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统上喜树碱提取多采用代技术提取喜树碱，与常规溶剂提取法相比，其提取效率高，操作简便，但一次性投入成本高。
本研究以甲醇为提取溶剂，利用正交实验法优化了喜树碱回流法提取工艺。
高效液相色谱系统喜树碱含量的喜树叶回流法提取工正交实验。
在单因素实验基础上，选择甲醇浓度、提取时间、提取温度、料液比为考察因素，以喜树碱的提取率为考察指标，利用SPSS 统计软件建立L 因素甲醇浓度（%）A 料液比（℃）D 空白E 155501265602375703485804正交结果与方差分析B C D 1112223334441232143414321342433124211422313244130.3210.3470.3450.3760.3510.3700.3690.3630.3930.3620.3670.3200.0540.0190.0740.017比R A 提取温度为70℃。
离差平方和自由度均方F 值P A 0.0309030.0103034.35780< 0.01B 0.0071230.002377.91799<0.1C 0.0010430.00035 1.15791>0.1D 0.0121630.0040513.52544<0.05E 0.00030从提取温度为70℃。
在该工艺条件下平行提取5次，喜树碱提取率为0.490±0.004‰，结果表明优化条件下工艺稳定性较好。
该研究利用正交实验法进行多因素分析，优化了喜树碱的甲醇回流法提取工艺，明确了最佳工艺条件甲醇浓度为65%，提取时间1h，料液比为1:10，提取温度为70℃，该工艺条件下，喜树碱的提取方法简便、提取率稳定，为喜树碱的进一步研究提供依据。
正交试验法优化喜树叶马云超70~90%乙醇渗漉，耗时长，操作繁琐。
另有文献报道超声波和超临界流体等现仪器与材料：LC-6A，日本岛津公司；电子分析天平：AUY220型，日本岛津公司；恒温水浴锅：DK-S14型，上海森信实验仪器有限公司；电热恒温干燥箱：DGG-9240B 型，上海森信实验仪器有限公司；旋转蒸发仪：RE-52AA 型，上海亚荣生化仪器厂。
喜树论文：喜树喜树碱营养元素提取纯化【中文摘要】为了满足人们对抗癌药物喜树碱的需求,本文研究了外源营养元素对一年生喜树幼苗喜树碱含量的影响,一年生幼苗中喜树碱含量的动态变化以及幼苗中喜树碱的提取纯化工艺,结果如下：通过对喜树碱含量测定方法的研究,得到以下结论：1、建立了RP-HPLC法分析条件：色谱柱为phenomenex Luna C18(2)色谱柱(4.6 mm×250mm,5μm),流动相为乙腈-水(30：70)；流速1ml/min;检测波长254 nm；柱温40℃；进样量20μL。
该色谱条件下,喜树碱保留时间适中,峰形良好,与杂质分离较好。
2、供试品溶液的制备方法如下：取喜树样品粉末约1.0g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50ml,称定重量。
于50℃超声提取1h,冷却至室温,称定重量,用甲醇补足减失重量,摇匀,0.45μm滤膜过滤,续滤液作为供试品溶液。
通过对一年生喜树幼苗生物量变化及喜树碱积累的研究,得到以下结论：1、一年生喜树幼苗在7-10月生长较快,叶、茎、根的干物质量迅速增加。
不同月份喜树叶中喜树碱含量成一条单峰曲线,以8月中旬叶中含量最高。
不同月份喜树茎和根中喜树碱含量类似成一条正弦曲线,喜树碱含量的极大值在8月中旬,极小值在10月中旬。
2、在6-11月期间,喜树幼苗整株及根、茎的喜树碱总量持续增加。
叶中喜树碱总量成一条单峰曲线,以10月中旬叶中喜树碱总量最高。
喜树整株和叶中喜树碱总量在7-10月增长较快,茎中喜树碱总量在7-11月增长较快。
通过对外源营养元素对喜树幼苗生长及喜树碱积累影响的研究,得到以下结论：1、氮元素对喜树幼苗生长及喜树碱积累的影响：1)氮元素能促进喜树幼苗的生长,但当施氮量大于0.95g/株时,茎和根的生物量增加不显著,仅喜树叶片显著增加。
不同施氮水平下,喜树幼苗各器官喜树碱含量成一条单峰曲线,各器官中喜树碱含量在施氮量为1.90g/株时最高。
喜树碱含量的测定方法研究方旭东;陈绍宇【摘要】本文介绍了喜树碱含量的分析测定方法.样品采用了乙醇超声提取法从喜树叶中提取喜树碱,并用薄层层析法和高效液相色谱法分析测定喜树碱的含量.薄层层析法测定喜树碱的含量使用硅胶G做固定相,v(氯仿)∶v(丙酮)=70∶30、v(甲醇)∶v(氯仿)=10∶90做展开剂.高效液相色谱法用v(甲醇)∶v(水)=55∶45做流动相,并且流动相流速为1.0ml/min.在波长为254 nm,温度为25℃下检测.每次进样量为5μL.【期刊名称】《天津化工》【年(卷),期】2011(025)002【总页数】4页(P46-49)【关键词】喜树碱;高效液相色谱;薄层层析;分析测定方法【作者】方旭东;陈绍宇【作者单位】天津渤海职业技术学院,天津,300402;广西钦州市水利电力勘测设计院,广西,钦州,535000【正文语种】中文【中图分类】TQ450.7目前，农药残留、害虫抗药性以及作物药害等农药产生的副作用，是我们需解决的问题之一。
生物农药采用天然产物，对人类、环境和作物是低毒、无毒且残留时间较短的。
喜树碱是一种具有生物活性可广泛应用于生物农药的物质，本文利用薄层层析（TLC）法和高效液相色谱（HPLC）法对喜树叶中提取的喜树碱含量进行了分析与测定。
该法简便、快捷、准确性高，为将来该领域研究提供了可靠的依据。
高效液相仪、紫外光检测器、色谱工作站、超声波细胞粉碎机、高速离心机、电子天平。
甲醇，95%乙醇，无水乙醇，丙酮，氯仿，硅胶G（薄板层析用）。
喜树叶于2010年8月采自钦州市水利局喜树园栽培3年生的喜树幼苗，采集喜树嫩叶（顶芽，顶芽以下1～2片叶）。
用天平称取采得的喜树叶约1000 g，并用自来水将其洗净后置于恒温干燥箱内，调整恒温干燥箱温度至40℃烘干24 h,直到材料发脆，再用60目的DWF-TOOA 型粉碎机粉碎，将粉碎好的喜树叶装入密封袋后将其置于4℃冰箱中避光保存，待用。
液相色谱法测定羟基喜树碱含量及药动学研究
孔令媛;马骏
【期刊名称】《药学实践杂志》
【年(卷),期】2007(25)6
【摘要】目的:建立一个简单、快速、灵敏的柱切换高效液相色谱法测定人血清中10-羟基喜树碱(HCPT)含量.方法:生物样品首先在装有限进介质(RAM)填料的预柱中净化和富集,然后转移到C18分析柱分析待测物,用荧光法检测.结果:整个分析时间8 min.在1～1 000 ng/mL浓度范围内,HCPT显良好的线性关系,日内、日间变异小于5%,最低检测限为0.1 ng/mL.结论:本法已应用于临床病人注射HCPT后的药代动力学研究,结果符合一房室模型并计算出它的药动学参数.
【总页数】3页(P379-381)
【作者】孔令媛;马骏
【作者单位】中国人民解放军第451医院药剂科,陕西,西安,710054;兰州军区兰州总医院药剂科,甘肃,兰州,730050
【正文语种】中文
【中图分类】R917
【相关文献】
1.HPLC法测定并比较喜树果、马比木中10-羟基喜树碱含量 [J], 苏爱雪;周翔;罗娅君;边清泉
2.改变检测波长高效液相色谱法测定喜树碱和羟基喜树碱的含量 [J], 祖元刚;赵春
建;付玉杰;李庆勇;李春英
3.高效液相色谱法测定羟基喜树碱及喜树碱含量 [J], 马锦星;孙仲葆;彭才勤;马烈
4.限进介质作为柱切换填料的高效液相色谱法测定人血中羟基喜树碱含量及其药动学研究 [J], 马骏;贾正平;张强;王荣;樊俊杰
5.高效液相色谱法测定羟基喜树碱含量方法的研究 [J], 马梅芳;于涛;等
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改变检测波长高效液相色谱法测定喜树碱和羟基喜树碱的含量祖元刚3 赵春建 付玉杰 李庆勇 李春英(东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室,哈尔滨150040)摘 要 建立了改变检测波长测定喜树种子中喜树碱和102羟基喜树碱的高效液相色谱法。
使用TechspheseODS C 18(4.6mm ×25cm ,5μm )色谱柱,以水∶乙腈=3∶7(V /V )为流动相,流速为1.0mL/min ,25℃下检测。
检测波长:0～8min 时为266nm ,8～20min 时为254nm 。
结果表明:喜树碱的平均回收率为100.92%,RSD 值1.40%;羟基喜树碱的平均回收率为100.09%,RSD 值1.34%。
此方法简单、可靠。
关键词 喜树碱,羟基喜树碱,高效液相色谱 2003210207收稿;2004203231接受本文系国家“973”项目(No.G 199901160)和科技部中德政府间合作项目(No.CHN03/028)1 引 言喜树碱(camptothecin ,CPT )和羟基喜树碱(hydroxycamptothecin ,HCPT )是从喜树(Cam ptothecaacum i nata decne )中提取得到的具有显著抗肿瘤活性的生物碱,是迄今为止发现的唯一专门通过抑制拓扑异构酶发挥细胞毒性的一类天然植物活性成分[1]。
喜树碱或羟基喜树碱的含量测定方法已有文献[2～5]报道,本实验通过改变HPLC 的检测波长分别测定喜树碱和羟基喜树碱,提高了分析灵敏度,并以反相高效液相色谱法测定了喜树种子中的喜树碱和羟基喜树碱的含量,对用于分析的样品制备方法进行了探讨。
结果表明:该方法简单、快速、灵敏,可以用于喜树种子中喜树碱和羟基喜树碱的精确分析,为喜树标准化G AP 种植和GMP 生产提供了质量保证手段。
2 实验部分2.1 仪器、试剂与材料高效液相色谱仪(日本Jasco 公司);UV 21575型紫外检测器(日本Jasco 公司);BS 210S 型分析天平(北京赛多利斯天平有限公司);Biochrom 4060型紫外分光光度计(瑞典Pharmacia 公司);KQ 2250DB 型超声波清洗仪(昆山市超声波仪器有限责任公司)。
加入一定量对照品,按供试品测定方法测定,并计算回收率,测得墨沙酮的加样回收率为9819%,RSD为211%(n=6)。
4 供试品的测定考查了供试品溶液的制备方法。
以甲醇为溶剂,分别采用浸泡20h,回流提取4h和超声振荡提取1h等3种方法制备供试液。
结果表明,浸泡20h浸出量明显低于其他两种方法,而回流提取液中杂质较多。
对超声提取时间也进行了考查。
对照品溶液:精密称取墨沙酮对照品适量,加甲醇定量稀释制成每毫升中约含0115mg的溶液,作为对照品溶液。
供试品溶液:精密称取生等药材细粉(过60目筛)约015g,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50ml后,称重,浸泡2h后,超声振荡提取1h,放冷,补足重量,过滤,取续滤液备用。
准确量取对照品溶液2,4,6,8,10μl和供试品溶液适量进样,按外标法计算含量。
测得生等药材中墨沙酮的含量为1102%,RSD为0152%(n=3)。
5 参考文献1 中国科学院西北高原生物研究所.藏药志.西宁:青海人 民出版社,1991:4052 藏药标准.西宁:青海人民出版社,1979:331996—03—26收稿反相高效液相色谱法测定喜树果实中喜树碱的含量张丽艳 杨玉琴(贵州省中医研究所 贵阳550002) 摘要 采用YWG2C18柱,甲醇2水(6∶4)流动相,254nm检测,测定了喜树果实中喜树碱的含量,平均回收率为98167%,RSD为1171%(n=5),并对不同月份采收的喜树果实进行了测定。
关键词 高效液相色谱法 喜树碱 喜树果系珙桐科植物喜树的果实。
喜树碱为其主要活性成分,临床用于治疗消化系统恶性肿瘤[1]。
目前广西、上海药品标准采用紫外分光光度法测定喜树碱含量。
本文用反相HPLC测定喜树碱,其结果对于药材质量评价及指导工业生产具有参考作用。
1 实验部分111 仪器与试药日本岛津LC25A高效液相色谱仪,C2 R2AX数据处理机,SPD22AM紫外检测器。
喜树碱对照品(中国科学院昆明植物研究所提供)为分析纯。
第21卷第2期分析测试学报VoI.21No.22002年3月FENXI CESHI XUEBAO(JournaI of InstrumentaI AnaIysis)Mar.2002喜树叶中喜树碱含量的高效液相色谱分析阎秀峰，王洋，于涛，张玉红，殷丽君（东北林业大学森林植物生态学开放研究实验室，黑龙江哈尔滨150040）摘要：建立了一种简便、快速、准确的喜树叶片中喜树碱含量的高效液相色谱分析方法；采用英国HPLC TechnoIogy公司的Techsphere ODS柱（25cm X4.6mm ID，5!m），流动相乙腈-水（体积比416），流速1.0 mL·min-1，检测波长254nm，柱温25C，进样量10!L；样品制备方法以61!（!）乙醇为溶剂，50C下超声提取喜树叶粉10min；HPLC法测定喜树碱的含量；该法的RSD为2.5!（I=6），平均回收率为96!。
关键词：高效液相色谱法；喜树；叶片；喜树碱中图分类号：@946.88；@949.761.8文献标识码：A文章编号：1004-4957(2002)02-0015-03喜树碱（camptothecin，CPT）是我国特有树种喜树（Camptotheca acumiIata Decne.，珙桐科）中所含的一种生物碱[1]，具有显著的抗肿瘤活性，其抗癌机理独特，是迄今为止发现的唯一专门通过抑制拓扑异构酶"发挥细胞毒性的天然植物活性成分[2]，目前已有TPT、CPT-11等喜树碱类药物（喜树碱衍生物）获得美国FDA批准用于临床治疗癌症。
喜树中的喜树碱含量很低，一般仅为0.01!~0.1!，很多研究工作集中在探求高喜树碱含量的喜树原料上[3,4]，但对喜树碱含量的测定方法尤其是供试样品的制备方法则很少深入探讨。
已有的喜树碱含量测定方法中均以甲醇或乙醇浸提数次的方法来提取喜树碱[3~5]，提取时间长，且不易提取完全。
本文系统地探讨了高效液相色谱法测定喜树叶中喜树碱含量的样品制备方法，提出了将原料保存于提取液体系中一次超声提取以获得待分析样品的技术路线，建立了一种简单、快速、可靠的喜树碱含量分析方法。
1实验部分1.1仪器与试剂JASCO高效液相色谱仪，1580泵，1575型紫外检测器，Version6.1色谱工作站。
喜树碱标准品由美国The StehIin Foundation for Cancer Research提供，纯度99.0!；用于探讨样品制备方法的喜树叶采自东北林业大学实验林场栽培的3年生喜树幼树，用于分析的喜树叶样品采集自我国各喜树产地。
1.2色谱条件英国HPLC TechnoIogy公司的Techsphere ODS柱（25cm X4.6mm ID，5!m），流动相为乙腈-水（体积比416），流速1.0mL·min-1，检测波长254nm，柱温25C，进样量10!L。
1.3标准溶液的配制精密称取喜树碱标准品7.0mg于100mL的容量瓶，以乙腈-水（体积比416）为溶剂超声溶解并定容至刻度，摇匀备用。
1.4样品制备方法精密称取喜树叶粉4g于100mL容量瓶，加入90mL61!（!）的乙醇，50C下超声提取10min，冷却至室温，稀释至刻度。
取1mL提取液，12500g离心10min，吸取上清液10!L进样。
2结果与讨论2.1检测波长的确定以乙腈为空白，在200~400nm对一定含量的喜树碱乙腈溶液的紫外吸收进行扫描，喜树碱在254nm处有强吸收（图1），因此选择254nm作为紫外检测器的检测波长。
2.2流动相的选择分别以不同比例的乙腈-水为流动相进样分析表明，流动相乙腈-水体系在体积比317~41收稿日期：2001-04-19；修回日期：2001-10-25基金项目：国家自然科学基金资助项目（30070086）；黑龙江省留学归国基金资助项目（L00C009）作者简介：阎秀峰（1965-），男，黑龙江肇东人，教授，博士；殷丽君，现为中国农业大学食品学院博士后.图l 喜树碱标准品紫外吸收谱Fig.l UV absorbance curve of CPT standard inacetonitriie图2标准品（A ）和喜树叶样品（B ）色谱图Fig.2Chromatograms of standard (A )and sampie ofieaves of Camptotheca acuminata Decne.(B )l6分析测试学报第2l 卷6之间时喜树碱的保留时间为4.8min ~8.7min ，峰形良好且可保证提取样品的喜树碱与相邻组分良好分离（图2），理论塔板数按喜树碱峰计算不低于3000，喜树碱峰与相邻峰的分离度大于l.5。
为了提高分析速度，本法选择了体积比416的乙腈-水作为流动相。
2.3标准曲线的绘制分别精密吸取喜树碱标准溶液0.l 、0.5、l.0、2.0、5.0、8.0mL 于l0mL 容量瓶中，以乙腈-水（体积比416）为溶剂定容、摇匀。
按照上述的色谱条件，分别取稀释后样品及原标准溶液进样分析。
喜树碱质量浓度（Y /（mg ·L -l ））与峰面积（X ）的线性回归方程为：Y =4.938X l0-4X -0.395l ，r =0.9999，线性范围0.70~70mg ·L -l 。
2.4样品制备方法的确定2.4.1提取溶剂的筛选分别以95!乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿作为溶剂超声提取喜树碱，结果表明，95!乙醇的提取效果最佳。
2.4.2提取方法的比较分别采用3种提取方法制备样品：（l ）称取4g 样品于l00mL 容量瓶中，加入90mL 95!乙醇超声提取30min ，冷却定容，取样离心，进样分析；（2）称取4g 样品于锥形瓶中，30mL 95!乙醇超声提取3次，每次30min ，合并提取液于l00mL容量瓶中，95!乙醇定容至刻度，取样离心，进样分析；（3）称取4g 样品，95!乙醇索氏提取6h ，定容于l00mL 容量瓶，取样离心，进样分析。
经差异显著性分析，3种方法制得的样品分析结果差异不显著，l 法的结果略高于2法及3法。
作者认为，造成这一结果的原因可能是：（l ）在l 法的提取条件下获得的是喜树碱稀溶液，可以达到组织外溶液及组织内液体的浓度平衡，因而尽管未达到一般意义上的“提取完全”，但在此条件下组织内液体也是提取液的一部分，并不影响分析结果；（2）2法在多次反复提取的处理过程中不可避免造成少量损失，而3法则需使提取液较长时间处于较高的温度下，易于造成植物提取样品的变化。
而且，l 法操作简便，尤其是处理大批样品时，更具有2法及3法所无法比拟的优越性，因而本法采用了l 法。
2.4.3最佳提取条件选择乙醇含量、提取时间及提取温度进行3因素l0水平U l0（l03）均匀设计试验，试验条件及结果见表l 。
表l U l0（l03）均匀设计试验条件及结果（偏差值0.l944）Tabie l U l0（l03）experimentai conditions and resuits by uniform design (deviation 0.l944)No Content of aicohoiExtraction temperatureExtraction timeYieid of CPT Fitted vaiueResiduai vaiue!/!"/C t /min R /!!!ll060600.042410.00l 40.04240.000022025l200.042710.00l 30.04270.000l 33050l600.048210.00l 50.0484-0.000244030400.053910.00l 60.05370.000255035200.060810.00l 20.06l 2-0.0004660l52000.052210.00l 30.0523-0.000l 77045l000.059l 10.00l 60.05870.000488020l400.04l 010.00080.04090.000l 99055800.053310.00l 60.0534-0.000l l0l0040l800.024810.00070.0249-0.000l第2期阎秀峰等:喜树叶中喜树碱含量的高效液相色谱分析17表2不同省份喜树叶中喜树碱含量TabIe 2Content of CPT in Ieaves of Camptothecaacuminata Decne.in different provincesNo Province Content of CPT w /!Tender Ieaves Grown Ieaves 1Guizhou (贵州)0.06760.03272Sichuan (四川)0.10680.05133Guangxi (广西)0.16940.05454Yunnan (云南)0.07030.02055Henan (河南)0.09390.0494对试验结果进行逐步回归分析（引入变量F -检验值F 1=0.05，剔除变量F -检验值F 2=0.05），得回归方程：Y =-0.02135185+0.00125135!+0.00163838"+0.00024970t -0.00001156!2+0.00000322!"-0.00000132!t -0.0109125"2-0.00000631"t ,回归方程的复相关系数r =0.9998，残差标准差S =0.00065，残差平方和SE 为0.00001，本方程对试验结果拟合较好。
对回归方程中各项的偏回归系数分析结果表明，在选定试验条件下乙醇含量对喜树碱的提取率有显著影响，而提取温度及提取时间对提取结果影响不显著。
根据回归方程，最佳乙醇含量为61!（!），最佳提取温度为50C ，最佳提取时间为实验最小设定值20min 。
为了更准确地反映提取时间对喜树碱提取率的影响，进行了补充试验：在最佳乙醇含量和提取温度下，分别超声提取样品1、2、3、4、5、10、15、20、25及30min ，并进样分析。
结果表明，在1~10min ，喜树碱提取率随提取时间的延长而提高;10min 后，提取率随提取时间的延长而略有降低，但在提取时间为5~20min 间，所有提取样品的RSD 为3.6!，说明在此条件下，提取时间为5~20min 时喜树碱的提取率基本稳定，选择的提取时间为10min 。
因此，喜树碱最佳提取条件为：乙醇含量61!，提取温度50C ，提取时间10min 。
2.5干燥方法采集一定数量的喜树鲜叶，以叶脉为中线将喜树叶对称分为2份，分别采用80C 干燥至恒重及冻干至恒重的方法干燥，干燥后置于同一干燥器中保存1周。
