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gapdh分子量内参 wb
GAPDH（糖酵解酶磷酸化酶-巯基磷酸化酶）是一种常用的内参蛋白，用于Western Blot（免疫印迹）实验中。
GAPDH分子量约为36 kDa。
在进行Western Blot实验时，GAPDH常被用作内参蛋白的选择，用来校正样品之间的蛋白负荷差异。
通过对GAPDH的检测，可以确定蛋白表达的相对水平，并将其与其他目标蛋白的表达进行比较。
要探究特定蛋白在不同条件下的表达变化，首先需要提取细胞或组织中的总蛋白，并经过电泳分离。
然后，将蛋白转移到膜上，并使用特定的抗体进行免疫反应。
最后，使用二抗结合的荧光标记或酶标记的二级抗体来识别并可视化蛋白。
在Western Blot实验中，将样品中的蛋白质进行电泳分离后，通过转移至膜上进行免疫检测。
GAPDH作为内参蛋白的存在，可以作为加载和转移效果的标准。
其分子量为约36 kDa，因此可以作为控制带的选择，帮助确定蛋白负荷的相对水平。
刚开始接触western，看了很多和内参有关的资料，越来越迷惑。
请教园子里的高手：1 内参的主要作用是什么，是必须的吗? 2 内参是和样品一起加，还是单独加，抗体孵育时是分着加，还是一起，条件一致吗？3 单是证明是否样品中存在某蛋白，不用内参可以吗？请赐教！1、在实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确；或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差；这些误差需要通过测定每个样品中实际转到膜上的GAPDH 的含量来进行校正，所以一般的western实验都需要进行内参设置。
具体校正的方法就是将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH 含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量。
然后才进行样品与样品之间的比较。
所以有时候要用内参2、和一抗一起加，按照内参的比例加3、可以不用加内参1.内参是样品中本身就有的，有其一定的分子量。
一抗.二抗时得分开孵育。
2.只是定性的话不需要加内参Western Blot除了能证明某样品中含有某种蛋白之外，其最为重要的作用是比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少。
即为蛋白表达水平最直接的证据。
要衡量蛋白的表达水平，前提条件就是等量的上样量。
内参的意义就是保证上样量的一致。
内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。
如果内参的条带亮度基本一致，那么就可以认为上样量也基本一致。
常用的蛋白质内参有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。
最近发现tubulin的表达水平比其它看家基因更加恒定。
因此人们越来越多的使用tubulin做为内参。
在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有：一、超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。
Western blot内参要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。
因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。
虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。
所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。
特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。
良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小）、空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照）、已知量标准产物的正对照，另外还有内参。
可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot 往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果，即便有结果也可能影响结果的分析。
内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。
在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
实际上内参是最容易被忽略的一项。
我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础，特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析，所以需要内参。
定量Western Blot 一定要有内参质控（上）Western blot是生物修炼的一大实验，现在不做定量Western blot，都不敢自诩学霸的了，暗暗擦汗的有没有？在讨论如何从western blot中获得定量数据之前，先定义一下我们所说的“定量”是什么意思是非常有用的，何为定量，必须符合下列准则:使用一个定义的过程进行检测，即western blot这个过程产生一个可重复的结果，即是精确度测量反映了一个“真实”的结果，即是准确度定量Western blot除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，是一定要检测内参的，也就是内部参照（Internal Control），目的是校正蛋白质转印和上样过程中导致的实验误差，保证实验结果的准确性。
对于哺乳动物细胞表达来说，内参通常指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用其作为参照物。
在发表文章时，western blotting实验结果需内参进行校正，但仍有一些科研人员在实验中忽略内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范是比较各种样品间上样量等同的唯一方法。
然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，例如BCA方法对还原性试剂兼容性差，Bradford方法对去垢剂兼容性差，A280方法影响因素比较多，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。
在Western blotting实验时使用内参，即可简便地对转印和上样步骤产生的误差进行校正。
谁能看出这是“GAPDH”那么如何实现Western Blot实验中内参的检测呢？简单讲就是在WB过程中，除加入靶标蛋白的抗体外，也加入内参蛋白的抗体，同时实现靶标蛋白和内参蛋白的检测。
通过归一化，可以校正上样误差和转印误差，从而获得比较准确的western blot结果。
使用荧光方法进行定量western blot检测，可进行多重检测，荧光信号稳定，持久，影响因素少，不用剥离膜和剪膜，实验条件一致，更容易获得定量Western blot 的数据。
在western blot 实验中，内参的使用是个很重要的部分，看到很多站友对内参的选择经常有些疑问，鉴于此，希望能在一个帖子里面综合所有相关问题，展开讨论，共同学习。
我先提几个，抛砖引玉，希望大家继续。
1。
为什么一定需要内参？内参的重要性。
2。
常用的几种内参。
3。
不同的情况如何选择不同的内参。
支持一下！1：用内参照是为了评价你的各个上样孔内蛋白的总量是否基本一致，通常使用一些看家蛋白，比如β-actin、GAPDH等等。
这些蛋白在所有细胞中的表达量基本一致，所以用他们来作为你加样量的对照。
这样western结果中你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。
这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或是人为造成目的条带浓度的变化。
严格意义上说，内参事必须做的。
2：常用的内参有：b-actin，GAPDH，近2-3 年，更详细的研究发现，β-Tubulin (球管蛋白)，被广泛应用于Western Blotting，β－Tubolin分子量为55KD左右。
3：一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。
因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参！个人一些见解，供参考！内参的重要性，必要性：要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。
因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。
虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。
所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。
Bioss讲堂｜Westernblot内参抗体选择攻略大全Western Blot除了能证明某样品中含有某种蛋白之外，其最为重要的作用是比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少——即为蛋白表达水平最直接的证据。
要衡量蛋白的表达水平，前提条件就是等量的上样量。
内参的意义就是保证上样量的一致。
内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。
选择内参抗体应遵循的原则1、样本来源♠哺乳动物的组织或细胞：β-Actin、β-Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 等；♠植物样本：plant actin、Rubisco 等；♠其他来源样本，应参照已发表文献,选择合适蛋白作为内参。
2、目的蛋白定位▶全细胞蛋白和细胞质：β-Actin、beta Tubulin、GAPDH 等；▶细胞核蛋白：PCNA、LaminA、LaminB、HistoneH3，K70、K80、Erk2、TATAbindingprotein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等；▶胞膜蛋白：Na( )/K( ) ATPase 等；▶线粒体蛋白：VDAC1、COXIV等；▶血清：Transferrin等。
3、目的蛋白分子量目的蛋白分子量最好能与内参蛋白分子量相差5kd 以上，各内参蛋白分子量详见下方汇总表。
Tips: 内参的选择还需要考虑实际的试验环境：★在做多组织多细胞样本对比表达量时，最好选用 GAPDH作为内参，因为GAPDH是代谢类蛋白，在活组织中表达比较恒定。
而β-Actin和β-Tubulin是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性；★而在某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH 的表达增高，不适合做内参；★涉及细胞增殖的相关试验中，c-Jun由于自身表达变化不适合做内参；★凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参；★做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时，应选择结构蛋白作为内参，如β-Actin 和β-Tubulin。
在western blot 实验中，内参的使用是个很重要的部分，看到很多站友对内参的选择经常有些疑问，鉴于此，希望能在一个帖子里面综合所有相关问题，展开讨论，共同学习。
我先提几个，抛砖引玉，希望大家继续。
1。
为什么一定需要内参？内参的重要性。
2。
常用的几种内参。
3。
不同的情况如何选择不同的内参。
支持一下！1：用内参照是为了评价你的各个上样孔内蛋白的总量是否基本一致，通常使用一些看家蛋白，比如β-actin、GAPDH等等。
这些蛋白在所有细胞中的表达量基本一致，所以用他们来作为你加样量的对照。
这样western结果中你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。
这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或是人为造成目的条带浓度的变化。
严格意义上说，内参事必须做的。
2：常用的内参有：b-actin，GAPDH，近2-3 年，更详细的研究发现，β-Tubulin (球管蛋白)，被广泛应用于Western Blotting，β－Tubolin分子量为55KD左右。
3：一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。
因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参！个人一些见解，供参考！内参的重要性，必要性：要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。
因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。
虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。
所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。
Western Blot中的三大问题想要得到一张条带清晰、没有杂带、背景干净的图片，还是具有一定挑战性的。
常遇到没有条带、背景过高等问题，没关系，请看本文的问题解答。
Question:我的结果是膜上一片空白，为什么呢?A:导致这种结果的因素很多。
胶和膜放反了：如果在转印的过程中，胶和膜的位置颠倒了，那么蛋白就从胶上转移到缓冲液中，而不会到达膜上。
对于标准的转印，凝胶应靠近三明治的负极，而膜对应正极。
转膜效率低：转膜效率受多种因素影响，包括蛋白的大小、凝胶中丙烯酰胺的百分比、电场强度、转印时间和缓冲液的PH值。
一般来说，蛋白越大，转移的越慢。
转移大蛋白最好的方法是用高的电场强度。
而小蛋白长时间处于高电场强度下可能会传出转印膜。
避免这个问题的方法是用0.2μm孔径的PVDF膜进行转印。
如果蛋白的等电点接近缓冲液的pH 值，那么这个蛋白携带的电荷很少，在电场中页几乎不移动。
如果你的目的蛋白是强碱性的，那么你可以用碳酸盐(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性缓冲液。
在转印之后，你可以通过染胶或第二块膜来判断转印效率。
为了帮助你直接监控转印效率，Bio-Rad也提供了多种预染Marker，它们在电泳以及转膜之后可直接观察到。
试剂放置太久或存放条件不正确：抗体会慢慢降解，如果反复冻融的话，它会快速降解。
底物应储存在-20℃。
抗体不纯或滴度太低：一抗的浓度差异很大，应该根据经验来决定一抗的稀释度。
过犹不及，太多的抗体页会阻碍抗原与抗体的结合。
一般的原则是以1：100-1:1000来稀释血清或组织培养上清，以1：1000-1：10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。
Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1：3000。
酶失活了：叠氮钠是辣根过氧化物酶的抑制剂。
不要再HRP显色的Western blot中使用任何含叠氮钠的试剂。
叠氮钠可以用于碱性磷酸酶结合的抗体中，而无副作用。
另外，只能使用蒸馏的去离子水。
使用Tween-20洗涤：Tween-20(吐温-20)可能会干扰某些抗体-抗体相互作用，或洗去PVDF膜上的目的蛋白。
生命活动离不开蛋白质，作为生命活动的承担者，蛋白质一直都是主要的研究对象。
蛋白免疫印迹（Western Blot）是对目的蛋白进行检测、分析以及定量的一种技术。
也是检测蛋白表达的最常用的方法。
对于WB实验中，如果想结果不被质疑，内参对照是必不可少的。
内参是指由细胞中管家基因编码的蛋白，其在各组织细胞中的表达相对稳定，因此在测定目的蛋白的相对水平时常用它做对照物。
内参的种类很多，其中最常用的三大金刚是β-actin（肌动蛋白）、β-tubulin （微管蛋白）、GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）。
内参的作用：
校正作用，在蛋白定量及上样过程中不可避免的存在误差，在内参参与条件下以保证实验数据的准确性。
作为空白对照，检测蛋白转膜是否完整及发光显色等过程是否正常。
内参的选择因素:
1) 样本种属: 2) 目的蛋白的表达定位: 3) 目的蛋白的分子量: 4) 组织特异性: 5) 特殊的实验条件: 生命活动离不开蛋白质,作为生命活动的承担者。
Western Blot为什么必须要用内参？一、背景：GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。
GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。
GAPDH检测。
Western Blotting(检测条带大约在36kDa，稀释比例达10，000倍)、ELISA、亲和纯化、免疫荧光及免疫组化。
注：因为GAPDH 作为管家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的。
在实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确；或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差；这些误差需要通过测定每个样品中实际转到膜上的GAPDH的含量来进行校正，所以一般的western 实验都需要进行内参设置。
具体校正的方法就是将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量。
然后才进行样品与样品之间的比较。
反应：抗GAPDH单抗（clone 6C5）能够与鱼、蛙、鸡、兔、小鼠、大鼠及人组织来源的GAPDH反应，但不能与酵母GAPDH反应。
应用：GAPDH检测。
Western Blotting(检测条带大约在36kDa，稀释比例达10，000倍)、ELISA、亲和纯化、免疫荧光及免疫组化。
图示:抗GAPDH单抗（Cat＃KC-5G4）检测心脏组织匀浆中的GAPDH水平。
A-G分别表示不同实验来源的心脏组织匀浆。
抗GAPDH单抗稀释比例为1：10，000，HRP羊抗鼠二抗（Cat＃KC-MM-1302）稀释比例为1：1000。
采用SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Kit试剂盒及X胶片曝光显影。
摘要：要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。
因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。
蛋白印迹（Western Blot）实验中的内参
蛋白质印迹（WB）用于测量不同条件下特定蛋白的变化。
在蛋白质印迹（WB）过程中涉及许多步骤，包括样品制备、电泳、蛋白转移、抗体孵育和信号检测。
为了解释蛋白质印迹实验的结果，一个贯穿全过程的内参是必须的。
内参可保证每个泳道中加入了相同量的蛋白样品,不同泳道上的蛋白以相同的效率从凝胶转到膜上,不同泳道上抗体孵育（对于一抗而言，必要的话也包括二抗）、信号检测都是一致的。
内参的信号通常用来对目标蛋白的信号进行标准化。
需要强调的是，对照蛋白抗体应该与实验抗体在相同的印迹上进行。
不同的样品制备需要不同的内参。
下面总结了针对不同样品制备常用的内参，包括全细胞/胞浆蛋白、线粒体、核蛋白、植物组织和血清样本。
针对不同样品制备常用的内参以及它们的分子量
蛋白质印迹（Western Blot）实验中产品推荐：。
Western Blot中的三大问题想要得到一张条带清晰、没有杂带、背景干净的图片，还是具有一定挑战性的。
常遇到没有条带、背景过高等问题，没关系，请看本文的问题解答。
Question:我的结果是膜上一片空白，为什么呢?A:导致这种结果的因素很多。
胶和膜放反了：如果在转印的过程中，胶和膜的位置颠倒了，那么蛋白就从胶上转移到缓冲液中，而不会到达膜上。
对于标准的转印，凝胶应靠近三明治的负极，而膜对应正极。
转膜效率低：转膜效率受多种因素影响，包括蛋白的大小、凝胶中丙烯酰胺的百分比、电场强度、转印时间和缓冲液的PH值。
一般来说，蛋白越大，转移的越慢。
转移大蛋白最好的方法是用高的电场强度。
而小蛋白长时间处于高电场强度下可能会传出转印膜。
避免这个问题的方法是用0.2μm孔径的PVDF膜进行转印。
如果蛋白的等电点接近缓冲液的pH 值，那么这个蛋白携带的电荷很少，在电场中页几乎不移动。
如果你的目的蛋白是强碱性的，那么你可以用碳酸盐(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性缓冲液。
在转印之后，你可以通过染胶或第二块膜来判断转印效率。
为了帮助你直接监控转印效率，Bio-Rad也提供了多种预染Marker，它们在电泳以及转膜之后可直接观察到。
试剂放置太久或存放条件不正确：抗体会慢慢降解，如果反复冻融的话，它会快速降解。
底物应储存在-20℃。
抗体不纯或滴度太低：一抗的浓度差异很大，应该根据经验来决定一抗的稀释度。
过犹不及，太多的抗体页会阻碍抗原与抗体的结合。
一般的原则是以1：100-1:1000来稀释血清或组织培养上清，以1：1000-1：10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。
Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1：3000。
酶失活了：叠氮钠是辣根过氧化物酶的抑制剂。
不要再HRP显色的Western blot中使用任何含叠氮钠的试剂。
叠氮钠可以用于碱性磷酸酶结合的抗体中，而无副作用。
另外，只能使用蒸馏的去离子水。
使用Tween-20洗涤：Tween-20(吐温-20)可能会干扰某些抗体-抗体相互作用，或洗去PVDF膜上的目的蛋白。
Western Blot内参的选择,老司机都不知道这些窍门每日生物评论2017-01-31 21:15:13内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白（Housekeeping Proteins），它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。
一、为什么要使用内参呢？Western blot除了能证明某样品含有某种蛋白之外，其最为重要的作用是比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少。
即为蛋白表达水平最直接的证据。
要衡量蛋白的表达水平，前提条件就是等量的上样量。
然而如果仅将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法，显然是不可取的。
首先各种蛋白质浓度定量方法都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的蛋白浓度。
如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质如DNA的干扰，且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。
比色法测定蛋白浓度一般有BCA、Bradford、Lowry等几种方法。
BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。
Bradford法敏感度最高，且与一些列干扰Lowry、BCA 反应的还原剂（如DTT、巯基乙醇）相溶，但是对去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。
另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。
在Western Blot实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。
在Western Blot中使用内参其实就是在WB过程中另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。
GAPDH分子量内参WB1. 任务背景Western blotting (WB)是一种常用的蛋白质检测方法，它可以用于定性和定量分析特定蛋白质在样本中的表达水平。
在WB实验中，内参蛋白是一个重要的参考标准，用于校正样本间的差异。
GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)是一种常用的内参蛋白，其分子量是一个重要的参数。
2. GAPDH简介GAPDH是一种催化糖酵解过程中糖醛酸-3-磷酸脱氢酶的酶。
它参与糖酵解途径中糖醇磷酸化和糖醛酸脱氢的反应。
GAPDH广泛存在于细胞质和线粒体中，是一种高度保守的蛋白质。
GAPDH在细胞代谢中起着重要的作用。
它不仅参与糖酵解途径，还参与脂肪酸合成、核酸合成、蛋白质合成等多种生物学过程。
由于其丰度相对稳定，GAPDH被广泛用作WB实验的内参蛋白。
3. 分子量测定分子量是蛋白质的一个重要特征，可以通过多种方法进行测定。
在WB实验中，分子量通常通过与已知分子量的蛋白质进行比较来确定。
对于GAPDH，其分子量大约在36-40 kDa之间。
常用的测定分子量的方法有SDS-PAGE和蛋白质标记。
SDS-PAGE是一种常用的蛋白质分离方法，通过电泳将蛋白质按照分子量大小进行分离。
在SDS-PAGE中，GAPDH 可以通过与已知分子量的蛋白质标记进行比较来确定其分子量。
4. GAPDH作为内参蛋白在WB实验中，内参蛋白用于校正样本间的差异，以确保可靠的定量结果。
选择合适的内参蛋白是非常重要的，因为它应该在不同样本中稳定表达。
GAPDH是一个常用的内参蛋白，因为它在大多数细胞和组织中都以相对稳定的水平表达。
选择GAPDH作为内参蛋白有以下几个原因：1.GAPDH广泛存在于不同类型的细胞和组织中，其表达水平相对稳定。
2.GAPDH的分子量较大，不易受到蛋白质修饰的影响。
3.GAPDH在多种生物学过程中参与，其表达水平不易受到外界因素的影响。
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
Western Blot操作步骤一、Western blot 实验步骤概述二、Western blot具体实验步骤三、Western blot 实验注意事项四、Western blot关于内参抗体一、Western blot 实验步骤概述1. 组织取材：组织块称重2. 利用液氮、研钵粉碎组织块3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA)，PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃4. 加入PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，冰上孵育30分钟5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液9. 沸水浴中3分钟10. 上样11. 电泳(浓缩胶20mA，分离胶35mA)12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟)13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色14. Westernblot 试剂盒显色15. 分析比较记录二、Western具体实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western可以参考如下步骤进行操作。
1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。
因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定*分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。
虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳*啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活*的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定*的。
所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。
特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。
良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小），空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照），已知量标准产物的正对照；另外还有内参。
可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。
内参是最容易被忽略的一项。
我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。
特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。
所以你需要内参。
内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。
在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确*。
在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。
但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。
然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限*，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。
如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。
比色法测定蛋白浓度一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。
BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。
Bradford 法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。
但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比*。
另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。
在Western blotting 实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。
在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。
此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。
实验结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量。
将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。
如果样品量充分，可以先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验，至内参量一致为止；若内参一致，即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。
这样虽然麻烦一点，但是可以保证结果更有说服力，更可信。
毕竟我们的实验是一种严谨的工作。
常用的蛋白质内参有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-a ctin或beta-tubulin。
最近的国外文献报道中使用GAPDH内参的较多。
上海康成生物工程有限公司与国外实验室合作开发的GAPDH，100μl一支，浓度为100μg/100μl，稀释比达1：10000以上，至少可做100次Western mini-blots，价格仅为988元人民币，并且只需4℃保存运输，有效期长达两年。
这一产品大大降低了内参的费用，*能稳定、质量可靠、易于保存。
在Western Blotting实验过程中，由于使用的二级抗体往往会与总蛋白中本身含有的某些免疫球蛋白产生反应产生较强信号的杂带。
因此，上海康成生物工程有限公司推出了HRP标记的GAPDH，在任何情况下使用它都能够得到单一的条带结果，使得内参的使用方法更为简便准确。
这种操作省时，无需二级抗体反应的HRP标记的GAPDH内参不仅具备康成生物普通GAPDH的所有优点而且结果条带单一，可避免二级抗体的非特异*反应。
售价为1498元人民币100μl，稀释比达1：10000以上，至少可做100次Western mini-blots。
（Tips：现在读者在康成生物购买前面那个便宜的内参时提及生物通就可以额外获赠这个标记内参的10次使用装）图示: A-G分别表示不同实验小鼠心脏蛋白（上样量50ug），兔抗小鼠Akt抗体（康成生物Cat＃KC-5A01）检测心脏组织匀浆中Akt水平。
加入兔二抗（康成生物Cat＃KC-RB-035，稀释比例为1：5，000）时同时加入HRP标记的抗GAPDH单抗（稀释比例为1：10，000，康成生物Cat＃KC-5G5）。
采用化学发光试剂盒（康成生物Cat＃KC-420）及X胶片曝光显影。
一次反应即可同时检测目的蛋白（Akt）与内参GAPDH的含量。
目前，市场上供应的其他内参则均需要-20℃保存，干冰运输：Sigma公司的Anti-β-Actin，价格为241美元200μl，可做100次左右的Western mini-blots。
Labvision的β-Actin 399美元1ml，可做50到100次Western mini-blots; 209美元0.5ml，可做25到50次Western mini-blots。
Cell Sign aling Technology的BETA-ACTIN ANTIBODY 只可做10次 Western mini-blots，美金价为150美元，人民币售价为1875元。
附：在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有：一、超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。
二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。
然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。
三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。
然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。
Western Blot中文一般称为免疫着色。
它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。
通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。
免疫著色的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克（George Stark）。
在尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。
原理Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
分类Western Blot显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
