侧孢芽孢杆菌复合试验操作指引

侧孢芽孢杆菌质粒提取方法的探究金术超,杜春梅＊,平文祥,关洪宇(黑龙江大学微生物重点实验室,黑龙江哈尔滨150080)摘要:以能够降解有机磷农药的两株侧孢芽孢杆菌BL -21和BL -22为研究对象,分别采用碱裂解法、试剂盒提取法和SDS 法对侧孢芽孢杆菌BL -21和BL -22的质粒进行提取,并通过凝胶电泳和紫外分光光度法对提取结果进行分析,试验结果证明,适合侧孢芽孢杆菌BL -21和BL -22的质粒提取方法是SDS 裂解法,该方法提取的质粒大小为10kb ,且该方法提取的结果稳定,质粒的产量和质量均符合分子生物学实验的要求。

关键词:质粒;侧孢芽孢杆菌;提取方法中图分类号:Q93.3;R446 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2005)06-0044-03Comparative Study on the Method of ExtractingPlasmid DNA of Bacillus laterosporusJI N Shu -chao ,DU Chun -mei ＊,PI NG Wen -xiang ,GUAN Hong -yu(Key Lab .of Microorganism ,Heilongjiang University ,Harbin 150080,China )A bstract :The plasmids of Bacillus lateros porus BL -21and BL -22were extracted by three different methods .The plas mids were anal yzed by a -garose gel electrophoresis and ultra spectrophotometers .The results showed that method of SDS extraction was the best method to extract the plasmid from Bacillus lateros porus .The size of plas mids was 10kb .Experiments demonstrated that conseq uences from this protocol were stable ,the quality and yield of plas mid DNA produced from it had met the standard for many molecular biology experiments .Key words :plas mid ;Bacillus latero spo ru s ;method of extraction 收稿日期:2005-05-28;修回日期:2005-08-19基金项目:黑龙江省教育厅骨干教师科研基金(1054G037);黑龙江省研究生创新科研资金项目作者简介:金术超(1977-),男,硕士研究生,专业方向:应用微生物与微生物分子生物学,E -mail :jsc1977510@ ;＊通讯作者:杜春梅(1972-),女,博士,副教授,硕士生导师,研究方向:生物农药与生物菌肥,发表论文10余篇,E -mail :Duchunmei1972@s ohu .com 。

芽孢杆菌检测试验方法所用的分析天平，移液管，滴定管，容量瓶等玻璃器皿按有关检定规定定期校正。

所用的水，在未注明其他要求量，均指蒸馏水或去离子水，所用的试剂，在未注明规格时，均为分析纯(A.R)4.1 感官指标：4.1.1 感官特性：从抽取的样品中，取适量倒在白纸或玻璃板上，在光线充足的条件下，观察颜色和状态，并品尝滋味，闻其气味。

4.1.2 过筛率：随机抽取500 g样品，取40目和20目的筛子，将样品取出100g 称重，过筛，再次称重，计算过筛率。

过筛后的总质量过筛率=-----------------×100%过筛前的总质量4.2菌种鉴别4.2.1菌落形态：培养24小时，暗白色或浅黄色圆形菌落，中央有小突起，不透明，表面干燥，菌落易挑起。

4.2.2 镜检菌体形态：0.5-0.6*2.5-3.5微米，杆状，中生芽孢、即使孢囊膨大、也不显著。

4.2.3 革兰氏染色：革兰氏阳性菌。

4.3 芽孢杆菌活菌总数4.3.1仪器、设备、试剂和培养基a.分析天平，感量为0.01g；b.恒温水浴锅；c.震荡器；d.高分辨力相差显微镜；e.湿热灭菌锅；f.超净工作台；g.研钵；h.血球计数板，XB-K-25；i.血球计数板专用盖玻片，20mm×20mm；j.加样枪；k.各类玻璃器皿。

9ml0.85%的无菌生理盐水试管，80ml 0.85%的无菌生理盐水的三角瓶，30ml 0.85%的无菌生理盐水的三角瓶，空的500ml三角瓶（内装10～15颗玻璃珠），空的20ml的刻度试管，1ml吸管，培养基配方：营养琼脂粉38g，蒸馏水1000ml。

上述物品，121℃，30分钟蒸汽灭菌后备用。

在超净工作台上将灭好菌的营养琼脂倒平皿，每个大约20ml，放在紫外灯下吹风1小时，然后放在工作台面过夜，第二天备用。

4.3.2 预处理：准确称取样品 1.00克，将其全部转入一只已消毒的直径约10厘米的研钵中，从上述30ml 0.85%的无菌生理盐水三角瓶中取出约5ml水加入研钵，研磨10分钟，然后使用无菌生理盐水将其全部转移到空的20ml的刻度试管中，定溶至20ml，用振荡器震荡2分钟，将其全部震荡均匀。

侧孢短芽孢杆菌产品特点，侧孢短芽孢杆菌使用方法侧孢短芽孢杆菌采用高科技专利技术，根据水稻整个生长季节虫害发生的特点，精心研制的一种微生物复合肥料，并采用微囊缓释生物农药技术配制而成。

能根据水稻的返青、分蘖期生长特点提供强力持效的肥力供应，又能保护侧孢芽孢杆菌的天然活性，今天小编就给大家介绍一下侧孢短芽孢杆菌产品特点，侧孢短芽孢杆菌使用方法。

侧孢短芽孢杆菌产品特点：侧孢短芽孢杆菌能有效的预防水稻二三化螟、稻纵卷叶螟、稻飞虱、稻象甲、稻蓟马，并能预防前期的叶枯病、稻瘟病、稻曲病，明显改善稻谷品质，完全替代移栽后追肥，真正做到防虫、控虫、返青、分蘖、增产、防病一撒解决，持效期长达60天。

作为非脊椎动物的病原菌，有关研究人员曾报道了这种细菌的杀线虫能力，由于所报道的这些侧孢短芽孢杆菌菌株都不产生伴孢晶体，所以这些菌株的杀线虫毒力因子并非来自于具有特征性的伴孢晶体。

然而，SmirnovaTA，etal.分离到了2株能形成大的伴孢晶体的侧孢短芽孢杆菌菌株，这两株菌显示出很强的杀昆虫能力，研究证实，这种能力与菌体在形成芽孢过程中的伴孢晶体相关。

有趣的是，Singer的实验表明，一株侧孢短芽孢杆菌的杀线活性源于一个热稳定蛋白的毒性。

所有这些研究表明，不同侧孢短芽孢杆菌菌株拥有不同的线虫致病因子。

牛秋红研究小组分离到的侧孢短芽孢杆菌G4菌株具有显著的杀线虫功能，但其并不产生伴孢晶体。

从该菌株的发酵液里提取的粗蛋白酶液在12h内能杀死所有测试线虫并在24h内完全降解。

从侧孢短芽孢杆菌G4菌株中纯化出的丝氨酸胞外蛋白酶可水解多种底物，包括胶原和线虫体壁，具有很强的杀线虫能力，组织病理电镜实验证实这种蛋白酶严重破坏了线虫体壁。

而且，蛋白酶将线虫体壁分解成为一些氨基酸或小肽，这些营养物使病原细菌更好的生长繁殖。

该蛋白酶基因异源表达的菌株表现出了明显的杀线虫活性，重组蛋白酶在体外对线虫体壁降解，而蛋白酶缺失菌株丧失了大部分的杀线活性，死亡线虫在生测中保持了完整的体壁，表明蛋白酶在线虫侵染中起主要作用。

侧孢芽孢杆菌
又名：侧孢短芽孢杆菌
【登记证号】】微生物肥(2013)准字(1045)号
【适用范围】生物肥料、生物农药、饲料添加剂、水产养殖的应用。

【产品特点】
1、侧孢芽孢杆菌的抗菌活性。

侧孢芽孢杆菌产生的抗菌物质种类丰富，对各类真菌和细菌都表现出广谱的抑菌活性。

已确定的抗菌物质有非肽类的芽孢菌胺、肽类抗生素、聚酮化合物以及几丁质酶等。

几丁质酶能降解真菌细胞壁，从而抑制真菌生长。

同时侧孢芽孢杆菌对青枯病菌、烟草黑胫病菌、致病性革兰氏阳性和阴性菌、食品腐败病菌均有抑制作用。

2、侧孢芽孢杆菌的杀虫活性。

侧孢芽孢杆菌对不同的无脊椎动物如昆虫、线虫和软体动物都具有致病性，能够抑制线虫的卵孵化和幼虫发育。

对马铃薯甲虫和烟草甲虫幼虫有毒性作用，对大豆夜蛾表现出不同的毒性水平。

对家蝇具有感染性，有杀蚊作用。

对水生蜗牛、光滑双脐螺、斑马贻贝有杀灭活性。

3、侧孢芽孢杆菌的解磷功能。

侧孢芽孢杆菌具有解磷、解钾等功能。

能够在含磷酸三钙的平板上形成透明圈，降解水胺硫磷。

4、侧孢芽孢杆菌对有机污染物的降解。

分解土壤中有毒有害的残余农药等有机污染物，吸附并阻止重金属进入植株。

【主要成分】侧孢芽孢杆菌活芽孢、发酵代谢产物、固态发酵基质。

芽孢杆菌检测方法及注意事项枯草、地衣芽孢杆菌检测方法及注意事项一、检测方法1.试剂和培养基1.1 样品稀释液：准确移取1mL吐温80，9gNacl用水定溶1000mL，分装400mL每瓶，灭菌备用。

1.2 芽孢杆菌培养基：蛋白胨：10g酵母浸粉：5gNaC1盐：10g琼脂粉：15gPH值：7.0～7.2蒸馏水：1000mL分装，121℃，30分钟蒸汽灭菌后备用。

2.检测步骤2.1样品处理（每个样品至少重复检测2次）a) 称取1～3g(准确至0.0002g)的试样或标样于250 mL内置磁性棒的中性瓶中（1000亿称1 g左右，2000亿称3 g左右，3000亿称2 g左右，5000亿称1.2 g左右，称样量视具体芽孢数而定）。

b) 加100 mL稀释液到已称样的中性瓶内。

c) 把上述中性瓶放在磁力搅拌器平台上,混合15min；之后再猛烈摇动1min，再次磁力搅拌混合15min。

d) 将已混合好的试样放入超声波水浴器中（超声波的水平面与试样液面平齐，试样瓶应放在超声波振源处），共超声20min（10min 时停止，猛烈摇动试样瓶1 min，然后再超声10min）。

e)超声之后，再次用磁力搅拌混合60min.2.2样品的稀释a）向无菌试管分别加入4.5mL稀释液(1000亿6支，2000亿、3000亿、5000亿7支)。

b)吸取0.5mL已处理好的试样溶液于第1支试管中，再从第1支试管吸取0.5mL试样溶液于第2支试管，依此进行到倒数第二支试管(每次加液后,需混合均匀，再进行下一次操作)。

c) 将已混好的倒数第二支试管放入70℃水浴锅中水浴30min。

冷却至室温后准确吸取0.5mL该试管试样溶液于最后一支试管，混匀、备用。

每次操作必须使用无菌枪头，枪头不可重复使用。

2.3 涂平板及培养从最后一支试管中准确移取0.1 mL的试样到每个营养琼脂平板中（共4个平板），各平板均标记上分析号、日期、稀释度。

使用1支涂棒，将已放在平板中的试样扩展开（从中心往外移，成辐射状扩展）；在扩展完4个试样平板后，涂棒在1个空白营养琼脂平板上进行涂布（保证涂棒上沾附的活芽胞数也能进行培养、计数）。

芽孢杆菌的检测方法韩雪;张兰威【摘要】内生芽孢是目前所知的最具抗性的生命活体结构.它对许多处理(包括热、紫外线)都有很强的抗性,这与它的特殊结构有关.这种特性使其能经巴氏杀菌而残存于乳中,因此把芽孢数及耐热芽孢数、嗜冷菌作为原料奶检验项目之一,能较全面地评判原料奶的质量.根据芽孢的特性,本文对目前芽孢检测的各种方法进行了综述,以期为芽孢的快速检测提供依据.【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2007(028)001【总页数】4页(P347-350)【关键词】芽孢;原料乳;检测;2,6-吡啶二羧酸【作者】韩雪;张兰威【作者单位】东北农业大学食品学院,黑龙江,哈尔滨,150030;哈尔滨工业大学食品科学与遗传工程研究院,黑龙江,哈尔滨,150086【正文语种】中文【中图分类】工业技术347※专题论述食品科学2007, Vol.28, No.01[51]ANDREWS L S, PARK D L, CHEN Y P.Low temperature pasteuriza- tiontoreducetheriskofVibrioinfectionsfromrawshell-stockoysters[J].FoodAdditives andContaminants, 2000,19(7): 787.[52]CALIK H,MORRISSEY M T, RENO P, et al.Effect of high-pressure processing onVibrioparahaemoly ticusstrainsin pureculture and芽孢杆菌的检测方法韩雪1，张兰威2,*(1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030 ；2.哈尔滨工业大学食品科学与遗传工程研究院，黑龙江哈尔滨150086)摘要：内生芽孢是目前所知的最具抗性的生命活体结构。

它对许多处理(包括热、紫外线)都有很强的抗性，这与它的特殊结构有关。

侧孢芽孢杆菌的培养工艺侧孢芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种常见的细菌，被广泛应用于食品工业、农业和医药领域。

在这篇文章中，我们将介绍侧孢芽孢杆菌的培养工艺，包括培养基的选择、培养条件的优化以及培养过程中的注意事项。

一、培养基的选择侧孢芽孢杆菌的培养基种类繁多，可以根据需求选择适合的培养基。

常用的培养基包括营养琼脂培养基、液体培养基和固体培养基等。

其中，营养琼脂培养基是最常用的固体培养基，可提供菌落生长所需的营养物质。

液体培养基则适用于大规模发酵生产。

二、培养条件的优化侧孢芽孢杆菌的生长适宜温度范围为25℃-37℃，最适生长温度为30℃-37℃。

在培养过程中，温度的控制非常重要，过高或过低的温度都会对菌株的生长产生不良影响。

此外，适宜的pH值也是细菌生长的关键因素，侧孢芽孢杆菌的最适pH范围为6.5-7.5。

氧气供应是侧孢芽孢杆菌培养的另一个重要因素。

侧孢芽孢杆菌是一种好氧菌，需要充足的氧气供应才能正常生长和代谢。

因此，在培养过程中要注意提供充足的氧气，可以通过搅拌培养基或使用气体通气等方式来增加氧气供应。

三、培养过程中的注意事项1. 无菌操作：在进行侧孢芽孢杆菌的培养前，必须进行严格的无菌操作，以避免杂菌的污染。

包括培养器具、培养基和试剂等都需要进行高温高压灭菌处理。

2. 营养物质的添加：侧孢芽孢杆菌的培养基中需要添加适量的碳源、氮源和无机盐等营养物质，以满足菌株的生长需求。

通常情况下，可以添加葡萄糖、蛋白胨、磷酸盐等物质。

3. 培养时间的控制：侧孢芽孢杆菌的生长速度较快，通常在24-48小时内即可形成可见的菌落。

在培养过程中，要控制好培养时间，避免菌落过于密集，影响菌株的生长。

4. 培养温度和时间的选择：侧孢芽孢杆菌的培养温度和时间因具体要求而异。

一般来说，30℃下培养24小时是常见的选择，但实际应用中需根据具体情况进行优化。

5. 培养基的保存：为了长期保存侧孢芽孢杆菌，可以将其培养基加入15%-20%的甘油，并在-80℃下冷冻保存。

【主要成分】侧孢芽孢杆菌及其代谢产物、适宜载体（产品以实际发货批次为准）。

【活菌含量】芽孢数≥100×108CFU/g。

【产品特点】1、耐高温：特有的抗高温活菌菌系。

2、常温下生长旺盛：本产品的活菌适应性强，从4℃开始就能生长，15-30℃高速生长繁殖，从而能有效的起到防害治病和增强免疫力的作用。

3、高稳定性：有很强的抵抗力，适应pH3.0-9.8，在高污染环境中保持特性不变。

【在农业上的功效】1、促进植物根系生长，增强根系吸收能力，从而提高作物产量。

2、抑制植物体内外病原菌繁殖，减轻病虫害，降低农药残留。

3、改良疏松土壤，解决土壤板结现象，从而活化土壤，提高肥料利用率。

4、增强植物新陈代谢，促进光合作用和强化叶片保护膜，抵抗病原菌。

5、增强光合作用，提高化肥利用率，降低硝酸盐含量。

6、固化若干重金属，降低植物体内重金属含量。

【种植上用法用量】以100×108CFU/g含量计算，其他产品用量可根据实际含量进行换算。

1、底肥、追施：亩用本品500g-1kg左右与农家肥、化肥或适量细土混匀后底施或追施。

移栽作物也可穴施可沟施。

机械施肥时，将本品与化肥混匀，可随化肥施入土壤中。

或兑水直接喷洒。

2、蘸根或灌根：每亩用本品1kg左右兑水2—3倍，蘸根或灌根于苗根部。

3、苗床上：每标准苗床用本品10—12克与苗床土拌均匀后播种。

4、盆栽花卉：每公斤盆土可用本品0.5—0.75克。

【注意事项】使用时不要与消毒及抗菌药物一起使用。

【贮藏条件】存放阴凉、通风、干燥处。

【保质期】室温保藏，24个月。

【包装规格】500g/袋，1kg/袋，25kg/袋。

可根据客户要求定制。