黑曲霉液体发酵制备_葡萄糖苷酶的研究_刘敏

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一种黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因及其高效表达方法[发明专利]

申请人：江南大学地址：214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800号国籍：CN 代理机构：北京汇信合知识产权代理有限公司代理人：陈圣清更多信息请下载全文后查看
Байду номын сангаас
专利内容由知识产权出版社提供
专利名称：一种黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因及其高效表达方法专利类型：发明专利发明人：吴敬,刘旭,吴丹,陈坚申请号：CN201310095971.4 申请日：20130322 公开号：CN10314 6726A 公开日：20130612
摘要：本发明公开了一种黑曲霉α-葡萄糖苷酶aglu及其在毕赤酵母中的高效表达方法。所述优化的α-葡萄糖苷酶基因核苷酸序列如SEQ ID No1所示。所述基因构建到毕赤酵母表达载体并与二硫键异构酶基因转化入毕赤酵母中共表达，在3L罐上诱导110h后酶活达力可到10.1U/mL，是优化前的 2.9倍，可用于α-葡萄糖苷酶的工业化生产。

黑曲霉液体发酵制备β-葡萄糖苷酶的研究

ｔｅｙｈ３ｇｕｏｉａｅｗｓｓａｌｕｄｒ４ｉｌ．Ｔｅ／一ｌｃｓｄｓａｔｂｅｎｅ０℃ ａｄｉｈｎｉｏｍｅｔｐｖｕｆ．－．ｖｎｎｔｅｅｖｒｎｎＨａｅｏ０５０．ｌ３Ｋｅｒｓｓｅｇｌｕｉｅ；ｇｕｏｉａｅｗｈａｒｎｙｗｏｄ：Ａｐｒｉｉｓｎｇｒ口一ｌｃｓｄｓ；ｅｔａｌｂ
ｔｓｅａｂｎｓｕｃｓＴｅｏｔｌｃｌｒｏｄｔｎｏｇｕｏｉａｅｐｅａａｉｎｂ．ｎｇｒｉｕｍｅｇｄｆｒｎａｉｎＷｅｔｄｃｒｏｏｒｅ．ｈｐｉｕｔｅｃｎｉｏｆＢ—ｌｃｓｄｓｒｐｒｔｙＡｍａｕｉｏｉｅｎｓｂｒｅｅｍｅｔｔａｏｓ４ｄｕｉ５ｈｋａｋｈｏｕａｉｎｗａ０ｍＬｍｅｉｍｎ２０ｍＬｓａｅｆｓ，ｔｅｉｃｌｔｓ８％，ｔｅｉｉａＨａｕａ．ｌｎｏｈｎｔｌｉｐｖｅｗｓ５５，ｔｅｃｌｒｅｅａｕｅａｄｒｔ－ｌｈｕｔｅｔｍｐｒｔｒｎｏａｕｔｎｓｅｄｏｎｕａｏｈｋｒｗｅｅ３ｎ７ｍｉｉｐｅｆＩｃｂｔｒＳａｅｒ０ｏａｄ１０ｒｎ，ｒｓｅｔｅｙｎｈｉｈｓ－ｌｅｓｄｓｃｉｉｆ１１ＵｍＬｏＣ／ｅｐｃｉｌ，ａｄｔｅｈｇｅｔｇｕｏｉａｅａｔｔｏ９．２Ｉ／ｖｖｙ
ｗｓｂａｎｄｆ０ｄｙｃｌｖｔｎＴｅｐｉａｔｅａｒａｄｐａｕｆ一ｕｏｉａｅｒａｔｎｗｓ５℃ ａｄ４８ｒｓｃａｔｅｒ１ａｓｕｔａｉ．ｈｔｌｅｒｔｅｎＨｖｅｏ／ｇｃｓｓｃｏａｏｉｏｉｏｏｍｍｐｕｌ３ｌｄｅｉ６ｎ．．ｅｐ－ｅ

黑曲霉ZJ1摇瓶发酵产_葡萄糖苷酶的研究_刘小杰

黑曲霉ZJ1摇瓶发酵产β-葡萄糖苷酶的研究刘小杰(浙江大学食品科学与营养系,杭州310029)陶飞　童纪峰(杭州娃哈哈集团有限公司科委,杭州310018)摘要:本文研究了黑曲霉ZJ1发酵产β-葡萄糖苷酶的发酵条件及β-葡萄糖苷酶的酶学性质。

结果表明:黑曲霉摇瓶发酵产β-葡萄糖苷酶的培养基组成为(g/L):稻草50,麦麸15,大麦粉15,(NH4)2SO410,KH2PO4 0.5,MgSO4·7H2O0.5,起始pH5.0。

产酶条件为:培养温度28℃,转速为200r/min,当培养时间为144h,β-葡萄糖苷酶活性达到最大。

β-葡萄糖苷酶的最适作用温度为50℃,在40℃时热稳定性较好;β-葡萄糖苷酶的最适反应p H为5.5,在p H3.0～p H8.0之间较稳定;Zn2+、Al3+、Ca2+和Mn2+对β-葡萄糖苷酶酶促反应均有一定的促进作用。

关键词:黑曲霉,β-葡萄糖苷酶,稻草粉,发酵Study ofβ-Glucosidase Produced by As pe rgillus Niger ZJ1Liu Xiaojie(Department of Food Science and Nutrition,Zhejiang University,Hangzhou310029)Liu Xiaojie,Tao F ei,Tong Jifeng(R&D Department of Hangzhou Wahaha Group Company Limited,Hangzhou310018)A bstract:This paper studied the fermentation condition and properties ofβ_glucosidase b y As pergillius niger.Experimental re-sults demonstrated that cultivation medium composition was as follows(g/L):rice straw powder50,wheat bran15,barley flour 15,(NH4)2SO410,KH2PO40.5,MgSO4·7H2O0.5,initial pH5.0.The maximumβ_glucosidase activity reached at28℃with RPM of200r/min when cultured144hours.β_glucosidase's optimum temperature was50℃,and it was stable under40℃.Its optimu m p H was5.5and it was stable in p H3.0～pH8.0.Metal cation influence enzyme activity,Zn2+、Al3+、Ca2+and Mn2+have active effects on enzyme activity.Key words:As pergillius nig er,β_glucosidase,Straw powder,Fermentation 目前应用最广、研究最为深入的纤维素酶生产菌种,大多是里氏木霉(Trichoderma reesei)的优良突变株,虽然这些菌株能产生高活力的内切型及外切型葡聚糖酶,但不足之处在于β_葡萄糖苷酶产量很低。

黑曲霉产α- 葡萄糖转苷酶发酵条件的研究

代谢机理研究、食品成分分析和医学诊断 [7-8] 等方面。经被啤酒同行所关注。
但目前国内生产 α- 葡萄转糖苷酶酶制剂厂家较少，
鉴于此，本文以啤酒酵母自溶物替代微生物发酵
其发酵周期较长，所耗的培养基量较多，酶的产量和培养基中的酵母浸膏，研究其对黑曲霉发酵产酶的影
特性不易控制，因此对于 α- 葡萄糖转苷酶生产成本响，为啤酒废酵母的综合利用提供更为直接和廉价的
α- 葡萄糖转苷酶主要是由黑曲霉（Aspergillus niger） 1 ～ 1.5 t 的啤酒废酵母（以干重计），啤酒废酵母若
发酵生产，目前已广泛应用于基础开发研究领域，主直接排弃，必将产生环境污染，同时给企业5]、淀粉水解 [6]、酒精发酵、损失 [9-10]。因此，利用啤酒废酵母开发高附加值产品已
（1）培养基。①菌种斜面培养基：察氏培养基。 ②种子及发酵培养基：葡萄糖 40 ～ 50 g/L、酵母膏 18 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、硫酸镁0.5 g/L、尿素2 g/L，pH 5.5 ～ 6.0，根据不同的实验设计要求，改变培养基的各组分。
③酵母自溶物的制备：取啤酒废酵母按质量比 1 ∶ 1 加水稀释后，添加 3% NaCl，调 pH 至 6.5，50 ℃条件下自溶 48 h，取出后至沸水浴中灭酶 10 min，冰箱冷藏保存待用。
食品科技 Food Science and Technology
ｄｏｉ：１０．１６７３６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｎ４１－１４３４／ｔｓ．２０１８．０５．０１８
黑曲霉产 α- 葡萄糖转苷酶发酵条件的研究
Study on the Fermentation Conditions for Producing α-Transglucosidase from Aspergillus Niger

黑曲霉产β-葡萄糖苷酶液体培养基研究

表明在２０ｍ５Ｌ三角瓶装２ｍ５Ｌ培养、接种种龄为１的种子培养液２５ｍ、ｄ．Ｌ３２℃ 培养５ｄ的培养条件下，其液体发酵较适
产酶培养幕为（Ｖ）：Ｗ／纤维素粉４、％硝酸钾３、％聚乙二醇０１、．％初始ｐＨ为６５这将为ｐ一葡萄精计酶液体发酵的工．，Ｉ化生产和应用提供参考价值。［中图分类号］Ｑ３９６［文献标识码］Ａ［文章编号］０１－９６２０００４１０４２（０７）４— ０９—０４
Ｉｐｉｌｃｍｐｓｔｎｏｕｔｒｄｕｆｒｅｚｍｅｓｃｅｉｎｂｉｕｄ—ｓａｅｆｒｎａｉｎｗｓｃｌｌｓｏｄｒ４，ＫＮ％，ｔｏｔｓｍａｏｏｉｏｆｃｌｅｍｅｉｍｏｎｙｅｒｔｙｌｉｉｕｏｑｔｔｅｍｅｔｔａｅｌｏｅｐｗｅ％ｏｕＯ３３
于各种微生物中，如细菌、菌等；真此外，在动物中也发现该酶的存在。ｐ一葡萄糖苷酶水解由内切葡聚糖酶（ｎｏ—Ｂ一１４一ｇｃ．ｓｓＥ．．．）ｅｄ，１ａａｅ，Ｃ３２１４和纤维二糖水解酶（ｅｏｉｙｍｌｓｓＥ．．．１产生的纤维．ｃｌｂｏｄａｅ，Ｃ３２１９）ｌｈ二糖和低分子量的纤维寡糖，生成葡萄糖，纤维素的分解过程中起重要的作用Ｊ由于内切葡聚糖酶和在。纤维二糖水解酶受纤维二糖的抑制，Ｂ一葡萄糖苷酶活力低的纤维素酶有非常弱的糖化能力。此外，含ｐ一葡萄糖苷酶也能水解其它有重要生理作用的ｐ一葡萄糖苷。因此，ｐ一葡萄糖苷酶进行研究是十分必要对的。到目前为止，对该酶的研究多以木霉为主。但木霉具有产酶慢，酶系比活力不高，普遍存在Ｂ一葡萄糖苷酶活力很低的缺陷，致使纤维二糖积累，影响了酶解效率。有人采用在木霉纤维素酶中添加曲霉的Ｂ一Ｊ葡萄糖苷酶，极大地提高了纤维素酶的降解能力ｊ。在从真菌培养液中筛选Ｂ一葡萄糖苷酶，发现来源于黑曲霉培养液的Ｂ一葡萄糖苷酶具有非常高的活性和稳定性。基于其独特的性质，Ｊ一种简单期

用黑麴菌的液态酦酵生产葡萄糖酸ProductionofGluconicAcidby

培養基成分是：葡萄糖 50 g/L、 (NH4)2HPO4 1 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、 MgSO4•7H2O 0.15 g/L (pH 7)
發酵槽培養基： 3 公升培養基於 5 公升發酵槽中操作。
孢子的計算
圖1 圖2 圖3
製備孢子懸浮液，將 PDA 平板培養基做在 500 mL 三
32h
醱酵過程葡萄糖及葡萄糖酸濃度的變化（葡萄糖 150 g/L）
表1
五公升醱酵槽培養黑麴菌生產葡萄糖酸的結果
討論
兩種葡萄糖濃度的發酵結果沒有顯著差異。
表 1 的結果顯示有 6～7％的葡萄糖在醱酵過程轉變成細胞成分或
消耗成能量。
低濃度葡萄糖的生產速度（5.2 g / L・h）大於高濃度葡萄糖的生
接種 300 mL 的黑麴菌液態搖瓶培養液
設定發酵槽的攪拌速度為 600 rpm、溫度 30℃、通氣 1 取樣，加水稀釋 50~100 倍（因為形成葡萄糖酸鈣，溶
vvm、pH5.5 以下時自動饋入 20%的 Ca(OH)2 來調整。解度很低），離心，用濾孔 0.2 μm 的針筒過濾器過濾，用 HPLC 分析。
結果
葡萄糖酸和葡萄糖的 HPLC 分析
採用的 HPLC 分析是使用逆相層析管（Merck RP18e），移動相 Acetonitrile：water（30：70），流速： 0.5 mL / min。
3.27 min 2.70 min
圖4
葡萄糖、葡萄糖酸的 HPLC 層析圖
結果
菌絲形態
圖 6
產速度（4.8 g / L・h）。其原因可能有二：（一）低濃度葡萄糖的滲透壓較低，有利於黴菌的生長和代謝。
（二）低濃度葡萄糖的有利於氧氣的傳輸，葡萄糖轉變成葡萄糖酸需要大量的氧氣，而高濃度葡萄糖是比較不利於氧氣的傳輸。

黑曲霉液态发酵产柚苷酶的分离纯化及其性质研究

黑曲霉液态发酵产柚苷酶的分离纯化及其性质研究王维娜1，李佥1，田晶1，费旭2，徐龙权2，廉萌1(1.大连工业大学生物工程学院，辽宁大连 116034)(2.大连工业大学现代教育技术部，辽宁大连 116034)摘要：本文针对黑曲霉液态发酵所产柚苷酶的分离纯化工艺及其酶学性质进行研究。

将黑曲霉液态发酵所产酶液，依次通过30%~70%硫酸铵盐析、膜透析和DEAE-Sepharose FF 阴离子交换层析后得到高纯度柚苷酶。

经SDS-PAGE 凝胶电泳仅得到一条清晰条带，分子量约为65.10 ku 。

纯化获得的柚苷酶比酶活可达6932.54 U/mg ，纯化倍数和酶活回收率分别为13.82倍和13.30%，并且能有效水解柚皮苷。

进一步研究发现，该酶的最适反应pH 为4.5，最适作用温度为50 ℃，在20 ~50 ℃℃及pH 3.0~6.0范围内有良好的稳定性。

在一定浓度范围内，K +、Ca 2+和Na +对柚苷酶活性有促进作用，而Fe 3+、SDS 和EDTA-Na 2对其活性有明显的抑制作用。

本研究为深入理解柚苷酶分离纯化过程，明确其酶学性质，进一步探索柚苷酶应用于天然活性产物生物转化过程的相关机制提供了基础数据，具有非常重要的科学意义和潜在的应用价值。

关键词：黑曲霉；液态发酵；柚苷酶；纯化；酶学性质文章篇号：1673-9078(2016)07-72-78 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.7.012Isolation, Purification, and Properties of Naringinase Produced fromAspergillus niger FFCC 848 by Liquid FermentationW ANG Wei-na 1, LI Qian 1, TIAN Jing 1, FEI Xu 2, XU Long-quan 2, LIAN Meng 1(1.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China) (2.Modern Education Technical Department, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China)Abstract: The isolation, purification, and enzymatic properties of naringinase produced by liquid fermentation with Aspergillus niger FFCC 848 were investigated. The fermentation broth produced from liquid fermentation by A. niger FFCC 848 was purified by ammonium sulfate fractional precipitation, dialysis, and DEAE-Sepharose FF anion exchange chromatography to yield highly purified naringinase. Only one clear band was observed upon sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, with a molecular weight of 65.10 ku. The final, purified naringinase showed 13.82-fold purification, with an enzyme activity recovery of 13.30% and specific activity of 6932.54 U/mg, and the enzyme could effectively hydrolyze naringin. Furthermore, the activity of naringinase was stable at 20–50°C and pH 3.0–6.0; optimum activity was observed at 50°C and pH 4.5. In a specific concentration range, the enzyme activity was enhanced by K +, Ca 2+, and Na +, but was strongly inhibited by Fe 3+, SDS, and EDTA-Na 2. This study provides a basis for understanding the purification of naringinase and for further studies of the related mechanism underlying the bioconversion of bioactive natural products with naringinase.Key words: Aspergillus niger ; liquid fermentation; naringinase; purification; enzymatic properties柚苷酶（EC 3.2.1.40）是由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶组成，同时具有α-L-鼠李糖酶和β-D-葡萄糖苷酶的活性。

黑曲霉改良株C112产β-葡萄糖苷酶的诱导及条件优化

黑曲霉改良株C112产β-葡萄糖苷酶的诱导及条件优化先天敏;陈介南;张林【摘要】利用单因素实验及均匀设计法研究了黑曲霉C112发酵产β-葡萄糖苷酶的发酵条件.结果表明:黑曲霉C112发酵产β-葡萄糖苷酶的影响因素很多,包括接种方式(菌株活力)、接种量、碳氮源种类与浓度、发酵温度时间、初始pH值等.研究发现,通过种子接种改善菌株活力能有效提高产酶活力.碳源粒径也是影响诱导产酶效果的重要条件之一,当玉米芯粒径高于0.180 mm时产酶效果最佳.该菌株最适宜产酶条件为:玉米芯与麦芽浸粉(7:3)6 g/L、初始pH值4.87、30℃下发酵120 h,所得酶活力最大可达12.925 U/mL,较优化前提高了79.0％.【期刊名称】《中南林业科技大学学报》【年(卷),期】2013(033)011【总页数】8页(P154-161)【关键词】黑曲霉;发酵β-葡萄糖苷酶;条件优化;麦芽浸粉【作者】先天敏;陈介南;张林【作者单位】中南林业科技大学国家林业局生物乙醇研究中心,生物环境科学与技术研究所,湖南长沙410004;中南林业科技大学国家林业局生物乙醇研究中心,生物环境科学与技术研究所,湖南长沙410004;中南林业科技大学国家林业局生物乙醇研究中心,生物环境科学与技术研究所,湖南长沙410004【正文语种】中文【中图分类】S718.43;S718.52+1.3C112发酵产β- 葡萄糖苷酶的影响因素很多，包括接种方式(菌株活力)、接种量、碳氮源种类与浓度、发酵温度时间、初始pH值等。

研究发现，通过种子接种改善菌株活力能有效提高产酶活力。

碳源粒径也是影响诱导产酶效果的重要条件之一，当玉米芯粒径高于0.180 mm时产酶效果最佳。

该菌株最适宜产酶条件为：玉米芯与麦芽浸粉（7:3）6 g/L、初始pH值4.87、30 ℃下发酵120 h，所得酶活力最大可达12.925 U/mL，较优化前提高了79.0 %。

生物燃料乙醇可以替代石油等化石能源,是发展低碳经济的重要新能源[1]。

黑曲霉液态发酵产糖化酶条件的研究

３．ＡｎｈｕｉＳｏｌｉｄ－ｓｔａｔｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆＥｎｇｉｎｅｅｉｒｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｙｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，Ｂｏｚｈｏｕ，Ａｎｈｕｉ２３６８２０，Ｃｈｉｎａ）
ｍａｔｅｒｉｌａｄｏｐｅｐｔｏｎｅ，２９℃ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒｃａｌｌｂｅｕｓｅｄａｓｈｅｔｏｐｔｉｍａｌｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｍａｘｉｍｕｍｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ；ｌｉｑｕｉｄ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ
葡萄糖淀粉酶简称糖化酶，可水解淀粉、糊精、
黑曲霉。１．１．２实验试剂可溶性淀粉、葡萄糖、酵母膏、琼脂、蛋白胨、硫酸铜、次甲基蓝、亚铁氰化钾、氢氧化钠、硫酸亚铁、
１．１－３实验主要仪器恒温培养箱、立式自动电热压力蒸气灭菌锅、数
糖原等物质，产物为葡萄糖。在工业发酵生产酒精、有机酸、氨基酸等过程中淀粉液化后的糖化酶作用

黑曲霉As.n.XEC-1液体发酵产β-葡萄糖苷酶条件及酶学性质研究

ＭｇＯＳ・Ｈ．３蛋白胨０３酵母膏０３水杨苷００，７Ｏ００，．，．，．６初始ｐ５０Ｈ．．
１２方法．
１２１种子培养方法：面菌种培养是将黑曲霉ＡｓＸＥ－．．斜．Ｃ１接在试管斜面培养基上子培养基：Ｄ培养基．．．ＰＡ
１１４摇瓶发酵培养基（／０）玉米粉２麸皮２谷糠２黄豆粉２（Ｏ０５ＫＨＰ００，．．ｇ１０ｍＬ：，，，，ＮＨ）Ｓ．，Ｏ．５
纤维素降解有关的酶主要有三种：内切葡聚糖苷酶（Ｃ．．．）外切葡聚糖苷酶（Ｃ．．．１和Ｅ３２１４，Ｅ３２１９）
葡萄糖苷酶（Ｃ．．．１］在纤维素酶解过程中，维二糖是外切葡聚糖苷酶和内切葡聚糖苷酶的强烈Ｅ３２１２）．纤抑制剂，纤维二糖的积累能显著降低纤维素的水解进程，］向纤维素水解体系中添加葡萄糖苷酶，过将通纤维二糖转化为葡萄糖来消除这种抑制作用 ” ．。而葡萄糖苷酶即纤维二糖水解酶，］是纤维素酶的重要组成部分，够协助纤维素酶将纤维素水解为葡萄糖ｌ，高纤维素酶的降解能力，已广泛应用于食品、造、能４提］现酿啤酒、动物饲料、织干洗、浆造纸、业以及基础科学研究中，纺制农具有很高的应用价值．］葡萄糖苷酶能将水果、蔬菜、叶等中的一些次级代谢产物—— 风味前体物质糖苷水解为具有浓郁茶香气的物质，因此，萄糖苷酶可以应用于果汁饮料、葡果酒酿造以及茶叶的加工中，而将潜在的香气物质从前体水解，释放出香气成分，加食品香气，高产品的感官质量．葡萄糖苷酶对大部分普通色素具有降解增提作用，例如可以将花青素降解为糖和花色素，因此将葡萄糖苷酶用于饮料如白葡萄酒的脱色，取得较好的效果．］本研究筛选获得了一株具有高葡萄糖苷酶活力的菌株，其进行了发酵优化控制及酶活性质研对究．现将研究结果报道如下：

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第42卷第5期2008年9月生物质化学工程B iomass Che m ical Eng i n eeringV o.l 42N o .5Sep .2008黑曲霉液体发酵制备B -葡萄糖苷酶的研究收稿日期:2008-02-20基金项目:国家自然科学基金(30471361),江苏省高校自然科学重大基础研究项目(06KJ A22015) 作者简介:刘敏(1981-),女,江苏徐州人,硕士生,主要从事生物质资源生物降解与转化的研究*通讯作者:勇强,教授,博士生导师,主要从事生物质资源生物降解与转化和制浆造纸生物技术研究。

刘敏,欧阳嘉,勇强*,余世袁(南京林业大学化学工程学院,江苏南京210037)摘要:研究了培养条件对黑曲霉液体发酵制备B -葡萄糖苷酶的影响及B -葡萄糖苷酶的表观酶学性质。

麸皮是黑曲霉B -葡萄糖苷酶的较适诱导物。

黑曲霉NL02以40g /L 麸皮为碳源,在250mL 三角瓶中装液40mL,接种量8%,初始p H 值5.5,30e 、170r /m in 下培养10d ,B -葡萄糖苷酶活力为19.12I U /mL 。

B -葡萄糖苷酶最适温度为65e ,40e 时稳定性较好;最适p H 值为4.8,在p H 值3.0~5.0之间稳定性较好。

关键词:黑曲霉;B -葡萄糖苷酶;麸皮中图分类号:TQ91;Q 55 文献标识码:A 文章编号:1673-5854(2008)05-0005-04Preparati on of B -G l ucosi dase by A s p er gillus ni ger i n Sub merged Fer m entati onL IU M i n ,OUYANG-Jia ,YONG Q iang ,YU Sh-i yuan(Co ll ege of Chem ical Eng i neeri ng ,N anji ng F orestry U niversity ,N anji ng 210037,Ch i na)Abstrac t :The effects o f culture cond iti on on B -g lucosidase prepara ti on by A sp ergillus ni ger i n sub m erged fer m en tati on and the apparen t enzym ati c properties of B -g l ucosi dase we re i nvestigated .W heat bran w as the opti m a l i nducer o f B -g l ucosi dase a m ong tested carbon sources .T he opti m al culture cond iti on o f B -g l ucosi dase preparati on by A.n i ger i n subme rged fer m entati on w as 40mL m edi u m i n 250mL shake fl ask ,the i nocu lati on w as 8%,the i nitial p H value w as 5.5,t he culture te m perature and rota -ti on speed of Incuba t o r Shaker w ere 30eand 170r /m in ,respecti ve l y ,and the h i ghest B -g lucosidase acti v ity of 19.12I U /mLw as ob tained for 10days culti v ati on .The opti m a l te m perature and p H va l ue o f B -g l uco si dase reac ti on w as 65e and 4.8,respec -ti ve l y .The B -g l ucos i dase was stab l e unde r 40eand i n t he env iron m ent p H value o f 3.0-5.0.K ey word s :A spergilli us ni ger ;B -g lucosidase ;wheat branB -葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)是纤维素酶系的主要组分,其在纤维素水解过程中的作用是将纤维素经内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)和外切葡聚糖酶(EC 3.2.1.91)作用产生的纤维低聚糖和纤维二糖水解成葡萄糖[1]。

除了纤维素糖化外,B -葡萄糖苷酶还广泛应用于食品、酿造、饲料、纺织、造纸和农业等领域[2]。

虽然自然界中大多数能够分泌纤维素酶的微生物也能合成B -葡萄糖苷酶,但不同的微生物合成B -葡萄糖苷酶的能力有差异。

黑曲霉(A s pergillus niger )是较好的B -葡萄糖苷酶生产菌株,本文作者研究了培养条件对黑曲霉NL02液体发酵制备B -葡萄糖苷酶的影响及B -葡萄糖苷酶的表观酶学性质。

1 实验1.1 菌种黑曲霉(A s p ergillus ni g er )NL02,由南京林业大学生物化工研究所保藏。

1.2 材料麸皮,收集于江苏省徐州市,粉碎至0.20~0.28mm;玉米芯、玉米秸秆,收集于江苏省盐城市,粉碎至0.20~0.28mm;硫酸盐纸浆,南京林业大学制浆造纸工程研究所提供;羧甲基纤维素,由上海国药集团提供。

1.3 培养基斜面培养基:PDA 培养基。

种子培养基:6生物质化学工程第42卷M andels培养基[3]。

发酵培养基:麸皮40g/L, (NH4)2SO44g/L,KH2PO43g/L,M gSO4#7H2O0.4g/L,C a C l20.5g/L。

1.4种子制备一定量的种子培养基置于250m L带棉塞的三角瓶中,于121e、30m in灭菌冷却后接入黑曲霉孢子,于170r/m i n、30e下培养48h后获得菌丝体种子液。

1.5B-葡萄糖苷酶的制备一定体积的产酶培养基置于250mL带棉塞的三角瓶中,接种量分别为6%、8%、10%、15%、20%、25%和30%(体积分数),于170r/m in、30e的恒温摇床上培养10d,培养液于3000r/m in下离心10m in得到粗酶液。

1.6最适pH值及酸碱稳定性的测定分别用不同pH值缓冲液配制的对硝基苯基-B-D-葡萄糖苷(pNPG)溶液为底物,按标准方法测定B-葡萄糖苷酶活力,酶活力以最高酶活力的相对百分数表示。

取适量的B-葡萄糖苷酶液,与一定体积的p H值为3.0~8.0的缓冲溶液混合后于50e下处理2h,按标准方法测定B-葡萄糖苷酶活力,酶活力以原酶活力的相对百分数表示。

1.7最适温度及热稳定性的测定在55~75e范围内,按标准方法测定B-葡萄糖苷酶活力,酶活力以最高酶活力的相对百分数表示。

取适量的B-葡萄糖苷酶液在pH值4.8,温度分别为40、50、60e下保温3h,每隔30m i n 取样按标准方法测定B-葡萄糖苷酶活力,酶活力以原酶活力的相对百分数表示。

1.8分析方法还原物的测定采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法[4],B-葡萄糖苷酶活力、滤纸酶活力按国际标准方法测定[4-5]。

2结果与讨论2.1碳源对B-葡萄糖苷酶的诱导作用B-葡萄糖苷酶属于诱导酶类,其生物合成受到诱导调节控制,碳源通常是酶合成的诱导物质。

不同碳源对黑曲霉NL02合成B-葡萄糖苷酶的诱导作用如图1。

图1不同碳源对B-葡萄糖苷酶合成的影响F i g.1Th e effec t of carbon sources on the prep ara-tion of B-g l ucosidase由图1可知,不同碳源诱导黑曲霉合成B-葡萄糖苷酶的能力不同,麸皮对B-葡萄糖苷酶的诱导作用最强。

黑曲霉NL02以40g/L的麸皮为碳源时,B-葡萄糖苷酶活力达到6.00I U/mL,而以相同浓度的玉米芯为碳源,B-葡萄糖苷酶活力仅为2.61I U/mL。

从图1还可看出,随着原料中纤维素聚合度的增加,碳源对B-葡萄糖苷酶的诱导作用逐步降低,说明低聚合度的纤维素对B-葡萄糖苷酶的诱导作用较强。

当碳源为聚合度较高的硫酸盐纸浆和羧甲基纤维素时,B-葡萄糖苷酶活力仅为0.26和0.22I U/mL。

2.2培养条件对B-葡萄糖苷酶合成的影响2.2.1初始p H值的影响黑曲霉NL02以40g/L的麸皮为碳源,培养基初始pH值对B-葡萄糖苷酶合成的影响如图2。

由图2可知,培养基初始p H值为5.5时B-葡萄糖苷酶活力最高,达6.18I U/mL,高于或低于最适pH值,酶活力都呈下降趋势。

图2初始pH值对B-葡萄糖苷酶合成的影响F i g.2Th e effect of i n iti al p H val ue on th e prep ara-tion of B-g l ucosi dase第5期刘敏,等:黑曲霉液体发酵制备B -葡萄糖苷酶的研究72.2.2 接种量的影响接种量对B -葡萄糖苷酶合成的影响如图3。

由图3可知,在较低接种量时,酶活力随着接种量的增加而增加,当接种量为8%时酶活力达到最高值5.73I U /mL ,之后随着接种量的增加,酶活力呈下降趋势,当接种量为30%时,B -葡萄糖苷酶活力仅为1.91I U /m L 。

图3 接种量对B -葡萄糖苷酶合成的影响Fig .3 The effect of i nocu lation a m ount on thepreparation of B -glucosidase2.2.3 装液量的影响黑曲霉NL02在250mL 三角瓶中分别装液30、40、50、60和70m L ,初始p H 值为5.5的培养基,接种量为10%,于30e 、170r /m in 下培养,装液量对B -葡萄糖苷酶合成的影响如图4。

装液量在一定程度上反映氧的供应,在相同摇瓶体积下,装液量越小,氧的供应则越大。

由图4可知,在250mL 的三角瓶中装液量为40mL 时,B -葡萄糖苷酶活力最高,达到11.29I U /mL 。

当装液量超过40mL 时,溶氧状况变差,酶活力迅速下降,当装液量提高到70mL 时,B -葡萄糖苷酶活力仅为3.46I U /m L。

图4 装液量对B -葡萄糖苷酶合成的影响Fig .4 The effect of m ed i um ch arge on th epreparation of B -glucosidase2.3 黑曲霉液体发酵制备B -葡萄糖苷酶历程在250mL 三角瓶中,黑曲霉以40g /L 麸皮为碳源,在装液量40mL 、初始pH 值5.5、接种量8%、30e 、170r/m i n 下培养,培养过程中B -葡萄糖苷酶活力、滤纸酶活力随时间的变化如图5。