转基因小鼠制备方法

转基因小鼠的制备方法1. 确定转基因目标首先需要确定要制备的转基因小鼠的目标。

这可能包括表达某一特定基因、缺失或激活某一基因、或者将外源基因导入小鼠基因组中。

确定目标可以指导后续制备转基因小鼠的方案和步骤。

2. 选择转基因制备方法根据目标确定适合的转基因制备方法。

常用的制备方法包括基因敲除、转基因导入、RNA干扰等技术。

选择合适的方法可以提高转基因小鼠制备成功率和效率。

3. 筛选合适的人工受精方法在制备转基因小鼠的过程中，需要进行人工受精。

选择合适的人工受精技术可以增加诞生的转基因小鼠数量和通过率。

4. 获取合适的基因材料获取适合用于转基因制备的基因材料，如合成的DNA、质粒DNA等。

同时需要对基因材料进行检测和纯化，确保其纯度和有效性。

5. 操作动物实验室在制备转基因小鼠的过程中，需要操作动物实验室，按照严格的操作规程进行。

这包括对实验室环境、设备的维护和消毒，以及对动物进行规范的喂养和饲养。

6. 采集卵巢和精子制备转基因小鼠的过程中需要采集卵巢和精子，所以需要进行手术操作。

手术前需要对手术器械和手术区域消毒和准备，同时需要准确的手术技术和配合的团队，以确保手术的成功率和安全性。

7. 受精与移植将采集到的卵巢和精子进行人工受精，通过一定的操作步骤，将受精卵移植到雌鼠子宫中。

这个过程需要对移植操作技术的掌握和实验设备的准备，同时要考虑动物的生理状态和应对可能出现的并发症。

8. 生成基因编辑电子对于基因敲除和编辑的转基因小鼠制备，需要经过足够长的时间养护和观察，以鉴定是否成功。

为了确保小鼠的转基因性，可以通过检测其DNA进行验证。

9. 鉴定转基因小鼠通过PCR、Southern印迹和Western印迹等技术对转基因小鼠进行鉴定，以确保其基因表达状态符合预期。

检测结果对于小鼠繁殖和应用阶段的进行具有重要的指导意义。

10. 培育和应用转基因小鼠在检测合格后，需要对转基因小鼠进行养育和观察。

同时对于其应用也需要依据对小鼠目标的不同，进行个性化的实验设计和数据处理。

转基因小鼠构建技术分类
目前主流的转基因小鼠构建技术主要包括以下几类：
1 显微注射法
将改建后的目的基因(或基因组片段)用显微注射法注入供体小鼠的受精卵(或着床前胚胎细胞)，然后将此受精卵(或着床前胚胎细胞)再植入受体动物的输卵管(或子宫)中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。

2 胚胎干细胞介导法
胚胎干细胞介导法是转基因动物培育的主要途径之一。

通过将外源基因导入胚胎干细胞，然后将转基因的胚胎干细胞注射入受体动物胚胎后，可参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合。

3 逆转录病毒感染法
主要是利用反转录病毒的长末端重复序列(LTR)区域具有转录启动子活性的特点,将外源基因连接到LTR下游进行基因重组后,再包装成为高滴度病毒颗粒,去直接感染受精卵或显微注入囊胚腔中,携带外源基因的反转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。

4 精子载体导入法
精子载体法是以精子作为外源基因的载体，在受精过程中将外源基因导入动物胚胎，从而使外源基因进入子代的基因组中。

转基因小鼠的构建
转基因小鼠的构建主要涉及到显微注射法或利用DNA转座子系统提高转基因的表达阳性率。

以下是具体的步骤：
1.准备阶段：选择适合构建转基因小鼠的受体小鼠，如7~8周龄雌性小鼠，并进行相应的生理调整，
如注射PMSG和HCG。

2.受精卵的获取：通过手术从供体小鼠的输卵管中取出受精卵，并在适当的培养条件下进行培养。

3.转基因操作：在显微镜下，将线性化的外源DNA片段或构建到转座子质粒中的外源待表达的DNA
片段，通过显微注射法直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到小鼠基因组中。

4.受体小鼠的准备：将受体小鼠麻醉后，进行受精卵的移植。

5.转基因小鼠的筛选和鉴定：通过PCR等方法对转基因小鼠进行筛选和鉴定，确认外源基因已经成
功整合到小鼠基因组中，并且能够过量表达。

需要注意的是，转基因小鼠的构建过程需要高度的专业知识和技术，同时还需要遵守相关的伦理和法规。

因此，在进行转基因小鼠的构建前，需要充分了解相关的知识和技术，并遵循相关的规定和指导原则。

Cre转基因小鼠制备技术方法
Cre酶是在噬菌体内发现的一种酶，它能特异性的识别LoxP序列，并把同方向排列的两个LoxP序列之间的DNA切掉。

前面说了，我们把LoxP序列放到了打算敲除基因的两侧，那么我们如果把Cre酶放到细胞核里，目的基因就被Cre酶切掉，从而实现目的基因敲除了。

于是人们制作了能够表达Cre酶的转基因小鼠。

把Cre转基因小鼠和插入了LoxP序列的小鼠交配，就可以得到同时携带Cre和LoxP序列的小鼠了。

当Cre在细胞核内遇见LoxP序列，目的基因就被敲除了。

想控制在哪个细胞或者什么时间敲除目的基因，只要控制Cre酶就可以了。

制作Cre转基因小鼠时在Cre酶前面放上特异性的启动子，那么Cre酶就在该启动子表达的细胞或组织内表达，这样就只有这个组织或细胞内的目的基因被敲除。

时间上控制基因敲除的方法更为巧妙。

人们修饰了Cre酶基因，修饰后的Cre基因可以转录为mRNA，也可以在核糖体上翻译为蛋白质。

但是这种蛋白没有穿过细胞核膜的能力，也就无法进入细胞核发挥切割DNA序列的功能。

当人们外源性给予药物他莫昔芬（tamoxifen，缩写TM，是雌激素类似物）后，修饰的Cre酶就会获得穿过细胞核膜的能力。

于是Cre进入细胞核，与基因组相遇，切割掉LoxP之间的序列。

于是人们实现了什么时候给药，什么时间敲除基因（当然得给Cre 一点时间穿过细胞核膜）。

需要注意的是，Cre是一种酶，那么和所有酶一样，它的作用效果不会是百分之百的。

也许100个细胞里表达了Cre，大约70个细胞内的基因被敲除。

转基因小鼠制备实验方法1.计划设计：首先确定研究目的和研究对象基因的功能。

根据目的，选择适合的转基因策略。

2.构建转基因载体：根据研究对象基因的序列，设计合成含目标基因的转基因载体。

一般可选择质粒、病毒载体或者合成RNA/DNA方式构建转基因载体。

3.构建胚胎干细胞（ES）或受精卵DNA库：通过开展反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方式，从小鼠胚胎组织中制备出RNA，然后利用逆转录酶将RNA转化成cDNA；之后，利用特定引物扩增目标基因的cDNA片段，将其克隆到适当的表达载体中，最终构建ES细胞库或者受精卵DNA库。

4.转染、筛选和克隆：将所构建的转基因载体导入到ES细胞或者受精卵中，使其整合到其基因组中。

然后，采用药物筛选、DNA分子标记、PCR和Southern blot等方法对转染后的细胞进行筛选和鉴定，获得含有目标基因的ES细胞克隆或者转基因小鼠胚胎。

5.基因敲除或添加：6.培养和培育：将获得的转基因ES细胞或者受精卵注入到养殖母鼠子宫中进行妊娠，然后等待幼鼠出生。

根据需要，可将转基因小鼠进行进一步培养、繁殖和鉴定。

为了进行转基因小鼠的后代繁殖，需要对转基因小鼠进行基因型鉴定和表型分析。

7.基因鉴定和表型分析：通过PCR、Southern blot、Western blot、RT-PCR或者其他的基因鉴定技术，对转基因小鼠的基因型进行鉴定。

同时，可以通过行为学、生理学和病理学等方法对转基因小鼠进行表型分析。

8.数据分析与结果解读：对表型数据进行统计分析，绘制图表或者进行统计学分析。

根据实验设计和方法，对实验结果进行解读，并得出相关结论。

总结起来，转基因小鼠制备是一个复杂而严谨的实验过程。

通过设计转基因载体、构建DNA库、转染和克隆、培养和培育小鼠以及基因鉴定和表型分析，可以成功制备目标基因转基因小鼠，并用于研究其功能、调控机制以及在疾病中的作用。

RNAi转基因小鼠构建技术原理
制作转基因小鼠最常用的一种方法是DNA原核显微注射。

DNA 原核显微注射是指将外源DNA通过显微注射的方法注射到受精卵的原核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的基因组中，并稳定遗传给后代。

使用PiggyBac系统DNA显微注射，制备的转基因鼠基因表达阳性率为常规质粒DNA显微注射的2倍以上！
RNAi转基因小鼠
通常采用U6/H1驱动shRNA表达，设计靶序列构建shRNA载体，利用原核显微注射的方法将shRNA载体注射到受精卵中。

在基因表达的过程中，通过shRNAi的干扰作用，达到对目的基因表达的沉默抑制，实现基因功能的研究。

制备转基因小鼠的原理
制备转基因小鼠的原理是通过基因工程技术将外源基因导入小鼠的基因组中。

具体步骤如下：
1. 选择目标基因：根据研究需求选择要导入小鼠基因组的外源基因。

这个外源基因可以来自其他物种，也可以是已存在于小鼠中但表达量较低的基因。

2. 构建质粒：将选择的目标基因与载体DNA（如质粒）连接。

质粒通常含有特定的启动子、终止子和选择性标记基因（如抗生素抗性基因），以便检测和筛选成功导入外源基因的小鼠。

3. 体外培养：将构建好的质粒导入细胞培养物中，利用细胞的自身复制和修复机制，使质粒与小鼠细胞的染色体发生重组，将外源基因导入到小鼠的基因组内。

4. 选择性筛选：为了筛选成功导入外源基因的细胞，可以添加抗生素等选择性标记物质，只有带有外源基因的细胞能够存活下来。

5. 胚胎干细胞注射：将筛选出的带有外源基因的细胞注射到小鼠的早期胚胎中。

这些细胞会参与胚胎发育，在小鼠的成体组织中形成细胞系，继续表达外源基因。

6. 交配和繁殖：将带有外源基因的小鼠进行交配和繁殖，使外源基因在小鼠种群中得以传递和稳定遗传。

通过以上步骤，外源基因成功导入小鼠基因组，并表达在小鼠的细胞和组织中，从而达到制备转基因小鼠的目的。

转基因小鼠制备实验方法1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。

2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。

3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。

受体笼拿出作好隔离措施。

4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。

显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。

5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。

6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。

7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。

DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。

8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。

将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。

9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。

手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。

吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。

除较长的那段液体，其余的液体大致1cm 左右，气泡0.2cm左右。

将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。

转基因小鼠制备实验方法1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。

2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。

3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。

受体笼拿出作好隔离措施。

4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。

显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。

5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。

6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。

7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。

DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。

8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。

将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。

9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。

手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。

吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。

除较长的那段液体，其余的液体大致1cm 左右，气泡0.2cm左右。

将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。

1. 基因准备2. 实验用鼠的饲养小鼠品系的选择需结合实验要求，如果必须使用规定的品系，则可按规定或特定要求进行。

用于转基因实验的小鼠根据其作用可分为供体鼠、受体鼠、结扎公鼠、种质公鼠。

供体鼠是提供受精卵的母鼠，为了得到更多的受精卵，通常要对其进行激素注射；受体鼠是用于胚胎移植的假孕母鼠，以后生育转基因小鼠；结扎公鼠是有交配能力，但没有繁殖生育能力的公鼠；种质公鼠用于与供体母鼠配种。

本项试验将全部应用C57/BL6 ×DBA杂交的F1代小鼠。

转基因实验需要定期提供相当数量的母鼠作为受精卵供体和假孕母鼠，以及一批相对稳定的正常公鼠与结扎输精管的公鼠（简称结扎公鼠）。

这些鼠可由实验动物中心提供，在实验前做好这些鼠与转基因相关的管理与饲养。

2.1 供体鼠一般说来，杂交子一代鼠较纯系鼠产卵多，受精卵显微注射后两细胞分裂率较高，产仔较好。

作为供体母鼠的种系，自然产卵数与超排卵数均应较高。

一般用4～6周产仔更多但卵细胞膜脆性较大，在操作过程中易破裂；而6周以后母鼠产卵逐渐减少。

2.2 受体鼠（即假孕母鼠）母鼠在正常发情期与结扎公鼠交配即产生假孕母鼠，假孕母鼠作为显微注射后受精卵的受体及其后代的养母。

这种母鼠以6周龄至5个月龄较适宜，体重最好大于20克。

母鼠一般4～5天为一个发情周期，因此在1个较大的母鼠群中约有20～25％进入发情期，如进入发情母鼠数与结扎公鼠数相近，可将每个公鼠笼内放1只母鼠；如母鼠数显著多于公鼠，可于每个公鼠笼内放2～3只母鼠。

也可不考虑发情期，随机将每个公鼠笼内放2～4只母鼠。

一般准备较多的假孕母鼠以防移卵失败。

未使用的假孕母鼠可在阴栓产生两周后重复使用。

2.3 结扎公鼠结扎公鼠与母鼠交配以后产生假孕母鼠和供体母鼠。

用作母鼠假孕的结扎公鼠需8周龄以上，对种系无特殊要求。

在作正式实验以前，每只结扎公鼠至少需要和3只母鼠交配，使母鼠只产生阴栓而均不怀孕，方可投入正式实验。

结扎公鼠可每晚与母鼠交配，但最好是隔日一次。