每个样品中实际转到膜上的内参，比如内参GA PDH的含量来进行校正。
当然除了GA PDH抗体，β-Actin抗体、β-Tubuli n抗体等也是最常见的内参抗体。
GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kD a。
GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作We stern blot蛋白质标准化的内参。
选择合适的G APDH抗体显得尤为重要，首先GAPD H的WB检测条带大约为36kD a，因此对于一些待检测分子量大于40kDa或者小于30k Da的目的蛋白尤为合适。
一般来说，国产的抗体在质量稳定性、效价等方面存在不足，但是进口品牌如Abca m、Millip ore、CST等价格偏高，一般在￥3000/100ul左右。
下面我们为您推荐三款G APDH原装进口抗体，分别是美国E arthO x和Pro teinT ech的产品。
EarthO x 的Ant i-GAPDHMonocl onalAntibo dy（货号E021010）是小鼠源的单抗，其效价很高，厂商推荐的W B起始稀释比率为1:1000，实际应用过程中，有使用1:10000或更高的报告，远远高于此稀释比率，说明其免疫效价很高，另外，其检测种属也很多，包括人、牛、猪、小鼠、大鼠等。
右图为Ear thOx的Anti-GAPDHMonocl onalAntibo dy（货号E021010）在不同细胞系内WB的检测结果。
内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。
常用的PCR内参有GAPDH 、β- actin 、18sRNA、28sRNA 、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP内参基因等正向引物（上游引物）是沿着负链进行不间断延长的反向引物（下游引物）是沿着正链进行一段段延长的正链是含有目的基因的那条链。
RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。
逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。
在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。
RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。
RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。
RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。
常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia vrius,MMLV）反转录酶。
RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。
为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。
GAPDH分子量内参WB1. 任务背景Western blotting (WB)是一种常用的蛋白质检测方法，它可以用于定性和定量分析特定蛋白质在样本中的表达水平。
在WB实验中，内参蛋白是一个重要的参考标准，用于校正样本间的差异。
GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)是一种常用的内参蛋白，其分子量是一个重要的参数。
2. GAPDH简介GAPDH是一种催化糖酵解过程中糖醛酸-3-磷酸脱氢酶的酶。
它参与糖酵解途径中糖醇磷酸化和糖醛酸脱氢的反应。
GAPDH广泛存在于细胞质和线粒体中，是一种高度保守的蛋白质。
GAPDH在细胞代谢中起着重要的作用。
它不仅参与糖酵解途径，还参与脂肪酸合成、核酸合成、蛋白质合成等多种生物学过程。
由于其丰度相对稳定，GAPDH被广泛用作WB实验的内参蛋白。
3. 分子量测定分子量是蛋白质的一个重要特征，可以通过多种方法进行测定。
在WB实验中，分子量通常通过与已知分子量的蛋白质进行比较来确定。
对于GAPDH，其分子量大约在36-40 kDa之间。
常用的测定分子量的方法有SDS-PAGE和蛋白质标记。
SDS-PAGE是一种常用的蛋白质分离方法，通过电泳将蛋白质按照分子量大小进行分离。
在SDS-PAGE中，GAPDH 可以通过与已知分子量的蛋白质标记进行比较来确定其分子量。
4. GAPDH作为内参蛋白在WB实验中，内参蛋白用于校正样本间的差异，以确保可靠的定量结果。
选择合适的内参蛋白是非常重要的，因为它应该在不同样本中稳定表达。
GAPDH是一个常用的内参蛋白，因为它在大多数细胞和组织中都以相对稳定的水平表达。
选择GAPDH作为内参蛋白有以下几个原因：1.GAPDH广泛存在于不同类型的细胞和组织中，其表达水平相对稳定。
2.GAPDH的分子量较大，不易受到蛋白质修饰的影响。
3.GAPDH在多种生物学过程中参与，其表达水平不易受到外界因素的影响。
染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种常用的分子生物学技术，用于研究特定蛋白质与染色质的相互作用。
在ChIP实验中，通常需要使用一个内参基因（Internal Control Gene）来进行标准化和相对定量分析。
内参基因是一个在实验条件下稳定表达的基因，其表达水平不受实验条件影响，通常被用作实验的比较基准。
选择合适的内参基因对ChIP实验的准确性和可靠性至关重要。
以下是一些常用的内参基因，可以在ChIP实验中进行使用：
1. GAPDH（糖酵解途径的磷酸化酶酶）：GAPDH是一个常用的内参基因，参与糖酵解途径，在许多条件下都表达稳定。
2. ACTB（β-actin）：β-actin是细胞骨架中的重要蛋白质，也是常用的内参基因。
3. 18S rRNA（18S核糖体RNA）：18S rRNA是核糖体RNA的一部分，其表达水平相对稳定，可用作内参基因。
4. TBP（TATA-box结合蛋白）：TBP是转录起始点附近的一个常见结合蛋白，其表达水平在一些条件下相对稳定。
5. RNAPolII（RNA聚合酶II亚单位）：RNA聚合酶II是参与基因转录的主要酶，其亚单位在ChIP实验中常被用作内参基因。
在进行ChIP实验时，研究者通常会验证选定的内参基因是否在实验条件下保持稳定表达，并使用合适的实验对照组来进行比较。
选择合适的内参基因可以帮助消除实验误差，提高数据的可靠性和解释性。
专利名称：一种重组内参GAPDH抗体的制备方法及应用专利类型：发明专利
发明人：华权高,沈鹤霄,易汪雪,罗绍祥
申请号：CN201611256090.6
申请日：20161230
公开号：CN106749669A
公开日：
20170531
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种重组内参GAPDH抗体的制备方法及应用，包括以下步骤：步骤(1)：获取GAPDH抗体重链及轻链可变区序列；步骤(2)：构建重链轻链表达载体；步骤(3)：共转293T细胞表达GAPDH抗体，用抗性筛选含有两种质粒的细胞株293T细胞，培养细胞株后得到GAPDH抗体。
本发明能解决现有技术所制备的抗体批间差大，周期长及检测易受样本质量干扰等问题。
申请人：武汉金开瑞生物工程有限公司
地址：430000 湖北省武汉市东湖开发区高新大道818号高科医疗器械园B11号1楼、2楼
国籍：CN
代理机构：武汉智嘉联合知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：黄君军
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GAPDH内参抗体，抗GAPDH单抗，GAPDH小鼠源单克隆抗体Anti-GAPDH Mouse Monoclonal Antibody （ 2B5）在Western Bloting实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确，或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差；这些误差可以通过测定每个样品中实际转到膜上的内参，比如内参GAPDH的含量来进行校正。
GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。
GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。
应用类型：WB（1:1000-1:10,000）、IHC（1:100-1:800）Fig.Western blot analysis (1:10,000) of GAPDH expression in Rat brain (lane A), HeLa cell lysate (lane B), Mouse brain (lane C), Rabbit muscle (lane D), Chicken muscle (lane E) and Pig heart (lane F) with Anti-GAPDH mouse monoclonal antibody (2B5). 免疫原：KLH偶联的GAPDH部分多肽序列来源宿主：小鼠反应性：该GAPDH内参抗体可识别人、小鼠、兔、大鼠、猴、狗、鸡、猪和绵羊等种属的GAPDH蛋白。
保存建议：能在-20℃保存1年。
为最大限度的避免损失，请在打开管盖之前融化抗体并离心。
建议使用前分装以避免反复冻融，分装后可在4℃保存1个月。
GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。
GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。
中国水产科学 2017年9月, 24(5): 1003-1012 Journal of Fishery Sciences of China研究论文收稿日期: 2017-01-13; 修订日期: 2017-03-02.基金项目: 江苏省农业科技支撑计划项目(BE2013363); 江苏省高校“青蓝工程”培养基金项目; 江苏省2015年度普通高校研究生科研创新计划项目(KYLX15_1486); 连云港市产学研合作项目(CXY1517); 淮海工学院江苏省海洋生物技术重点实验室研究基金项目(2015HS001).作者简介: 薛蓓(1992–), 女, 硕士研究生, 研究方向为海洋生物繁殖与遗传育种学. E-mail: malvsy@ 通信作者: 阎斌伦(1962–), 男, 教授, 研究方向为甲壳类种质资源开发及利用. E-mail: yanbl@ DOI: 10.3724/SP.J.1118.2017.17018脊尾白虾GAPDH 基因的克隆及其内参基因稳定性分析薛蓓1, 2, 3, 张培1 ,2, 3, 李志辉1, 2, 3, 赵莲1, 2, 3, 赖晓芳1, 2, 3, 高焕1, 2, 3, 李健4, 阎斌伦1, 2, 31. 淮海工学院 海洋生命与水产学院, 江苏省海洋生物技术重点实验室, 江苏 连云港 222005;2. 江苏省海洋生物产业技术协同创新中心, 江苏 连云港 222001;3. 江苏省农业种质资源保护与利用平台, 江苏 南京 210014;4. 中国水产科学研究院 黄海水产研究所, 山东 青岛 266071摘要: 为比较甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、18S rRNA 和β-actin 基因在脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda )作内参基因的优劣, 本研究采用同源克隆和RACE 技术, 克隆了脊尾白虾GAPDH 基因全长cDNA 序列(GenBank 登录号: KX893516), 通过实时荧光定量PCR(quantative real-time PCR, qPT-PCR)技术, 检测3种基因在脊尾白虾不同组织及不同蜕壳后时间点的表达量变化, 在此基础上进行内参稳定性分析。
研究内容不一样，WB内参选择有差别，别做什么蛋白都选GAPDH前段时间曾经给大家介绍过组织、细胞中提取蛋白质的基本方法、注意事项及在选择不同类型裂解液时，结果出现的偏差。
在提取蛋白的时候，总发现提取的蛋白量很少，这样就得好好排查下每个环节可能出现的问题，尤其得考虑，裂解液是否合适？接下来，跟大家聊聊挑选WB内参的那些事！首先，先了解下，WB实验中，内参的主要作用：（1）第一点：主要起到校正作用，在蛋白样品定量及上样过程中产生的误差，在内参参与条件下以保证实验数据的准确性。
（2）第二点：就是可作为空白对照，检测蛋白转膜是否完整及发光显色是否正常！其次，进入今天的重点话题，如何挑选WB内参？挑选蛋白内参是非常有讲究的，现在给大家一一列取下：（1）首先，要看你研究样本的种属性，研究动物、人、植物的内参选择有天壤之别！（2）其次，需要考虑目的蛋白分子量大小，其中内参与目的蛋白分子量大小有一定的差距，一般为相差5KD以上，这个具体情况具体选择。
（3）接着就是蛋白表达部位差异问题，不同细胞器中蛋白检测，挑选内参也有差别。
如：全细胞/细胞质中的内参有以下几种供参考：β-actin、GAPDH、α-actin、β-tubulin及vinculin等等；细胞核：LaminB1、HDAC1、PCNA等等；线粒体：VDCA1、porin等；内质网：calreticulin 溶酶体：LAMP2等等。
其实还有很多，大家非常感兴趣可以专门查找相关文献阅读阅读。
（4）最后，也是最重要的内容——得考虑实验处理条件对内参的影响问题，如：研究糖酵解过程中的蛋白，特别典型的就是糖尿病类疾病，这样就不可在选择GAPDH作为内参了，因为GAPDH是糖酵解过程中重要的酶！还有还有，缺氧内实验，也千万不能选择GAPDH作为内参。
除了这些，经过在实验和理论中探讨，对比了不同内参的实验结果，还发现做细胞毒性实验，不可选择TATA binding protein 和Lamin B作为内参，会直接影响实验结果。
GAPDH内参抗体，抗GAPDH单抗，GAPDH小鼠源单克隆抗体
Anti-GAPDH Mouse Monoclonal Antibody （ 2B5）
在Western Bloting实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确，或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差；这些误差可以通过测定每个样品中实际转到膜上的内参，比如内参GAPDH的含量来进行校正。
GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。
GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。
应用类型：WB（1:1000-1:10,000）、IHC（1:100-1:800）
Fig.Western blot analysis (1:10,000) of GAPDH expression in Rat brain (lane A), HeLa cell lysate (lane B), Mouse brain (lane C), Rabbit muscle (lane D), Chicken muscle (lane E) and Pig heart (lane F) with Anti-GAPDH mouse monoclonal antibody (2B5).
免疫原：KLH偶联的GAPDH部分多肽序列
来源宿主：小鼠
反应性：该GAPDH内参抗体可识别人、小鼠、兔、大鼠、猴、狗、鸡、猪和绵羊等种属的GAPDH蛋白。
保存建议：能在-20℃保存1年。
为最大限度的避免损失，请在打开管盖之前融化抗体并离心。
建议使用前分装以避免反复冻融，分装后可在4℃保存1个月。
GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。
GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。
因为GAPDH 作为看家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，因此在使用GAPDH内参抗体时，将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。
如何选择合适的GAPDH抗体？
内参抗体虽然选择较多，但是也需要遵循一定的原则，并契合实际的应用要求。
首先，需要考虑目的蛋白的大小，我们推荐内参要与检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上，因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参，由于GAPDH的检测分子量大约在36kD，因此该内参抗体不是很适合用于检测30kD-40kD大小目标蛋白的WB实验中。
另外，不同的组织来源的样本在选择内参时还有一定的区别。
比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，不适合做内参。
