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真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
细菌的重组蛋白质表达系统蛋白质是构成生物体及细胞的重要组成部分，也是细胞功能的核心执行者。
为了研究和应用不同类型的蛋白质，科学家发展出了各种蛋白质表达系统。
其中，细菌的重组蛋白质表达系统是最常用的一种方法之一。
本文将详细介绍细菌重组蛋白质表达系统的原理、优势和应用。
一、原理细菌重组蛋白质表达系统利用细菌作为宿主来表达外源蛋白质。
这个系统主要包括以下几个重要组成部分：表达载体、宿主菌株、诱导系统和纯化方法。
1. 表达载体表达载体是指带有外源蛋白质编码序列的质粒。
这些质粒通常包括启动子、反义密码子和终止子等参与蛋白质表达的元件。
其中，启动子通过结合转录因子来启动蛋白质合成的过程。
反义密码子则能够增强蛋白质的长效稳定性，并促进其在细菌中的高效表达。
2. 宿主菌株宿主菌株在蛋白质表达系统中起到重要的作用，通常选择大肠杆菌作为宿主，主要因为大肠杆菌具有较高的生长速度、易于培养和常用的遗传工具。
此外，大肠杆菌本身产生的内切酶活性较低，有利于保护外源蛋白质的稳定性。
3. 诱导系统诱导系统是细菌重组蛋白质表达系统中的一个重要组成部分。
通常使用化学诱导或者温度诱导来启动表达载体中蛋白质编码序列的转录和翻译。
化学诱导通常通过添加一种诱导剂，如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），来激活载体中的启动子。
温度诱导则是通过改变培养温度来调节蛋白质表达。
4. 纯化方法纯化是细菌重组蛋白质表达系统中最关键的环节之一。
常用的纯化方法包括亲和纯化、碳水化合物基负载层析和凝胶过滤等。
这些方法能够根据蛋白质的特性和亲和性实现高效纯化。
二、优势与其他蛋白质表达系统相比，细菌重组蛋白质表达系统具有以下优势：1. 高效性细菌重组蛋白质表达系统是目前各种表达系统中最高效的一种方法之一。
通过优化表达条件和使用高效的诱导系统，可以实现高产量的蛋白质表达。
此外，细菌本身的生长速度也有助于高效表达。
2. 便捷性相比其他表达系统，细菌重组蛋白质表达系统的操作更为简便。
基因治疗中的表达载体构建与优化方法基因治疗是一种新兴的治疗方法，通过将修饰过的基因导入患者体内，以实现对疾病基因的修复或替代。
在基因治疗中，表达载体的构建和优化是关键的一步，它决定了基因在患者体内的表达效率和稳定性。
本文将介绍基因治疗中常用的表达载体构建与优化方法。
表达载体是将目标基因导入细胞内进行表达的工具。
常见的表达载体主要包括质粒和病毒载体。
质粒是一种双链DNA分子，它可以自主复制和表达携带的基因。
病毒载体是一种利用病毒基因表达机制的表达工具，常见的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒和腱病毒等。
表达载体的选择应根据具体的治疗目标、基因大小和细胞类型等因素进行考虑。
表达载体的构建是基因治疗中的关键一步。
首先，需要将目标基因克隆到合适的表达载体中。
这可以通过PCR扩增目标基因，然后利用限制性内切酶进行酶切，并将目标基因与表达载体连接。
常用的连接方法有限制性内切酶切和连接、PCR聚合、Ligase连接等。
连接完成后，需要进行质粒或病毒载体的复制，以获得足够多的表达载体。
表达载体的优化是为了提高基因在患者体内的表达效率和稳定性。
优化的方法有很多种，下面将介绍几种常见的方法。
首先，可以通过调整启动子和增强子的选择来提高基因表达效率。
启动子是调控基因转录的序列，它的选择可以影响基因的表达水平。
常用的启动子有CMV启动子、EF1α启动子和PGK启动子等。
增强子可以增加基因的表达水平，常用的增强子有CMV增强子、SV40增强子和EF1α增强子等。
通过合理选择启动子和增强子的组合，可以提高基因在细胞内的表达水平。
其次，可以通过改变表达载体的拓扑结构来提高基因表达效率。
常用的方法有线性化质粒和环形质粒之间的选择。
线性化质粒在导入细胞内后，可更容易与细胞内的转录因子结合，从而促进基因的表达。
环形质粒则具有更好的稳定性，在不进一步构建的情况下，可以长期保持在细胞内。
此外，还可以通过引入信号序列来优化基因的靶向表达。
信号序列是一段具有特定功能的氨基酸序列，能够促使基因产物在细胞中的定位和分泌。
真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein V ector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
五类信息载体的常用格式信息载体是指传递和表达信息的工具、媒介或形式。
随着科技的发展和信息技术的应用，现代社会存在着多种不同的信息载体，其常用格式包括文字、图片、声音、视频和数字。
下面将详细介绍这五类信息载体的常用格式。
一、文字文字是最传统、最常见的信息载体。
它可以使用各种编码方式进行表达和传递，如华文宋体、楷体、微软雅黑等等。
文字可以用于书写书籍、报纸、杂志、文件、传真、电子邮件等多种形式。
文字信息具有一定的稳定性和精确性，可以表达丰富的内容和思想，是人们日常学习、工作和交流的主要工具。
二、图片图片是用光学设备捕捉到的静态图像。
它可以通过照相机、手机、摄像头等设备捕捉，以JPEG、PNG、GIF等格式保存。
图片的信息载体具有直观、直觉的特点，能够更好地表达视觉效果，增加信息传递的效果。
图片广泛应用于广告、画册、宣传册、漫画、插图等领域。
三、声音声音是通过声波的振动传递的信息。
在数字化时代，声音可以通过录音设备、麦克风等设备进行录制，并以MP3、WAV等格式传递和存储。
声音信息可以传递语言、音乐、声效等内容，能够更好地表达情感和音乐的美感。
声音常用于广播、音乐会、语音留言、电话等领域。
四、视频视频是用光学设备捕捉到的连续图像序列，并以视频文件的形式进行存储和传递。
视频格式包括AVI、MP4、WMV等。
视频信息能够捕捉和传递动态的画面和场景，能够更好地表达运动、人物表情、活动过程等内容。
视频广泛应用于电视、电影、网络视频、在线直播等领域。
五、数字数字是使用数字编码表示的信息。
它可以包含文字、图片、声音、视频等多种格式的信息。
数字信息通过计算机、移动设备等数字化技术进行创建、传输和存储。
数字信息的特点是可以进行高效的传输和复制，信息损失率低，易于存储和检索。
数字信息广泛应用于互联网、电子商务、数据库、软件等领域。
综上所述，文字、图片、声音、视频和数字是常见的五类信息载体，它们分别以文字、图像、声波、动态图像和数字形式表达和传递信息。
不同基因表达达载体的优缺点理化系生物技术班孟凡顺进入21世纪以来，基因工程的发展越来越快，也越来越完整，作为新世纪生物科学前沿，基因工程的快速发展也大大的刺激了人们对科学知识的向往，走进基因工程，我们发现在基因工程的四大步骤，目的基因的获取，基因表达载体的构建，将基因表达载体打入受体细胞以及目的基因的监测与鉴定，这其中最重要的是也是最繁琐的莫过于第二步基因表达载体的构建，而在基因表达载体的构建这一过程中，最重要的无疑就是目的基因导入受体细胞，将目的基因导入受体细胞的关键就是运载体的选择，在这里，我们要对运载体的种类进行介绍。
首先我们要知道什么东西可以作为运载体，作为运载体又有哪些特征？首先，作为运载体的物质它必须可以进行自我复制，这样才可以在它与外源基因融合后，独立在宿主细胞中复制繁殖，其次有至少一个在融合外源基因后仍未被破坏的遗传表型，这便于将载体导入受体细胞后的识别与筛选，通常表现在为抗性与显色表型反应等，再次，载体上至少有一个限制性核酸内切酶的单一识别位点，这样方便了外源基因的插入，最后，要有适当的拷贝数，理论上在一定范围内，拷贝数量越多，越利于载体的制备，所有的基因工程中的表达载体都必须具有以上四个条件。
在这里，我介绍三种载体。
1质粒载体质粒载体是基因工程中最常用的载体之一，它源于细菌，是一种源于染色体外却可以自由复制的小型环状DNA，大小在1~200Kb之间，质粒通常含有一些编码对细菌有利生存的基因也含有抗生素的抗性基因，经科学家多年的努力，人们终于对一些质粒的生物学特征有了一些了解，进行了比较详尽的研究，比如F质粒那F基因或性质粒，R质粒即抗性因子和col质粒即大肠杆菌因子。
其实，一个质粒就是一个复制子，复制子往往有宿主专一性，但奇怪的是，人们也发现了可以在两种不同宿主内复制的复制子，即可构建的穿梭载体，这种新型载体的发现，大大的推进了克隆技术的发展，因为这种载体可以运载基因，在两种不同的生物之间穿梭，这大大得简化了克隆的步骤。
（转载）一.九种表达载体Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C,pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA二.克隆载体pTZ19RDNApUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptIIKS( )L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926三.PET系列表达载体ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETDsbFusionSystems39band40b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystem33b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystems ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystemsplusCompetentCells ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETGSTFusionSystems41and42 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETNusAFusionSystems43.1and44 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETVectorDNAProteinPurification?PurificationSystems?Strep?TactinResinsandPurificationKits四.PGEX系列表达载体TEcoR?pGEX-1I/BAPpGEX-2TpGEX-2TKpGEX-3XpGEX-4T-1pGEX-4T-2pGEX-4T-3pGEX-5X-1pGEX-5X-2pGEX-5X-3pGEX-6P-1pGEX-6P-2pGEX-6P-3五.PTYBsystemPTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六.真核表达载体pCDNA3.1(-)pCDNA3.1( )pPICZalphaApGAPZαAPYES2.0pBI121pEGFP-N1pEGFP-C1pPIC9KpPIC3.5K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
基因工程常用的三种载体基因工程是一门综合性的学科，其中一个关键方面是使用载体进行基因转移和操控。
载体是一种可以携带和传递特定基因的DNA分子。
在基因工程中，常用的载体有质粒、噬菌体和人工染色体。
下面将详细介绍这三种载体的相关信息。
1. 质粒（Plasmid）质粒是一种环状双链DNA分子，通常存在于细菌细胞内，也可通过人工方法导入其他生物体内。
质粒是最常用的基因工程载体，因其结构相对简单且易于操作，可以携带外源基因并通过转染等方法传递到细胞中。
质粒的大小通常在1-20千碱基对之间，具有自主复制和不受宿主基因组限制的能力。
质粒常用于基因克隆、表达以及基因敲除等研究。
例如，在基因克隆中，通过将目标基因插入质粒中的多克隆位点，可以将质粒转化到宿主细胞中进行扩增和分析。
质粒也常用于表达外源基因，可以将目标基因与促进其表达的启动子及调控元件结合在一起，构建表达载体进入目标细胞中，使其产生目标蛋白。
2. 噬菌体（Bacteriophage）噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，是基因工程中另一常用的载体。
噬菌体具有高度选择性对细菌进行感染和复制的能力，因此可以利用噬菌体来转移和表达外源基因。
噬菌体载体通常比质粒大，可以携带更长的DNA序列。
噬菌体常用于噬菌体展示技术和抗体库构建。
噬菌体展示技术是一种用于筛选蛋白质相互作用、抗体或潜在药物靶点的方法。
通过将目标多肽或蛋白质与噬菌体表面蛋白基因融合，在噬菌体所感染的细菌中进行筛选。
另外，噬菌体也常用于构建噬菌体抗体库，通过大规模的筛选，筛选出具有特定抗体活性的噬菌体克隆。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）人工染色体是通过基因工程方法人为合成的染色体模拟体，在某些情况下可用于携带超长的DNA分子。
人工染色体被设计成可以稳定传递和复制的DNA分子，通常包括一个原核或真核的起始序列、一个中央控制区域和一个终止序列。
人工染色体在基因组学和基因治疗研究中发挥着重要作用。
质粒载体种类质粒载体是在基因工程和分子生物学研究中广泛应用的一种工具，它可以用来携带和传递外源基因。
根据其特性和功能的不同，质粒载体可以分为多种类型，下面将介绍几种常见的质粒载体。
1. 表达质粒载体表达质粒载体是用于表达外源基因的载体。
它通常包含一个启动子、一个编码区和一个终止子。
启动子可以使外源基因在宿主细胞内得到转录和翻译，编码区则包含了外源基因的编码序列，终止子用于终止翻译过程。
常用的表达质粒载体包括pUC19、pET28a等。
这些载体具有高拷贝数和广谱宿主范围的特点，适用于大多数细菌和酵母的表达。
2. 克隆质粒载体克隆质粒载体用于将外源DNA片段克隆到质粒中。
它通常包含一个多克隆位点，用于插入外源DNA片段，以及一些选择标记，如抗生素抗性基因。
常见的克隆质粒载体有pGEM-T、pBluescript 等。
这些载体具有较高的拷贝数和较大的插入容量，适用于DNA 片段的克隆和扩增。
3. RNAi质粒载体RNAi质粒载体用于介导RNA干扰（RNA interference）。
它通常包含一个RNAi导体，其中包含外源基因的靶向序列，以及一个RNAi表达序列。
外源基因的靶向序列可以与目标基因的mRNA相互配对，从而介导其降解或抑制其翻译。
常见的RNAi质粒载体有pSUPER、pLKO等。
这些载体具有较高的RNAi效率和较强的基因沉默能力，适用于基因功能研究和基因治疗。
4. 荧光蛋白质粒载体荧光蛋白质粒载体用于表达荧光蛋白基因，常用于研究基因的表达和定位。
它通常包含一个荧光蛋白基因，如绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（RFP），以及一个启动子和终止子。
外源基因的表达可以使细胞或生物发出荧光信号，从而实现基因的可视化。
常见的荧光蛋白质粒载体有pEGFP、pRSET等。
这些载体具有较高的表达效率和较强的荧光信号，适用于细胞标记和蛋白定位等研究。
5. 敲入质粒载体敲入质粒载体用于将外源DNA片段整合到宿主基因组中。
真核细胞常见表达载体真核细胞，表达载体1、pCMVp—NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因.更重要的是,由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418筛选,可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在.2、pEGFP，增强型绦色荧光蛋白表达载体（Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途：该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT—Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点：pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β—肌动蛋白基因，在PCMV 启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
pET 载体中，目标基因克隆到 T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供 T7 RNA 聚合酶来诱导表达。
Novagen 的 pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括 36 种载体类型、 15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。
优点· 是原核蛋白表达引用最多的系统· 在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低· 真正的调节表达水平的“变阻器”控制· 提供各种不同融合标签和表达系统配置· 可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌· 许多载体以 LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆 PCR 产物· 许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化阳性 pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆 PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。
pET 系统概述pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。
根据最初由 Studier 等开发的 T7 启动子驱动系统， Novagen 的 pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。
控制基础表达水平pET 系统提供 6 种载体 - 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。
没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。
宿主菌株质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有 T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λ DE3 溶原菌）中表达目标蛋白。
在λ DE3 溶原菌中， T7 RNA 聚合酶基因由 lacUV5 启动子控制。
未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。
而宿主菌带有 pLysS 和 pLyE 时调控会更严紧。
pLys 质粒编码 T7 溶菌酶，它是 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。
表达载体导入微生物的方法
表达载体是将外源基因导入到微生物中进行表达的工具。
常见的表
达载体有质粒、噬菌体和人工染色体等。
下面介绍几种常用的表达载
体导入微生物的方法。
1. 转化法转化法是最为简单直接的一种方法，
适用于大多数革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。
该方法利用电击或热激
等手段使DNA进入细胞内部，然后通过自身复制来实现目标基因在宿
主细胞内部的表达。
2. 病毒感染法病毒感染法通常采用噬菌体作为载体，通过寄生于宿主细胞并注入其遗传信息来实现目标基因在宿主中
的表达。
这种方法可以快速高效地将外源基因导入到宿主中，并且能
够实现定向插入和高水平表达。
3. 电穿孔法电穿孔法是一种新型而有
效率较高的DNA转移技术，可应用于各类真核及原核细胞之间以及不
同组织器官之间进行DNA转移操作。
该技术利用脉冲电场对目标组织
进行刺激，在此过程中形成暂时性小孔从而使得外源 DNA 进行了有效
地输送与传递。
4. 化学处理法化学处理法也称为钙离子共沉淀（CaCl2）或者PEG共沉淀（聚乙二醇），即先将质粒与盐溶液或聚合物相结合
形成颗粒，再加上特殊条件如温度、时间等促进颗粒与受体微生物发
生黏附反应，并最后让其自然恢复正常状态完成整个过程。
总之，在
选择哪种方式去导入我们所需要使用到微生物里面时候还需根据具体
情况去考虑选取何种方式才更加符合我们所要求得结果！。
表达载体一、原核细胞表达载体1. pBAD载体:特点; 该表达质粒含有araBAD(arabinose)操纵子的P BAD启动子和编码该启动子的正负调控子基因araC，具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋白质的原核细胞表达载体。
请注意:1. 当要扦入其他信号肽片段，改建此载体时，请不要利用该载体上的Nde1 EcoR1 BamH1 Kpn1和Pst1位点，以免造成重组困难，因为前述内切酶在此载体上均有二个位点，最好使用只有一个酶切位点的Sac1和Hind111位点。
同时记住，如在不含任何信号肽的P BAD表达质粒扦入信号肽，其非编码N-末端要包含核糖体结合位点(RBS)核苷酸序列。
2在使用含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒时，请应用Omp A分泌信号肽上的Sac1以及载体Hind111酶切位点，这些在载体序列上都是单个酶切位点。
本公司目前有含Omp A分泌信号肽和不含任何信号肽的二种P BAD表达质粒，其多克隆位点区域图谱如下:(a)、含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域SDP BAD….TACCCGTTTTTTTCC….GCTAGCAGGAGGAAACG ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGTA M ATTC GCT ACC GTA GCC ATG GCC GAG CTC GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNco1 Pst1 Hind111 (b)、不含分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域EcoR1 Kpn1 BamH1 Pst1P BAD….TACCCGTTTTTTTGG.GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNde1 Sac1 Smal 1 Hind111下图显示本公司应用pBAD表达载体完成的实验结果:pBAD载体驱动大分子蛋白质在原核细胞Origami(DE3)内高效表达2. pCAl-n & pCAl-pelB载体特点: 该原核细胞表达载体是来源于以T7 RNA聚合酶为基础的pET载体，含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序列。
pET 载体中，目标基因克隆到 T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供 T7 RNA 聚合酶来诱导表达。
Novagen 的 pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括 36 种载体类型、 15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。
优点· 是原核蛋白表达引用最多的系统· 在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低· 真正的调节表达水平的“变阻器”控制· 提供各种不同融合标签和表达系统配置· 可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌· 许多载体以 LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆 PCR 产物· 许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化阳性 pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆 PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。
pET 系统概述pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。
根据最初由 Studier 等开发的 T7 启动子驱动系统， Novagen 的 pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。
控制基础表达水平pET 系统提供 6 种载体 - 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。
没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。
宿主菌株质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有 T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λ DE3 溶原菌）中表达目标蛋白。
在λ DE3 溶原菌中， T7 RNA 聚合酶基因由 lacUV5 启动子控制。
未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。
而宿主菌带有 pLysS 和 pLyE 时调控会更严紧。
pLys 质粒编码 T7 溶菌酶，它是 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。
pLysS 宿主菌产生低量 T7 溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λ DE3 溶原菌。
有 11 种不同DE3 溶原化宿主菌。
使用最广泛的为 BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失 lon 和 ompT蛋白酶。
B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。
BLR 为 recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。
两个硫氧还蛋白还原酶 ( trxB ) 突变菌株 (AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。
Origami TM 和 OrigamiB 菌株为 trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。
Origami 和OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。
新的 Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的 tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。
其它菌株背景包括 K-12 菌株 HMS174 和 NovaBlue ，象 BLR 一样为 recA - 。
这些菌株可稳定表达其产物可能导致DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。
由于存在 F 附加体编码的高亲和力 lacIq 阻遏蛋白， NovaBlue 为一个有用的严紧型宿主菌。
此外， Novagen 提供了λ DE3 溶原化试剂盒，用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。
表达高毒性基因或制备新的λ DE3 溶原菌的另一替代方法是通过 l CE6 感染提供 T7 RNA 聚合酶。
虽然不如用 IPTG 诱导λ DE3 溶原菌方便，这种策略也被优先用于一些应用中。
高严紧性 T7 lac 启动子除了在宿主菌水平选择三种基本的表达严紧性， pET 系统中 T7 启动子本身提供了两种不同的严紧性选择：普通 T7 启动子和 T7 lac 启动子。
T7 lac 启动子在启动子区下游 17bp 处含有一个 25bp 的 lac 操纵序列。
该位点结合 lac 阻遏蛋白能够有效降低 T7 RNA 聚合酶的转录，这样提供了在λ DE3 溶原菌中抑制基础表达的第二种基于 lacI 的机制（除了抑制 lacUV5 ）。
含 T7 lac 启动子的 pET 质粒还具有它们自己的 lacI ，确保足够的阻遏蛋白结合到操纵基因位点上。
在实际应用中，为了获得最高产量的蛋白，通常应该测试多种不同的载体 / 宿主菌组合。
控制诱导的表达水平在许多情况下，表达活性可溶性最好的蛋白依赖于宿主细胞的背景、培养条件和合适的载体配置。
通常，目标蛋白活性最高的条件与产量最高的条件不一致。
除了根据载体 / 宿主菌组合控制 T7 RNA 聚合酶的基础表达提供不同严紧性， pET 系统还根据诱导物（ IPTG ）浓度，对目标蛋白表达提供了真正的“变阻器”控制。
Tuner 和 OrigamiB 宿主菌的 lacY 突变使这种控制成为可能。
选择 pET 载体所有的 pET 载体均来自 pBR322 ，但彼此间先导序列、表达信号、融合标签、相关限制性位点和其它特点有所不同。
有两大类 pET 质粒，即转录载体和翻译载体：转录载体（包括 pET-21 、 pET-23 和 pET-24 ）表达目标 RNA ，但不提供翻译信号。
它们用于从自身带有细菌翻译信号的目标基因表达蛋白。
（注意：转录载体通过命名后面的一个缺失字母后缀加以区分）翻译载体含有设计用于蛋白表达的有效翻译起始信号。
许多载体在读码框 a 、 b 和 c 中带有克隆位点，分别对应于 BamH I 位点的 GGA 、 GAT 和 ATC 三联体。
选择要点选择用于表达的 pET 载体通常涉及多种因素。
考虑以下三个主要因素：· 所表达蛋白的用途· 所表达蛋白的已知信息· 克隆策略pET 载体表达的蛋白用途各种各样。
例如，表达量为分析级的蛋白可用于活性研究、突变体筛选和定性、筛选配体相互作用和抗原制备。
大量活性蛋白用于结构研究、试剂或亲和基质制备。
许多载体适合表达用于筛选或抗原制备的分析量蛋白，然而只有载体、宿主菌和培养条件组合十分适宜才可能用于大量纯化。
如果需要活性蛋白连续高产，应该试验多种载体、宿主菌和培养条件组合以找到最优化结果。
任何关于目标蛋白的已知信息都有助于载体选择。
例如，一些蛋白的活性要求一个或两个末端没有外源序列。
许多 pET 载体能够克隆非融合序列，然而如果特定翻译起始序列不能在大肠杆菌中有效利用，表达水平可能受影响。
在这些情况下，常可用有效表达的氨基末端序列构建融合蛋白，然后在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列。
LIC （连接非依赖的克隆）策略对这种方法特别有用，因为克隆操作通过肠激酶和因子 Xa 能够去除所有氨基端载体编码序列。
由于限制性位点和读码框相容性的需要，克隆策略也会影响载体选择。
由于许多 pET 载体具有共同的限制性位点配置，通常可能将一次制备的目标基因克隆到几个载体中。
采 PCR 克隆策略时则有不同的考虑。
LIC 载体试剂盒推荐用于此目的，可通过 PCR 制备插入片段，而不需要限制性消化载体或插入片段。
溶解性和细胞定位考虑了目标蛋白的应用和克隆策略，还应该确定目标蛋白的细胞定位和溶解性，这一点十分重要。
在许多实际应用中常希望表达可溶的活性蛋白。
特定目标蛋白的溶解性取决于多种因素，包括各自的蛋白序列。
在许多情况下，溶解性不是有或无的现象，载体、宿主菌和培养条件可被用来增加或减少获得的可溶或不可溶形式的比例。
PET-32 载体系列使目标序列与通常能够增加可溶性蛋白比例的硫氧还蛋白 (Trx.Tag ) 融合。
新推出的 pET-43.1 系列具有通过大量系统筛选而得到的一种过量表达时具有极高溶解性的大肠杆菌蛋白 --Nus.Tag 融合伴侣，从而进一步提高了目标蛋白的可溶性。
此外， trxB 突变株 AD494 和 BL21 trxB ，或 trxB/gor OrigamiTM 和OrigamiB 菌株可用于在胞浆中形成许多真核蛋白正确折迭和活性所要求的二硫键。
低温诱导（ 15 -25 ° C ）也可增加可溶性目标蛋白的比例。
获得可溶性活性蛋白的另一策略是使蛋白外泌到胞外周质中，为折迭和二硫键形成有更适宜的环境。
为了达到这一目的，通常使用带信号肽的载体。
一些纯化策略可以优化胞质中不溶性包涵体的产量。
抽提包涵体并溶解，然后目标蛋白在体外重新折迭( 如使用 Novagen 的蛋白折迭试剂盒 ) 。
该过程通常产生高产量初始蛋白并防止宿主细胞中的蛋白降解。
然而，重新折迭成活性蛋白的效率随不同蛋白变化很大，可能相当低。
pET-31b （ + ）载体专为产生不可溶融合蛋白而设计，提供了生产小蛋白和多肽的有效方法。
满足不同需要的融合标签如果融合序列不影响应用，生产带有 S.Tag 、 T7.Tag a 、 His.Tag a 和 HSV.Tag a 的融合蛋白会很方便后续操作，并易于通过蛋白杂交检测。
这些多肽（融合序列很小），它们的检测试剂极特异和灵敏。
通过使用相应树脂和缓冲液试剂盒， GST.Tag 、 S.Tag 和 T7.Tag 序列可用于亲和纯化。
使用 S.Tag 和 GST.Tag 分析试剂盒可对粗提或纯化的融合蛋白准确定量。
采用一种新颖底物的FRETWorks S.Tag 分析试剂盒可通过荧光检测到少于 1fmol 的融合蛋白。
His.Tag a 序列作为纯化蛋白的融合伴侣非常有用，尤其对那些以包涵体形式表达的蛋白来说，它可以使亲和纯化可在溶解蛋白的完全变性条件下进行。
CBD.Tag a 在低费用亲和纯化中非常有用。
它们也特别适用于重新折迭（特别是带有 CBD clos .Tag a 序列的 pET-34b （ + ）和 35b （ + ））。
因为只有正确重新折迭的 CBDs 结合到纤维素基质上， CBIND 亲和纯化步骤能够从制备物中去除不正确折迭的分子。
任何标签可用于固定目标蛋白，但由于 CBD.Tag 序列的低非特异性结合以及与纤维素基质的生物相容性，使它更适合用于这一目的。
Nus.Tag 、 Trx.Tag 和 GST.Tag 序列用来增加其融合伴侣的溶解性。
Nus.Tag 和 Trx.Tag 载体与利于在胞浆中形成二硫键的 Origami 宿主菌相容。
各种融合标签和相应 pET 载体见列表。
一些 pET 载体带有数个***的融合标签，作为 5' 融合伴侣。
此外，许多载体通过目标基因序列符合读码框的通读而表达末端带有不同多肽标签的融合蛋白。
使用在 5' 标签和目标序列之间含有蛋白酶切割位点（凝血酶、因子 Xa 和肠激酶）的载体，可以在纯化后选择性去除一个或多个标签。
