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胎盘间充质干细胞的分离，原代与继代培养及鉴定刘亭2016.7。
21目录前言 (2)1分离制备PMSC组织的选取 (4)2脐带，胎盘MSC的分离与纯化 (6)2.1胎盘组织的获取，存储与清洗 (6)2-2 脐带，胎盘MSC的分离及纯化方法 (7)3 原代培养和继代培养 (11)3—1培养基 (11)3-2培养密度 (12)3-3培养条件 (13)3—4换液 (13)3—5 传代培养 (13)3—6细胞形态与生长速度 (14)3—7 MSC的冻存与复苏： (14)4细胞表面抗原检测 (14)5生长曲线 (15)6细胞周期 (15)7分化潜能 (15)参考文献 (15)附件1不同实验室从脐带血,脐带和胎盘等各组织中分离MSC的方法.. 16脐带血 (16)脐带 (17)羊膜 (19)绒毛膜 (19)蜕膜层 (20)胎盘 (21)整体灌注法 (22)附件2 背景知识 (22)附件3 PMSC实验所需试剂 (23)前言干细胞（Stem cell，SC）是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系的细胞。
在一定的条件下，干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。
按照来源和分化潜能不同，干细胞可分为胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞(Adult stem cell，ASC）两类。
胚胎干细胞来源于早期的胚泡和胚胎内层的细胞群，并且具有向3个胚层细胞分化的能力.但是胚胎干细胞应用时产生的免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及的伦理问题等影响并制约了临床应用。
成体干细胞形成于原肠胚形成后的胎儿和成体组织,早期研究认为，成体干细胞主要分化为其来源组织的细胞类型。
然而，近几年来的很多研究表明，成体干细胞具有能够分化成为除来源以外的其他胚层组织的能力。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cell， MSC）又称为基质干细胞，是属于成体干细胞的一种，最早从骨髓中分离而来。
人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达目的：系统研究人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）体外成骨诱导分化过程中成骨相关基因的表达变化。
方法：应用密度梯度离心法分离hBMSCs，取第2代细胞通过流式检测及多向诱导分化方法进行干细胞鉴定；应用RT-PCR法对hBMSCs在体外成骨诱导不同时间点的成骨相关基因表达进行检测。
结果：第2代hBMSCs表达间充质干细胞表面标志CD44、CD90，具有成脂和成骨分化潜能。
成骨相关基因在诱导早期部分表达，中期均有表达，基因表达大部分在14天达高峰，与矿化相关的基因表达在21天达高峰。
结论：hBMSCs体外成骨诱导过程中成骨相关基因呈动态表达，其表达时序与成骨细胞生理发育基本相似。
Abstracts:ObjectiveTo investigate the osteogenic related genes expression during in vitro osteogenic differentiation of human bone mesenchymal stem cells (hBMSCs).MethodshBMSCs were isolated by density gradient centrifugation. Surface markers and cell cycle were analyzed by flow cytometry. The multiple differentiation potential of hBMSCs were identified using in vitro osteogenic and adipogenic induction. The osteogenic related genes expression of hBMSCs at different induction time point were evaluated by semiquantitative RT-PCR analysis.ResultsThe hBMSCs were derived from bone marrow and expressed CD44 and CD90, markers of mesenchymal stem cell. The second passage of hBMSCs showed adipogenic and osteogenic differentiation potential. During the osteogenic induction process,hBMSCs expressed part of osteogenic related genes in early stage, and all of them in middle stage.The peak expression of most of genes were on the 14th day, and the mineralization associated genes on the 21st day. ConclusionsThe osteogenic related gene expression of hBMSCs shows a dynamic progress during in vitro osteogenic induction, which is consistent with in vivo development of osteoblast.Key words:hBMSCs;in vitro differentiation;osteogenic genes;expression pattern骨缺损的修补和重建是修复重建外科临床面临的常见问题。
中国组织工程研究 第18卷 第37期 2014–09–03出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research September 3, 2014 Vol.18, No.37ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH5955www.CRTER.org张娟，女，1988年生，河北省玉田县人，汉族，内蒙古医科大学免疫学在读硕士，医师，主要从事干细胞的基础与临床应用研究。
通讯作者：王彩生，硕士，主任医师，内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010110；呼和浩特市第二医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010031并列通讯作者：魏来，博士，教授，北京大学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京市 100044doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.37.009 []中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)37-05955-06 稿件接受：2014-07-31Zhang Juan, Studying for master’s degree, Physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, ChinaCorresponding author: Wang Cai-sheng, Master, Chief physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China; the Second Hospital of Hohhot City, Hohhot 010031, Inner Mongolia Autonomous Region, ChinaCorresponding author: Wei Lai, M.D., Professor, Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases, Beijing 100044, ChinaAccepted: 2014-07-31人脐血间充质干细胞来源的外泌体：分离鉴定及生物学特性张 娟1，刘 峰2，张 薇2，丛 旭2，王彩生1，3，魏 来2(1内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010110；2北京大学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京市 100044；3呼和浩特市第二医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010031)文章亮点：1 研究发现间充质干细胞是通过旁分泌有效生物学活性物质外泌体在细胞间进行信息传递，进而通过某种机制发挥组织损伤修复作用。
临床研究用人间充质干细胞质量评价一、引言人间充质干细胞（MSCs）由于其多向分化潜能、免疫调节特性以及易于体外培养等特点，被广泛用于临床研究。
在众多疾病的治疗中，MSCs 都展现出了巨大的潜力。
然而，要确保其在临床研究中的有效性，首先需要对MSCs的质量进行严格控制和评价。
本文将探讨如何评价临床研究用MSCs的质量。
二、MSCs的质量评价标准1、细胞的纯度和活性：这是MSCs质量评价的核心指标。
纯度是指MSCs中目标细胞的比例，而活性则是指MSCs的增殖能力和分化能力。
2、细胞的遗传稳定性：通过基因测序等方法，可以检测MSCs是否存在基因突变，以及是否存在潜在的致癌风险。
3、细胞的免疫调节特性：MSCs具有免疫调节特性，可以通过抑制免疫反应来降低排斥反应的风险。
因此，评价MSCs的免疫调节特性也是非常重要的。
4、细胞的来源和生产过程：MSCs的来源和生产过程也会对其质量产生影响。
例如，来自患者的自身MSCs可能比来自捐献者的MSCs更适合用于治疗。
同时，生产过程中的质量控制，如无菌操作、细胞培养基的质量等，也会影响MSCs的质量。
三、MSCs质量评价的方法1、细胞形态观察：通过观察MSCs的形态，可以初步判断其是否具有正常的形态学特征。
2、生长曲线测定：通过绘制MSCs的生长曲线，可以评估其增殖能力。
3、细胞表面标志物检测：通过检测细胞表面标志物，可以确定MSCs 的纯度和活性。
4、染色体核型分析：通过染色体核型分析，可以评估MSCs的遗传稳定性。
5、免疫调节特性检测：通过检测MSCs对免疫反应的调节作用，可以评估其免疫调节特性。
6、生产过程质量控制：通过监控生产过程中的关键控制点，可以确保MSCs的生产过程符合质量标准。
四、结论人间充质干细胞（MSCs）在临床研究中的应用前景广阔，但其质量评价是关键环节。
通过对MSCs的纯度、活性、遗传稳定性、免疫调节特性以及生产过程的质量控制等多方面的评价，可以确保其满足临床研究的需求。
骨髓间充质干细胞研究与应用概况于雷;高俊玲【摘要】骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal cells,BMSCs)是当下热点研究对象之一。
1867年德国病理学家Cohnheim教授[1]在研究创口愈合过程中发现骨髓中存在一种非造血系统的多潜能细胞,但研究因为条件原因未能深入。
后来有研究者[2]在20世纪60年代开展一系列开创性研究,发现从骨髓中分离得到长梭状、成纤维细胞样的细胞群,在塑料培养皿中呈集落样贴壁生长;1987年,又发现这种骨髓单核细胞可在一定的条件下分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。
培养增殖二十代后仍保有其多向分化的潜能。
于是把这种多能细胞称为间充质干细胞(mesenchyma stem cell,MSC)。
【期刊名称】《华北理工大学学报：医学版》【年(卷),期】2018(020)002【总页数】5页(P164-168)【关键词】骨髓间充质干细胞;肺纤维化;缺血性脑卒中【作者】于雷;高俊玲【作者单位】[1]华北理工大学基础医学院,河北唐山063000;[1]华北理工大学基础医学院,河北唐山063000;【正文语种】中文【中图分类】R329.2骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal cells，BMSCs)是当下热点研究对象之一。
1867年德国病理学家Cohnheim教授[1]在研究创口愈合过程中发现骨髓中存在一种非造血系统的多潜能细胞，但研究因为条件原因未能深入。
后来有研究者[2]在20世纪60年代开展一系列开创性研究，发现从骨髓中分离得到长梭状、成纤维细胞样的细胞群，在塑料培养皿中呈集落样贴壁生长；1987年，又发现这种骨髓单核细胞可在一定的条件下分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。
培养增殖二十代后仍保有其多向分化的潜能。
于是把这种多能细胞称为间充质干细胞(mesenchyma stem cell，MSC)。
万方数据
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人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的分离、体外培养及诱导分化
作者：丛姗， 宋瑾， 张惠娟， 李岩， 白立恒， 曹贵方， CONG Shan， SONG Jin， ZHANG Hui-Juan， LI Yan， BAI Li-Heng， CAO Gui-Fang
作者单位：丛姗,宋瑾,张惠娟,李岩,曹贵方,CONG Shan,SONG Jin,ZHANG Hui-Juan,LI Yan,CAO Gui-Fang(内蒙古农业大学兽医学院/动物组织胚胎学与发育生物学实验室,呼和浩特,010018)， 白立恒,BAI Li-Heng(内蒙古
妇幼保健医院妇产科,呼和浩特,010020)
刊名：
农业生物技术学报
英文刊名：Journal of Agricultural Biotechnology
年，卷(期)：2015,23(1)
引用本文格式：丛姗.宋瑾.张惠娟.李岩.白立恒.曹贵方.CONG Shan.SONG Jin.ZHANG Hui-Juan.LI Yan.BAI Li-Heng.CAO Gui-Fang 人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的分离、体外培养及诱导分化[期刊论文]-农业生物技术学报 2015(1)。
临床研究用人间充质干细胞质量评价规范（讨论稿）前言人间充质干细胞(human MSCs, hMSCs)是一类具有一定的自我复制更新和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于胎儿和成人各组织中，如骨髓、脂肪、皮肤、牙髓、肌腱，以及新生儿附属组织，如脐带、胎盘、羊膜等等组织。
除一定程度的分化潜能外，hMSCs还具有独特的免疫调控和组织再生功能，参与调控异常免疫反应、维护免疫平衡，帮助机体形成有利于病损组织细胞修复或再生的微环境，以促进损伤组织细胞的修复或再生。
hMSCs独特的生物学功能决定了其应具有广泛的临床适应症，并使其成为近十年来细胞治疗领域中发展最为广泛、最为迅速的干细胞类型。
过去10年来所积累的大量临床前及临床研究数据显示，不同组织来源的hMSCs均具有不同程度，针对不同临床适应症的治疗效果。
目前在登记的各种自体或异体组织来源的hMSCs临床适应症类型或疾病亚型已有上百种，其中常见的临床适应症类型包括骨关节疾病、心血管疾病、器官功能衰竭、神经退行性疾病、移植物抗宿主病、多发性硬化、脊髓损伤、炎性结肠炎、脊髓侧索硬化、系统性红斑狼疮，等等。
然而，无论是临床前或临床研究阶段，现有的研究结果仍都存在不同程度的问题，而所有问题又都不同程度地汇聚到hMSCs的质量问题上。
其中临床前研究所表现的问题是，不同研发者所使用的hMSCs来源、培养体系、制备工艺、质量标准、评价技术等存在很大差异，也存在质量评价内容和技术的合理性等问题，因此导致不同研究者间的研究结果很难具有可比性，或结果难以重复，因此也很难形成相对统一的质量标准。
而临床研究中所存在的问题是，绝大多数临床研究还处在早期阶段，所观察的病例数还很有限，临床研究中细胞质量的标准化和细胞使用的规范性仍存在巨大差异，所有这些尚不足以完全支持hMSCs的安全性和/或疗效。
除此以外，因hMSCs临床前研究还远不够完善，对其临床研究的指导作用还不强，或者临床前研究与临床研究存在严重脱节现象，临床研究阶段细胞质量的稳定性研究欠缺，细胞质量评价和受试者评估体系尚未建立，等等。
农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2008,16(3):443~449*基金项目： 国家自然科学基金 （No.30671067） 、 教育部重点项目 （No.03160） 和陕西省科技发展项目 （No.2006KZ05G1） 资助。
**通讯作者。
Author for correspondence.教授， 博导， 主要从事哺乳动物干细胞工程技术研究。
Tel:02987080068; Email:<douzhongying@>. 收稿日期：20070625 接受日期： 20071024 ·研究论文· 人胎儿骨髓间充质干细胞分离培养与生物学特性 *张翊华 1, 窦忠英 1 **, 沈文正 1,2 , 杨春荣 1 , 高志敏 1 （1.西北农林科技大学国家干细胞工程技术研究中心陕西省分中心， 杨凌 712100;2.杨凌职业技术学院动物工程系，杨凌 712100） 摘要： 人胎儿骨髓间充质干细胞 （BMMSCs ） 的群体倍增次数 （70～80次） 是成体 BMMSCs (30～40 次） 的 2 倍， 分化能力 优于成体干细胞。
研究采取纵向剪开骨髓腔涮洗细胞法和全骨髓培养法分离2～3月龄流产胎儿 BMMSCs ， 四甲基偶氮唑盐比 色法 （MTT 法） 筛选基础培养液和血清浓度并制作生长曲线， 流式细胞仪和免疫组织化学法鉴定细胞抗原标志， 并通过核型分 析和成瘤实验评估细胞的安全性。
结果表明， 沿长轴剪开骨髓腔涮洗细胞法是获得 2～3月龄人流产胎儿四肢长骨骨髓的实用 方法。
在实验范围内 琢MEM(minimum essential medium alpha medium)+20%FCS(fetal cattle serum)是体外培养 2～3月龄流产 胎儿BMMSCs 的最佳体系。
分离的第 3代BMMSCs 除表达成体BMMSCs 表面抗原标志外还表达Oct4、 SSEA3和SSEA4， 第 6、 12和 24代细胞在对数增长期的群体倍增时间分别为 34、 36和40h ， 且均为二倍体核型、 不成瘤。
这证明 2～3月龄人流产胎 儿BMMSCs 可以成为人类组织工程和再生医学研究理想的种子细胞。
关键词： 人胎儿； 骨髓间充质干细胞； 分离培养；生物学特性 中图分类号: S188 文献标识码:A 文章编号:10061304(2008)03044307Isolation and Culture of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells fromHuman Fetus and Its Biological PropertiesZ ＨANG Yihua 1 ,DOU Zhongying 1**,SHEN Wenzheng 1,2 ,YANG Chunrong 1 ,GAO Zhimin1The population doubling number (70～80times)of human fetal bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs)isabout two times more than that (30～40times)of the adult BMMSCs,and their differentiation capacity is superior to that of their adult counterparts.In this study,BMMSCs were isolated from 2to 3monthold human abortuses by scissoring their long bones lengthwise, followed by rinsing and culturing whole marrow cells.Basic medium and serum concentration for BMMSCs culture were optimized and growth curves made,both with MTT(3(4,5)dimethylthiahiazo (zy1)3,5diphenytetrazoliumromide)reduction assay.Isolated cells were identified with flowcytometry and immunocytochemistry for their antigen markers.The biosafety of isolated cells was eval uated by karyotype analysis and tumor forming experiment.The results indicated that lengthwise scissoring of fetal long bones and rinsing of their marrow cells was practical and useful to obtain the BMMSCs from human abortuses at the age of 2～3months.In this experiment, 琢MEM(minimum essential medium alpha medium)+20%FCS(fetal cattle serum)was the best system for the BMMSCs .The third passage BMMSCs expressed Oct4,SSEA3and SSEA4beside the surface markers of their adult counterparts.The population doubling time of the BMMSCs of passage 6,12and 24were 34,36and 40h,respectively.The cells in all the passages showed diploid karyotype and formed no tumor in the nude mice.The BMMSCs of human abortuses at the age of 2～3months were proved to be biologically safe and ideal seed cells for researches on human tissue engineering and regenerationmedicine.human fetus;bone marrow mesenchymal stem cell;isolation and culture;biological properties农 业 生 物 技 术 学 报 2008年组织工程和再生医学研究是目前医学研究领域 中的亮点，种子细胞生物学特性研究是亮点中的重 点。
尽管成体骨髓间充质干细胞 （BMMSCs） 具有多 项分化潜能，是目前组织工程和再生医学研究中应 用最广的种子细胞之一，但越来越多的资料显示， BMMSCs的自我更新和分化能力与其供体的年龄 紧密相关， 随着供体月龄 （胎儿） 或年龄 （成体） 的增 加 BMMSCs的多能性和自我更新能力逐渐减退 （Stenderup .,2003;Guillot .,2006）。
研究证 明， 成体 BMMSCs体外培养时群体倍增数只能达到 30～40次，是胎儿 BMMSCs（70～80次）的一半 （Banfi .,2000;Cesare .,2001）。
胎儿 BMM SCs的生物学特性介于胚胎干细胞和成体干细胞之 间， 尤其是前 3月龄胎儿 BMMSCs， 接近胚胎干细 胞， 端粒酶活性高， 生长速度快， 分化能力强 （Pascale .,2007）， 具有更好的应用前景。
本研究旨在建立 ２～３月龄流产胎儿 BMMSCs体外分离方法,筛 选其体外培养体系，为体外诱导分化和组织工程研 究扩增和贮备种子细胞。
1材料和方法1.1 材料２~３月龄流产胎儿 (陕西省某医院)， IgG、 CD29、 CD44、 CD105、 CD166、 CD11a、 CD14、 CD34、 CD45和 CD71荧光标记抗体 （美国贝克曼公司）， 其 中 IgG（对照）、 CD11a、 CD29、 CD44和 CD71为异硫 氰酸荧光素 （FITC） 标记， IgG（对照）、 CD105、 CD166、 CD14、 CD34和 CD45为藻红蛋白（PE） 标 记， 胎牛血清 （FCS）、 minimum essential medium al pha medium（琢 MEM）和 低糖 dulbecco's modified eagle's medium（LGDMEM） 培养液 （美国 Gibco公 司）， 通用型 SP检测试剂盒和 DAB显色剂 （北京中 杉金桥生物技术有限公司）， Oct4、 SSEA3和 SSEA4抗体（美国 Sigma公司），四甲基偶氮唑盐（美国 Amresco公司）， CellTracker CMDil（美国 Molecular Probes公司）。
1.2 方法1.2.1 2~3月龄流产胎儿 BMMSCs体外分离 将 新鲜流产胎儿在 70%酒精溶液中浸泡 30min进行 体表消毒， 在超净工作台上取出四肢长骨， 剪除骨外 软组织， 用加青、 链霉素的 PBS液冲洗外表面， 然后 剪去两端软骨， 沿长轴剪开骨髓腔， 置于含青、 链霉 素的 琢 MEM培养液中涮洗， 然后弃去骨屑， 将涮洗 液用 200目尼龙纱网过滤， 1500r/min， 离心 5min， 弃上清， 将沉淀细胞用加 10%FCS、 100IU/mL青霉 素、 100滋 g/mL链霉素和 0.1mmol/L茁 巯基乙醇的 琢 MEM完全培养液重新悬浮，在塑料培养皿中进 行全骨髓培养，每隔 2d换液 1次，逐渐除去血细 胞，待小梭形细胞逐渐长成单层并达到 80%融合 时，用 0.4g/L乙二胺四乙酸和 2.5g/L胰蛋白酶消 化， 按 1颐 3进行传代培养。
