培养转基因小鼠的原理

基因编辑小鼠如何分类？
基因编辑小鼠可分为三大类、7 小类：
（1）转基因（Tg）首先构建表达载体，包含启动子、增强子、编码区、polyA 等元件，然后将表达载体注入到受精卵的细胞核内，外源表达载体将插入到受精卵的基因组内，再将该受精卵移植到受体母鼠输卵管内，发育成为小鼠个体，该小鼠就会表达转入的外源基因。

（2）基因全身性敲除（KO）利用Crispr/Cas9 系统，在受精卵的目标基因的编码区两侧分别切断，然后受精卵在连接断口的过程中，会丢失掉断口之间的序列（即编码区）。

该受精卵移植到受体母鼠输卵管内，发育成为小鼠个体，该小鼠将无法表达目标基因，导致目标基因将完全失去活性，表现为全身性基因敲除。

（3）基因敲入（KI）首先构建打靶载体：包含同源臂和外源基因，然后将表达载体通过显微注射的方法注入到受精卵的细胞核内，同时利用 Crispr/Cas9 系统，在受精卵目的基因位置切断基因组 DNA，受精卵会通过同源重组将外源基因定点整合到基因组内。

该受精卵移植到受体母鼠输卵管内，发育成为小鼠个体，该小鼠就携带了转入的外源基因。

转基因小鼠的制备方法1. 确定转基因目标首先需要确定要制备的转基因小鼠的目标。

这可能包括表达某一特定基因、缺失或激活某一基因、或者将外源基因导入小鼠基因组中。

确定目标可以指导后续制备转基因小鼠的方案和步骤。

2. 选择转基因制备方法根据目标确定适合的转基因制备方法。

常用的制备方法包括基因敲除、转基因导入、RNA干扰等技术。

选择合适的方法可以提高转基因小鼠制备成功率和效率。

3. 筛选合适的人工受精方法在制备转基因小鼠的过程中，需要进行人工受精。

选择合适的人工受精技术可以增加诞生的转基因小鼠数量和通过率。

4. 获取合适的基因材料获取适合用于转基因制备的基因材料，如合成的DNA、质粒DNA等。

同时需要对基因材料进行检测和纯化，确保其纯度和有效性。

5. 操作动物实验室在制备转基因小鼠的过程中，需要操作动物实验室，按照严格的操作规程进行。

这包括对实验室环境、设备的维护和消毒，以及对动物进行规范的喂养和饲养。

6. 采集卵巢和精子制备转基因小鼠的过程中需要采集卵巢和精子，所以需要进行手术操作。

手术前需要对手术器械和手术区域消毒和准备，同时需要准确的手术技术和配合的团队，以确保手术的成功率和安全性。

7. 受精与移植将采集到的卵巢和精子进行人工受精，通过一定的操作步骤，将受精卵移植到雌鼠子宫中。

这个过程需要对移植操作技术的掌握和实验设备的准备，同时要考虑动物的生理状态和应对可能出现的并发症。

8. 生成基因编辑电子对于基因敲除和编辑的转基因小鼠制备，需要经过足够长的时间养护和观察，以鉴定是否成功。

为了确保小鼠的转基因性，可以通过检测其DNA进行验证。

9. 鉴定转基因小鼠通过PCR、Southern印迹和Western印迹等技术对转基因小鼠进行鉴定，以确保其基因表达状态符合预期。

检测结果对于小鼠繁殖和应用阶段的进行具有重要的指导意义。

10. 培育和应用转基因小鼠在检测合格后，需要对转基因小鼠进行养育和观察。

同时对于其应用也需要依据对小鼠目标的不同，进行个性化的实验设计和数据处理。

Cramp转基因小鼠的构建及鉴定石桂英;全雄志;陈显达;陈陟阳;董伟;张连峰;鞠振宇【摘要】目的建立系统性表达Cramp转基因模型小鼠,为研究Cramp在衰老中的作用提供模型动物.方法把Cramp cDNA插入系统性表达CMV启动子下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立Cramp转基因小鼠.PCR鉴定转基因小鼠的基因型,用RT-PCR和Western blotting方法筛选高表达品系.结果成功构建Cramp cDNA转基因载体,建立了Cramp转基因小鼠,通过RT-PCR和Western blotting 方法筛选出3个高表达品系.结论建立了系统表达Cramp转基因小鼠,转入的Cramp基因在骨髓、脾脏、肝脏等组织高表达,为研究Cramp基因在衰老中的作用及机制提供了动物模型.【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2010(020)009【总页数】4页(P12-15)【关键词】Cramp;转基因小鼠;衰老【作者】石桂英;全雄志;陈显达;陈陟阳;董伟;张连峰;鞠振宇【作者单位】中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所,北京,100021;中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所,北京,100021;中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所,北京,100021;中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所,北京,100021;中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所,北京,100021;中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所,北京,100021;中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所,北京,100021【正文语种】中文【中图分类】R-33Cramp（cathelin-related antimicrobial peptide）基因，位于9号染色体，其编码蛋白为cathelin-related antimicrobial peptide，即cathelicidin。

该类蛋白是在哺乳动物体内发现的一类结构多变的抗微生物肽，因在表达的信号肽与成熟肽之间含有一高度保守的cathelin肽段而自成一家族［1］。

2023北京高三一模生物汇编分子与细胞（综合题）一、综合题1．（2023·北京西城·统考一模）富营养化是多数淡水生态系统的主要水质问题，并导致蓝藻“水华”频发。

铜绿微囊藻是蓝藻“水华”中的常见种类。

为利用水生生物控制“水华”，研究了氮浓度对大型藻和金鱼藻控制铜绿微囊藻数量增长的影响。

(1)氮可用于合成铜绿微囊藻细胞中的_____（写出两种）等生物大分子，是限制藻类生长的重要因子。

(2)在不同氮浓度的培养液（其他营养充足）中加入等量铜绿微囊藻（1．0×105细胞/mL）和大型溞（浮游动物），置于适宜的光照、温度等条件下培养，定期取样测定铜绿微囊藻数量，结果如图1．研究者得出结论，利用大型溞有效控制铜绿微囊藻增长的氮浓度范围为0．5~4mg/L，依据是_____。

(3)水生植物可以为动物提供繁殖和栖息场所。

在（2）实验方案的基础上，每组再加入等量的金鱼藻（沉水植物）共同培养，得到铜绿微囊藻的生长曲线如图2．由图1、图2可知，与大型溞-铜绿微囊藻共培养相比，大型溞-金鱼藻-铜绿微囊藻三者共培养_____。

试分析出现该现象的原因。

_____(4)将上述研究成果应用于自然水体时，需要考虑食物网中更多物种间的相互作用。

自然水体的“水华”防治，可采取的措施有（）A．适度捕捞以浮游动物为食的鱼类B．适时投放以蓝藻为食的鱼类C．投放适量的水生植物生态浮床D．投放适量的噬藻体（蓝藻病毒）2．（2023·北京西城·统考一模）学习以下材料，回答（1）~（4）题。

S6蛋白参与调控细胞周期S6蛋白可以调控蛋白的乙酰化水平。

在肝癌、乳腺癌等癌症中S6的表达量明显升高。

为研究S6过表达的影响，将S6-GFP融合基因（GFP为绿色荧光蛋白基因）转入HeLa细胞系，挑选单个细胞培养两周，筛选出S6过表达细胞系。

观察发现，部分S6过表达细胞的染色体数目发生了变化。

在过表达S6的细胞中，检测到CDH1水平明显降低。

第1篇一、实验背景随着生物技术的飞速发展，转基因技术在医学、农业等领域发挥着越来越重要的作用。

小鼠作为生物医学研究中常用的实验动物，其基因编辑技术的应用为疾病模型构建、药物筛选和基因功能研究提供了有力工具。

本实验旨在通过基因编辑技术构建转基因小鼠模型，研究特定基因在小鼠体内的表达和功能。

二、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠，雄性，8周龄。

2. 基因构建材料：目的基因（GFP基因）、启动子（CMV启动子）、荧光素酶报告基因（Luc基因）、pEGFP-C1质粒载体、pGL3-Basic质粒载体。

3. 实验试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、PCR引物、Trizol试剂、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、细胞培养试剂等。

4. 仪器设备：PCR仪、凝胶成像系统、实时荧光定量PCR仪、细胞培养箱、显微镜等。

三、实验方法1. 目的基因构建：将GFP基因和Luc基因分别插入到pEGFP-C1和pGL3-Basic质粒载体中，构建重组质粒。

2. 重组质粒转染：将构建好的重组质粒通过脂质体转染法转染C57BL/6小鼠胚胎干细胞（ES细胞）。

3. 转基因小鼠胚胎细胞筛选：通过GFP荧光筛选，得到阳性细胞克隆。

4. 胚胎细胞传代培养：将阳性细胞克隆进行传代培养，筛选出稳定表达的细胞系。

5. 胚胎细胞冻存：将稳定表达的细胞系进行冻存，以备后续实验使用。

6. 胚胎移植：将冻存后的胚胎细胞进行移植，获得转基因小鼠。

7. 转基因小鼠表型鉴定：通过GFP荧光显微镜观察转基因小鼠体内GFP表达情况，并通过实时荧光定量PCR检测GFP基因在转基因小鼠体内的表达水平。

四、实验结果1. 重组质粒构建：成功构建了含有GFP基因和Luc基因的重组质粒。

2. 转基因小鼠胚胎细胞筛选：通过GFP荧光筛选，得到阳性细胞克隆。

3. 胚胎细胞传代培养：成功传代培养出稳定表达的细胞系。

4. 胚胎移植：成功获得转基因小鼠。

制备转基因小鼠的原理
制备转基因小鼠的原理是通过基因工程技术将外源基因导入小鼠的基因组中。

具体步骤如下：
1. 选择目标基因：根据研究需求选择要导入小鼠基因组的外源基因。

这个外源基因可以来自其他物种，也可以是已存在于小鼠中但表达量较低的基因。

2. 构建质粒：将选择的目标基因与载体DNA（如质粒）连接。

质粒通常含有特定的启动子、终止子和选择性标记基因（如抗生素抗性基因），以便检测和筛选成功导入外源基因的小鼠。

3. 体外培养：将构建好的质粒导入细胞培养物中，利用细胞的自身复制和修复机制，使质粒与小鼠细胞的染色体发生重组，将外源基因导入到小鼠的基因组内。

4. 选择性筛选：为了筛选成功导入外源基因的细胞，可以添加抗生素等选择性标记物质，只有带有外源基因的细胞能够存活下来。

5. 胚胎干细胞注射：将筛选出的带有外源基因的细胞注射到小鼠的早期胚胎中。

这些细胞会参与胚胎发育，在小鼠的成体组织中形成细胞系，继续表达外源基因。

6. 交配和繁殖：将带有外源基因的小鼠进行交配和繁殖，使外源基因在小鼠种群中得以传递和稳定遗传。

通过以上步骤，外源基因成功导入小鼠基因组，并表达在小鼠的细胞和组织中，从而达到制备转基因小鼠的目的。

使用 CRISPR-Cas9 创建转基因小鼠的方案虽然近年来已经开发了几种基因组编辑工具，包括锌指结构和 TALENs（转录激活物样效应物核酸酶），但没有一种能像CRISPR/Cas9系统那样高效，该系统由一个RNA引导的DNA内切酶 (Cas9) 和对应的引导RNA(CRISPR) 组成。

利用该系统，研究人员能够实现一步敲除多个基因的等位基因的突变小鼠1。

只需两三周的时间，即可创造出子携带条件性等位基因和报告基因的小鼠2，并且该方案。

特别要注意的是，该过程不需要创建修改的小鼠ES细胞过程，该过程有时会十分困难3。

随着 Cas9 敲入和敲除小鼠的发展，预计越来越多的实验室将选择 CRISPR/Cas9 系统来生成转基因小鼠模型。

使用CRISPR-Cas9创建转基因小鼠的方案动物学研究。

2016 年 7 月 18 日；37(4): 205–213.利用 CRISPR/Cas9 和单倍体胚胎干细胞系统产生基因修饰的小鼠。

图 1.在小鼠胚胎上使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑创建转基因小鼠的示意图。

通过共注射 Cas9 mRNA 和向指导 RNA，多个基因靶标可以在小鼠胚胎中一次敲除。

（改编自Yang H，Wang H 和 Jaenisch R. Nat Protoc。

2014 年 8 月；9(8):1956-68.）Sigma-Aldrich 是为基因组编辑提供工具和定制服务的领导者，包括 ZFN 和CRISPR/cas9。

默克还提供了广泛的小鼠胚胎验证培养基和试剂组合，用于储存、转移和扩增用于在EmbryoMAX™名下创建转基因小鼠模型的小鼠胚胎。

浏览所有的基因组编辑产品浏览所有经小鼠胚胎验证的试剂小鼠胚胎和ES细胞培养基小鼠ES细胞培养基实验方案和过程成功的小鼠模型项目的提示1.了解实验目的并开展研究。

生成正确的小鼠需要完全理解被测试依据的假设。

例如，研究者可能希望验证这样的假设：突变肝脏中的转运蛋白可能会减轻特定药物的肝毒性作用。

竭诚为您提供优质文档/双击可除小鼠基因型鉴定原理篇一：小鼠表型鉴定小鼠发育阶段特点出生为红色（若要换窝，要带一点周围的木屑，否则鼠妈不认识）→生后4-5天开始长毛→生后7天剪脚趾和剪尾巴做基因型鉴定→生后10天开眼→生后20天断奶→生后40天可以合笼→怀孕20天后产崽。

小鼠性别判断：雌鼠的后腹部左右两侧有明显的乳头。

小鼠发情判断：雌鼠一般出生后40天开始发情，发情时肛门（或阴道口）为红色。

之后一直处于可以生育阶段。

一般繁殖合笼为一雄配二三雌，一般不将两只雄鼠和一只雌鼠放在一起，因为两只雄鼠会打架。

在做完基因型鉴定之后要尽快把不需要的小鼠处死，因为小鼠太多雌鼠会奶水不足，当雌鼠奶水不足时，会吃掉鼠崽。

小鼠基因型鉴定配方：bufferA0.5meDTA(ph8.0)10mol/Lnaoh双蒸水定容到250mL室温储存100uL625uLbufferbTribase浓盐酸调ph到3.0室温储存40mm步骤：1．小鼠出生7天后剪尾巴（一小点就行），若出生30天后剪耳朵；2．75uLbufferA100℃煮40min，每20min摇一次；3．225uLbufferb12000r/min3min，上清为DnA，跑pcR 鉴定。

篇二：转基因小鼠鉴定实验转基因小鼠鉴定实验在刚出生产出的鼠仔中，属转基因小鼠者，约占全部仔小鼠的20％-30％。

因此，对转基因小鼠必须进行鉴定筛选。

1．转基因整合检测鉴定转基因小鼠最简单的方法是从小鼠尾尖提取基因组DnA，检测其基因型。

检测方法包括pcR和shouthern杂交。

（1）基因组DnA的提取：1）将离乳期小鼠（>4周龄）麻醉标记。

2）用一只手抓住小鼠，另一只手持消毒剪剪下约1cm的鼠尾。

（2）pcR检测：转基因的初始筛选通常采用pcR检测技术。

该技术操作简便、快速、费用低而有效，适合大量标本的分析。

由于该技术特别敏感，可能产生假阳性结果。

因此，在操作过程中必须特别小心，避免质粒DnA或其它标本的基因组DnA的污染。

实验动物按遗传特点分类近交系(Inbred Strain ) 封闭群(Closed Colony or Outbred Stock ) 杂交群(Hybrids) 1909年，莱托最早培育的近交系小鼠有DBA，DBA的名称取自淡化（dilute，d）、褐色化（Brown，b）、去杂色化（nonagouti, a)三种变异毛色的缩写。

C57 、C58,分别从编号为57、58的雌鼠培育而来。

1911年育成远交Wistar大鼠1918年以后，SD大鼠、Lewis大鼠、Long-Evans大鼠近交系( inbred strain)定义经至少连续20代的全同胞兄妹交配或亲子交配，近交系数(inbreeding coefficient)达到99%，品系内所有个体都可追溯到第20代或以后代数的一对共同祖先。

近交系数：群体中某个体通过遗传携带两个同源等位基因的概率。

近交系命名：一般以大写英文字母或大写英文字母加阿拉伯数字命名。

BALB ,DBA,TA1, C3H等。

一些历史较长，已经广泛使用并获得认可的品系除外，如129等。

亚系（Substrain)定义由同一个近交系分离出来的有不同特性的分支，这些分支间有遗传差异，称为该品系的亚系。

形成㈠在兄妹交配20-40代时形成的分支；主要原因是残留杂合（Residual heterozygosity）；㈡某分支与其它分支分开繁殖超过100代。

主要原因是突变㈢发现一个分支与其它分支的差异。

原因为残留杂合、突变或遗传污染（Genetic contamination）。

命名在品系名称后加一道斜线（/），斜线后标明亚系的符号，亚系的符号可以是以下三种a) 数字，如DBA/1、DBA/2等b) 培育或产生亚系单位或人的缩写英文名称，第一个字母用大写，以后的字母用小写。

使用缩写文名称应注意不要和已公布过的名称重复。

例如：A/He，表示A近交系的Heston 亚系；CBA/J，表示由Jackson保持的CBA近交系的亚系c) 当一个保持者保持的一个近交系具有两个以上的亚系时，可在数字后再加保持者的缩写英文名称来表示亚系。