革兰氏染色法各种染液的配制

实验室常用染色液配方1、吕氏(Loeffler)美蓝染色液A液：美蓝(Methylene blue) 0.3 克95%酒精毫升B液：氢氧化钾(KOH) 0.01 克蒸馏水100 毫升分别配制A液和B液，然后混合即成。

2、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液A液：碱性复红(Basic fuchsin) 0.3 克95%酒精10.O 毫升B液：石炭酸(苯酚) 5.0 克蒸馏水95 毫升将碱性复红溶于95%酒精中，配成A液。

将石炭酸溶于蒸馏水中，配成B液。

将两者混合即成。

3、结晶紫染色液(Huclker改订)A液：结晶紫(Crystai violet) 2.5 克95%酒精25.0 毫升B液：草酸铵(NH4)2C2O4H2O 1.0 克蒸馏水100 毫升将结晶紫研细后，加入95%酒精，使之溶解，配成A液。

将草酸铵溶于蒸馏水，配成B液。

两液混合即成。

4、路戈氏(LugoI)碘液(革氏鉴别染色用)碘1.0克碘化钾2.0克蒸馏水300毫升先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，再将碘溶于碘化钾溶液中，溶时可稍加热，最后加足蒸馏水量。

5、番红染色液(革氏鉴别染色用)番红O(Safranin O) 2.0克蒸馏水100毫升6、孔雀绿染色液(芽孢染色用)孔雀绿(Malachite green) 5.0克蒸馏水100毫升先将孔雀绿研细，加少许95%酒精溶解，再加蒸馏水。

7、Dorner黑素液(英膜染色用)黑素(Nigrosin) 10.0克蒸馏水100毫升福尔马林(40%甲醛) 0.5毫升将黑素在蒸馏水中煮沸5分钟，加入福尔马林作为防腐剂，用玻璃棉过滤。

8、刚果红染色液刚果红(Congo red) 2.0克蒸馏水100毫升9、稀释结晶紫染液(放线菌染色用)结晶紫染色液(同3) 5.0毫升蒸馏水95.010、乳酸石碳酸棉蓝染色液（真菌制片，短期保存）石炭酸10.0克甘油20.0毫升乳酸(比重l.21) 10.0毫升棉蓝0.02克蒸馏水10.0毫升将碳酸加在蒸溜水中加热溶化，加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，溶解即成。

实验室常用染色液配方1、吕氏(Loeffler)美蓝染色液A液：美蓝(Methylene blue) 0.3 克95%酒精毫升B液：氢氧化钾(KOH) 0.01 克蒸馏水100 毫升分别配制A液和B液，然后混合即成。

2、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液A液：碱性复红(Basic fuchsin) 0.3 克95%酒精10.O 毫升B液：石炭酸(苯酚) 5.0 克蒸馏水95 毫升将碱性复红溶于95%酒精中，配成A液。

将石炭酸溶于蒸馏水中，配成B液。

将两者混合即成。

3、结晶紫染色液(Huclker改订)A液：结晶紫(Crystai violet) 2.5 克95%酒精25.0 毫升B液：草酸铵(NH4)2C2O4H2O 1.0 克蒸馏水100 毫升将结晶紫研细后，加入95%酒精，使之溶解，配成A液。

将草酸铵溶于蒸馏水，配成B液。

两液混合即成。

4、路戈氏(LugoI)碘液(革氏鉴别染色用)碘1.0克碘化钾2.0克蒸馏水300毫升先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，再将碘溶于碘化钾溶液中，溶时可稍加热，最后加足蒸馏水量。

5、番红染色液(革氏鉴别染色用)番红O(Safranin O) 2.0克蒸馏水100毫升6、孔雀绿染色液(芽孢染色用)孔雀绿(Malachite green) 5.0克蒸馏水100毫升先将孔雀绿研细，加少许95%酒精溶解，再加蒸馏水。

7、Dorner黑素液(英膜染色用)黑素(Nigrosin) 10.0克蒸馏水100毫升福尔马林(40%甲醛) 0.5毫升将黑素在蒸馏水中煮沸5分钟，加入福尔马林作为防腐剂，用玻璃棉过滤。

8、刚果红染色液刚果红(Congo red) 2.0克蒸馏水100毫升9、稀释结晶紫染液(放线菌染色用)结晶紫染色液(同3) 5.0毫升蒸馏水95.010、乳酸石碳酸棉蓝染色液（真菌制片，短期保存）石炭酸10.0克甘油20.0毫升乳酸(比重l.21) 10.0毫升棉蓝0.02克蒸馏水10.0毫升将碳酸加在蒸溜水中加热溶化，加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，溶解即成。

常用染色液的配制１．染料饱和酒精溶液的配制配制染色液常先将染料配成可长期保存的饱和酒精溶液，用时再予以稀释配制。

配制饱和酒精溶液，应先用少量95％酒精先在研钵中徐徐研磨，使染料充分溶解，再按其溶解度加于95％酒精之中，贮存于棕色瓶中即可。

附表1 几种常用染料在95%酒精中的溶解度(26℃)染料名称美蓝结晶紫龙胆紫碱性复红沙黄溶100mL95％酒精中的重量(g) 1.4813.8710.003.203.412．常用染色液的配制（１）碱性美蓝(亦称骆氏美蓝)染色液：取美蓝饱和酒精溶液30ml，加入0.01％氢氧化钾水溶液l00mL，混合即成。

此染色液在密闭条件下可保存多年。

若将其在瓶中贮至半满，松塞棉塞，每日拔塞摇振数分钟，并不时加水补充失去的水分，约1年后可获得多色性，成为多色美蓝染色液。

（２）草酸铵结晶紫(亦称赫克结晶紫)染色液：取结晶紫饱和酒精溶液2mL，加蒸馏水18mL稀释10倍，再加入1％草酸铵水溶液80mL，混合过滤即成。

（３）革兰氏碘溶液：将碘化钾2g置乳钵中，加蒸馏水约5mL。

再加入碘片1g，予以研磨，并徐徐加水，至完全溶解后，注入瓶中，被加蒸馏水至全量为300mL即成。

此液可保存半年以上，当产生沉淀或褪色后即不能再用。

（４）沙黄水溶液：沙黄也称番红花红。

将沙黄饱和酒精溶液以蒸馏水稀释10倍即成。

此液保存期以不超过4个月为宜。

（５）石炭酸复红染色液：取3%复红酒精溶液10mL，加入5％石炭酸水溶液90mL混和过滤即成。

（６）稀释石炭酸复红染色液：将石炭酸复红染色液以蒸馏水稀释10倍即成。

（７）3％盐酸酒精(亦称含酸酒精)：加浓盐酸3mL于95%酒精97mL中即成。

（８）瑞士染色色液：取瑞氏染料0.1g置乳钵中，徐徐加入甲醇，研磨以促其溶解。

将溶液倾入有色中性玻瓶中，并数次以甲醇洗涤乳钵，亦倾入瓶内，最后使全量为60mL即可。

将此瓶置暗处过夜，次日滤过即成。

此染色液须置于暗处，其保存期约为数月。

常用染色液的配制1.吕氏（Loefflev）美蓝染色液A液：2%美蓝（Methylene blue）95%酒精溶液B液：10%KOH溶液取A液30ml、B液0.1ml与100ml蒸馏水混合。

2.石炭酸复红染色液A液：4%碱性复红（basic fuchsin）95%酒精溶液将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使其溶解、配成A液。

B液：5%石炭酸溶液取A液10ml、B液90ml混合即可。

一般可将此溶液稀释5-10倍使用。

但稀释液易变质失效，一次不宜多配。

3.革兰氏（gram）染色液（1）草酸铵结晶紫染液：A液：1%结晶紫（Crystal violet）95%酒精溶液B液：1%草酸铵（Ammonium oxalate）溶液取A液20mlB液80ml，静置48/小时后使用。

（2）路哥氏（Lugol）碘液：碘片1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300ml先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液另，待碘全部溶解后，加够水即成。

（3）95%酒精溶液（4）蕃红（沙黄）复染液：2.5%蕃红（Safranlne O）95%酒精溶液。

取此液10ml与90ml蒸馏水混匀即成。

4.芽孢染色液（1）5%孔雀绿(Malachite green)溶液。

（2）0.5%蕃红溶液。

（3）苯酚品红溶液称取11g碱性品红溶于100ml无水酒精中。

再取上述溶液10ml与100ml 5%的苯酚溶液混合，过滤备用。

（4）黑色素(nigrosin)溶液10%黑色素溶液，置沸水浴中30min后，滤纸过滤二次，补加水到100ml，然后加入40%甲醛0.5%(v/v)作防腐剂。

5.荚膜染色液（1）黑色素水溶液将黑色素在蒸馏水中煮沸5min，配成5%溶液，然后加入40%甲醛0.5%(v/v)作防腐剂。

（2）蕃红染色液与革兰氏染色液中的蕃红复染液相同。

6.鞭毛染色液A液：单宁酸5.0g、FeC131.5g、蒸馏水100ml，福尔马林（15%）2.0ml、NaOH(1%)1.0ml。

实验室常用染色液配方1、吕氏(Loeffler)美蓝染色液A液：美蓝(Methylene blue) 0.3 克95%酒精毫升B液：氢氧化钾(KOH) 0.01 克蒸馏水100 毫升分别配制A液和B液，然后混合即成。

2、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液A液：碱性复红(Basic fuchsin) 0.3 克95%酒精10.O 毫升B液：石炭酸(苯酚) 5.0 克蒸馏水95 毫升将碱性复红溶于95%酒精中，配成A液。

将石炭酸溶于蒸馏水中，配成B液。

将两者混合即成。

3、结晶紫染色液(Huclker改订)A液：结晶紫(Crystai violet) 2.5 克95%酒精25.0 毫升B液：草酸铵(NH4)2C2O4H2O 1.0 克蒸馏水100 毫升将结晶紫研细后，加入95%酒精，使之溶解，配成A液。

将草酸铵溶于蒸馏水，配成B液。

两液混合即成。

4、路戈氏(LugoI)碘液(革氏鉴别染色用)碘1.0克碘化钾 2.0克蒸馏水300毫升先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，再将碘溶于碘化钾溶液中，溶时可稍加热，最后加足蒸馏水量。

5、番红染色液(革氏鉴别染色用)番红O(Safranin O) 2.0克蒸馏水100毫升6、孔雀绿染色液(芽孢染色用)孔雀绿(Malachite green) 5.0克蒸馏水100毫升先将孔雀绿研细，加少许95%酒精溶解，再加蒸馏水。

7、Dorner黑素液(英膜染色用)黑素(Nigrosin) 10.0克蒸馏水100毫升福尔马林(40%甲醛) 0.5毫升将黑素在蒸馏水中煮沸5分钟，加入福尔马林作为防腐剂，用玻璃棉过滤。

8、刚果红染色液刚果红(Congo red)2.0克蒸馏水100毫升9、稀释结晶紫染液(放线菌染色用)结晶紫染色液(同3) 5.0毫升蒸馏水95.010、乳酸石碳酸棉蓝染色液（真菌制片，短期保存）石炭酸10.0克甘油20.0毫升乳酸(比重l.21) 10.0毫升棉蓝0.02克蒸馏水10.0毫升将碳酸加在蒸溜水中加热溶化，加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，溶解即成。

实验用染色液的配制1．黑色素液水溶性黑素10g，蒸馏水100mL, 甲醛（福尔马林）0.5mL。

可用作荚膜的背景染色。

2．墨汁染色液国产绘图墨汁40mL，甘油2mL，液体石炭酸2mL。

先将墨汁用多层纱布过滤，加甘油混匀后，水浴加热，再加石炭酸搅匀，冷却后备用。

用作荚膜的背景染色。

3．吕氏(Loeffier)美蓝染色液A液：美蓝(methylene blue, 又名甲烯蓝)0.3g, 95%乙醇30mL;B液：0.0l% KOH l00mL。

混合A液和B液即成，用于细菌单染色，可长期保存。

根据需要可配制成稀释美蓝液，按1：10或1：100稀释均可。

4．革兰氏染色液(1)结晶紫(crystal violet)液：结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2g溶于20mL95%乙醇中)20mL，1%草酸铵水溶液80mL 将两液混匀置24h后过滤即成。

此液不易保存，如有沉淀出现，需重新配制。

(2)卢戈(Lugol)氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300mL。

先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸馏水至300mL即成。

配成后贮于棕色瓶内备用，如变为浅黄色即不能使用。

(3)95%乙醇：用于脱色，脱色后可选用以下(4)或(5)的其中一项复染即可。

(4)稀释石炭酸复红溶液：碱性复红乙醇饱和液(碱性复红1g, 95%乙醇l0mL, 5%石炭酸90mL混合溶解即成碱性复红乙醇饱和液)，取石炭酸复红饱和液l0mL加蒸馏水90mL即成。

(5)番红溶液：番红O(safranine，又称沙黄O)2.5g, 95%乙醇100mL，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中，用时取20mL与80mL蒸馏水混匀即可。

以上染液配合使用，可区分出革兰氏染色阳性(G+)或阴性(G-)细菌，G-被染成蓝紫色，G+被染成淡红色5. 鞭毛染色液A液：丹宁酸5.0g, FeCl3 1.5g，15%甲醛(福尔马林)2.0mL，l%NaOH 1.0mL，蒸馏水l00mL;B液：AgNO3 2.0g, 蒸馏水100mL。

革兰氏染色液配制文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-革兰氏染色液保质期：2-8度一年.革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，媒染剂碘液进入菌体后与结晶紫结合，革兰氏阳性菌对碘与结晶紫摄取量多且牢固，不易被酒精脱色。

革兰氏阴性菌对碘与结晶紫摄取量少，不牢固，易被酒精脱色。

为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红进行复染。

阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。

操作步骤：1、标本处理：（1）.有菌部位的标本，如痰液、粪便、各种拭子、创面等可直接涂片。

（2）.无菌部位的标本，如脑脊液、胸水、腹水、胆汁、尿液、关节液等，应取适量标本（最高可达5-7ml）,经3000rpm?离心10min.，取沉渣涂片染色。

2、涂片制作：菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布；菌落涂片时，先取生理盐水一滴，置玻片上，用接种针挑取菌落在盐水中涂布。

制作的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定的温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变。

将固定后的涂片进行染色。

3、染色方法：革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。

此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都可能会呈阴性反应。

（1）.加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。

（2）.加上碘液后染色1分钟，水洗。

（3）.加上95%酒精,摇动玻片,根据涂片厚度,脱色约30-60秒，水洗,吸去水分。

（4）.加上蕃红后，染色1分钟，水洗。

（5）.吸干或在空气中凉干后，油镜镜检。

4．结果观察：紫色为革兰氏阳性，红色为革兰氏阴性。

注意事项：1．标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。

2．玻片通过火焰温度不能太高。

3．若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。

4．碘液变透明，则不能使用。

实验室常用染色液配方1、吕氏(Loeffler)美蓝染色液A液：美蓝(Methylene blue) 0.3 克95%酒精毫升B液：氢氧化钾(KOH) 0.01 克蒸馏水100 毫升分别配制A液和B液，然后混合即成。

2、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液A液：碱性复红(Basic fuchsin) 0.3 克95%酒精10.O 毫升B液：石炭酸(苯酚) 5.0 克蒸馏水95 毫升将碱性复红溶于95%酒精中，配成A液。

将石炭酸溶于蒸馏水中，配成B液。

将两者混合即成。

3、结晶紫染色液(Huclker改订)A液：结晶紫(Crystai violet) 2.5 克95%酒精25.0 毫升B液：草酸铵(NH4)2C2O4H2O 1.0 克蒸馏水100 毫升将结晶紫研细后，加入95%酒精，使之溶解，配成A液。

将草酸铵溶于蒸馏水，配成B液。

两液混合即成。

4、路戈氏(LugoI)碘液(革氏鉴别染色用)碘1.0克碘化钾2.0克蒸馏水300毫升先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，再将碘溶于碘化钾溶液中，溶时可稍加热，最后加足蒸馏水量。

5、番红染色液(革氏鉴别染色用)番红O(Safranin O) 2.0克蒸馏水100毫升6、孔雀绿染色液(芽孢染色用)孔雀绿(Malachite green) 5.0克蒸馏水100毫升先将孔雀绿研细，加少许95%酒精溶解，再加蒸馏水。

7、Dorner黑素液(英膜染色用)黑素(Nigrosin) 10.0克蒸馏水100毫升福尔马林(40%甲醛) 0.5毫升将黑素在蒸馏水中煮沸5分钟，加入福尔马林作为防腐剂，用玻璃棉过滤。

8、刚果红染色液刚果红(Congo red) 2.0克蒸馏水100毫升9、稀释结晶紫染液(放线菌染色用)结晶紫染色液(同3) 5.0毫升蒸馏水95.010、乳酸石碳酸棉蓝染色液（真菌制片，短期保存）石炭酸10.0克甘油20.0毫升乳酸(比重l.21) 10.0毫升棉蓝0.02克蒸馏水10.0毫升将碳酸加在蒸溜水中加热溶化，加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，溶解即成。

微生物染色液配制及染色法2.1 美蓝染色法2.1.1 吕氏碱性美蓝染色液美蓝0.3g95%乙醇30mL0.01%氢氧化钾溶液100mL 将美蓝溶解于乙醇中，然后与氢氧化钾溶液混合。

2.1.2 染色法将涂片在火焰上固定，待冷。

滴加染液，染1～3min，水洗，待干，镜检。

2.1.3 结果菌体呈蓝色。

2.2 革兰氏染色法2.2.1 结晶紫染色液结晶紫1g95%乙醇20mL1%草酸铵水溶液80mL将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

2.2.2 革兰氏碘液碘1g碘化钾2g蒸馏水300mL将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。

2.2.3 沙黄复染液沙黄0.25g95%乙醇10mL蒸馏水90mL将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。

2.2.4 染色法2.2.4.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。

2.2.4.2 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。

2.2.4.3 滴加95%乙醇脱色，约30s；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s。

2.2.4.4 水洗，滴加复染液，复染1min。

水洗，待干，镜检。

2.2.5 结果革兰氏阳性菌呈紫色。

革兰氏阴性菌呈红色。

注：亦可用1：10稀释石炭酸复红染色液作复染液，复染时间仅需10s。

2.3 耐酸性染色法(萎－倪二氏法)2.3.1 石炭酸品红染色液碱性品红0.3g95%乙醇10mL5%酚水溶液90mL将品红溶解于乙醇中，然后与酚溶液混合。

2.3.2 3%盐酸－乙醇浓盐酸3mL95%乙醇97mL2.3.3 复染液吕氏碱性美蓝染色液。

2.3.4 染色法2.3.4.1 将涂片在火焰上加热固定，滴加石炭酸品红染色液，徐徐加热至有蒸气出现，但切不可使沸腾。

染液如因蒸发减少时，应随时添加。

染5min，倾去染液，水洗。

2.3.4.2 滴加盐酸－乙醇脱色，直至无红色脱落为止(所需时间视涂片厚薄而定，一般为1～3min)，水洗。

革兰氏染色液操作步骤及注意事项革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，通过这种方法，可以将细菌分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G）两大类。

以下将详细介绍革兰氏染色液的操作步骤及注意事项。

一、操作步骤1、涂片制备首先，在干净的载玻片上滴一小滴生理盐水。

然后，用无菌接种环挑取少量待检细菌培养物，与生理盐水混合均匀，形成薄薄的菌膜。

最后，让涂片自然干燥。

2、固定将干燥后的涂片通过火焰加热固定，加热时要让玻片背面接触火焰，来回通过 2 3 次，以杀死细菌并使其牢固地附着在玻片上。

3、初染在涂片上滴加结晶紫染色液，染色 1 2 分钟。

之后，用细水流轻轻冲洗涂片，直至流下的水无色为止。

4、媒染滴加碘液覆盖涂片，媒染 1 分钟。

同样用细水流冲洗，去除多余的碘液。

5、脱色用 95%的乙醇脱色，脱色时间约 20 30 秒，直到流出的乙醇无色或稍显淡紫色为止。

立即用细水流冲洗，终止脱色。

6、复染滴加沙黄复染液，染色 1 2 分钟。

用细水流冲洗，吸干水分后，在显微镜下观察。

二、注意事项1、涂片质量涂片不宜过厚，否则会影响染色效果，导致细菌重叠，难以分辨。

涂片应均匀，避免出现局部厚、局部薄的情况。

2、固定温度和时间固定时火焰温度不宜过高，以免破坏细菌形态。

固定时间要适中，过长或过短都会影响染色结果。

3、染色时间每种染色液的染色时间都要严格控制。

初染时间不足，会导致革兰氏阳性菌染色不充分；时间过长，则可能使革兰氏阴性菌也染上颜色。

脱色时间更是关键，脱色过度会使革兰氏阳性菌被误判为阴性菌；脱色不足，则会使革兰氏阴性菌被误判为阳性菌。

4、冲洗方式冲洗时水流要细、缓，避免直接冲掉涂片上的细菌。

冲洗的角度要合适，尽量从玻片的一端冲洗，避免染色液在玻片上残留。

5、染色液质量染色液应定期配制或购买新鲜的，以保证染色效果。

储存染色液时要注意避光、防潮，防止其变质。

6、显微镜观察观察时要先低倍镜找到视野，再换高倍镜观察。

革兰氏染色法的染色步骤革兰氏染色法是一种常用的细菌染色方法，它可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。

这种染色方法以丹宁蓝、碘溶液和洋红为主要染料，通过不同细菌细胞壁的结构差异，使得革兰氏阳性菌呈现紫蓝色，而革兰氏阴性菌呈现红粉色。

本文将详细介绍革兰氏染色法的具体步骤。

材料准备在进行革兰氏染色之前，我们需要准备以下材料：1.丹宁蓝（Crystal Violet）：用于初次染色。

2.Lugol碘溶液（Iodine solution）：用于固定颜料。

3.乙醇（Ethanol）：用于脱色。

4.洋红（Safranin）：用于对比着色。

此外，还需要准备玻璃片、牛津杯、显微镜、吸水纸等实验器材。

染色步骤下面是进行革兰氏染色的具体步骤：1. 制备细菌涂片首先，将待染色的细菌培养物取出一滴，滴在玻璃片上。

然后，用另一块玻璃片将细菌涂开成薄膜。

注意，要避免过度涂抹，以免细胞损坏。

2. 固定颜料接下来，在细菌涂片上滴加丹宁蓝（Crystal Violet），让其覆盖整个细菌涂片。

静置约30秒钟，使颜料渗透到细菌的细胞壁和胞质中。

3. 洗涤使用水或者生理盐水轻轻冲洗细菌涂片，以去除未结合的丹宁蓝。

4. 碘固定滴加Lugol碘溶液（Iodine solution）到细菌涂片上，让其覆盖整个区域。

静置约1分钟，使碘与丹宁蓝形成络合物并沉积在细菌内部。

5. 脱色倾斜玻璃片，并缓慢滴加乙醇（Ethanol）至细菌涂片上，直到滴下的乙醇呈现颜色为止。

这个步骤的目的是脱去革兰氏阴性菌的外膜，使其能够吸收洋红。

6. 冲洗使用水或者生理盐水轻轻冲洗细菌涂片，以去除乙醇和碘。

7. 对比染色滴加洋红（Safranin）到细菌涂片上，让其覆盖整个区域。

静置约1分钟，使洋红渗透到细菌细胞中。

8. 再次冲洗使用水或者生理盐水轻轻冲洗细菌涂片，以去除多余的染料。

9. 干燥与观察将细菌涂片放置在通风处晾干。

待干燥后，可以使用显微镜观察结果。

常用染色液的配制一、骆氏美蓝染色液（碱性美蓝染色液）甲液：美蓝0.3克，95%酒精30ML乙液：0.01%氢氧化钾溶液100ML甲、乙混合即可，密闭保存，一年后可获多色性。

二、革兰氏染色液1、草酸铵结晶紫染液甲液：结晶紫2G，95%酒精20ML，或结晶紫饱和酒精溶液2ML加蒸馏水18ML。

乙液：草酸铵0.8克，蒸馏水80ML。

甲、乙混合，静置48小时，过滤后备用，可较久贮存。

2、革兰氏碘溶液碘片1G，碘化钾2G，蒸馏水300ML碘化钾+3－5ML蒸馏水，溶解后+碘片，摇匀后+蒸馏水至足量。

3、95%酒精，用作脱色剂4、碱性复红染色液碱性复红（一品红）0.1G，蒸馏水100ML可用沙黄水溶液或稀释石炭酸复红液代替此液。

沙黄水溶液：沙黄饱和酒精溶液+10倍蒸馏水，保存期小于4个月。

稀释石炭酸复红染色液：石炭酸复红液10ML+蒸馏水90ML三、抗酸染色液1、石炭酸复红染色液3%碱性复红酒精溶液10ML+5%石炭酸水溶液90ML，过滤即可。

2、盐酸酒精液浓盐酸3ML+95%酒精97ML四、克利特氏荚膜染色液1、美蓝溶液：美蓝1G+96%酒精10ML+100ML蒸馏水2、碱性红溶液：碱性复红0.03G+1ML96%酒精+99ML蒸馏水五、瑞特氏染色液1、0.1G瑞特氏染粉研磨，再加中性甘油3ML，充分研磨，后徐徐加入甲醇液60ML，边研边搅，存于棕色瓶中过夜，过滤后贮于棕色瓶中，越久越好。

2、磷酸盐缓冲液甲液：磷酸氢二钠23.86G，1000ML蒸馏水。

乙液：磷酸二氢钾9.07G，1000ML蒸馏水。

4份甲液+1份乙液即可。

革兰氏染色液配制标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]革兰氏染色液保质期：2-8度一年.革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，媒染剂碘液进入菌体后与结晶紫结合，革兰氏阳性菌对碘与结晶紫摄取量多且牢固，不易被酒精脱色。

革兰氏阴性菌对碘与结晶紫摄取量少，不牢固，易被酒精脱色。

为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红进行复染。

阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。

操作步骤：1、标本处理：（1）.有菌部位的标本，如痰液、粪便、各种拭子、创面等可直接涂片。

（2）.无菌部位的标本，如脑脊液、胸水、腹水、胆汁、尿液、关节液等，应取适量标本（最高可达5-7ml）,经3000rpm离心10min.，取沉渣涂片染色。

2、涂片制作：菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布；菌落涂片时，先取生理盐水一滴，置玻片上，用接种针挑取菌落在盐水中涂布。

制作的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定的温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变。

将固定后的涂片进行染色。

3、染色方法：革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。

此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都可能会呈阴性反应。

（1）.加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。

（2）.加上碘液后染色1分钟，水洗。

（3）.加上95%酒精,摇动玻片,根据涂片厚度,脱色约30-60秒，水洗,吸去水分。

（4）.加上蕃红后，染色1分钟，水洗。

（5）.吸干或在空气中凉干后，油镜镜检。

4．结果观察：紫色为革兰氏阳性，红色为革兰氏阴性。

注意事项：1．标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。

2．玻片通过火焰温度不能太高。

3．若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。

4．碘液变透明，则不能使用。

5.水洗时动作要轻柔,沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗,以免把菌体冲掉。

⾰兰⽒染⾊⾰兰⽒染⾊法是细菌学中⼴泛使⽤的⼀种鉴别染⾊法，1884年由丹麦医师Gram创⽴。

细菌先经碱性染料结晶染⾊，⽽经碘液媒染后，⽤酒精脱⾊，在⼀定条件下有的细菌此⾊不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两⼤类，前者叫做⾰兰⽒阳性菌（G+），后者为⾰兰⽒阴性菌（G—）。

为观察⽅便，脱⾊后再⽤⼀种红⾊染料如碱性蕃红等进⾏复染。

阳性菌仍带紫⾊，阴性菌则被染上红⾊。

有芽胞的杆菌和绝⼤多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈⾰兰⽒正反应；弧菌，螺旋体和⼤多数致病性的⽆芽胞杆菌都呈现负反应。

⾰兰⽒阳性菌和⾰兰⽒阴性菌在化学组成和⽣理性质上有很多差别，染⾊反应不⼀样。

现在⼀般认为⾰兰⽒阳性菌体内含有特殊的核蛋⽩质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱⾊，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱⾊，这是染⾊反应的主要依据。

另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH条件下进⾏染⾊，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。

所以染⾊时的条件要严格控制。

例如，在强碱的条件下进⾏染⾊，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH 很低时，则可都呈负反应。

此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫—碘复合物的通透性也不⼀致，阳性菌透性⼩，故不易被脱⾊，阴性菌透性⼤，易脱⾊。

所以脱⾊时间，脱⾊⽅法也应严格控制。

⾰兰⽒染⾊法⼀般包括初染、媒染、脱⾊、复染等四个步骤，具体操作⽅法是：1）涂⽚固定。

2）草酸铵结晶紫染1分钟。

3）⾃来⽔冲洗。

4）加碘液覆盖涂⾯染1分钟。

5）⽔洗，⽤吸⽔纸吸去⽔分。

6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进⾏脱⾊，30秒后⽔洗，吸去⽔分。

7）蕃红梁⾊液（稀）染10秒钟后，⾃来⽔冲洗。

⼲燥，镜检。

染⾊的结果，⾰兰⽒正反应菌体都呈紫⾊，负反应菌体都呈红⾊。

⼀、常⽤染⾊液的配制⒈碘-碘化钾（I2-KI）溶液能将淀粉染成蓝紫⾊，蛋⽩质染成黄⾊，也是植物组织化学测定的重要试剂。

配⽅：碘化钾2g ；蒸馏⽔300ml ；碘1g先将碘化钾溶于少量蒸馏⽔中，待全溶解后再加碘，振荡溶解后稀释⾄300mL，保存在棕⾊玻璃瓶内。

革兰氏染色法注意事项革兰氏染色法是鉴别细菌颜色染色的一种基本方法，广泛应用于微生物学中。

下面将详细介绍革兰氏染色法的注意事项。

1. 材料准备：首先要准备好所需的试剂和设备。

常用的试剂包括革兰染色液（包括结晶紫、碘化钾、乙醇、碳酸氢钠）、解染液（醋酸）、蓝色染色液（甲基蓝）等。

设备包括无菌的染色盘、玻璃棒或载玻片（用于制备菌涂片）、显微镜等。

2. 菌液的制备：革兰染色需要使用到培养基上生长的细菌。

在制备菌液时，需要注意细菌的生长阶段和浓度。

一般选择青春期或乳酸发酵期的细菌，以保证细胞壁较为完整。

3. 制备菌涂片：首先，需要在无菌载玻片上滴取一滴细菌培养液，然后用无菌玻璃棒将液体均匀涂抹在载玻片上。

注意避免过度刷涂或形成滴状，以免影响革兰染色效果。

4. 固定菌涂片：将涂片放置在供固定菌涂片的染色盘中，用火轮瓶温和地旋转加热烘干，烘干时间通常为1-2分钟，避免过度加热，以免烘干过度导致细菌变形。

5. 染色过程：先用革兰染色液（结晶紫）覆盖在菌涂片上，静置约1分钟，然后用注射器或滴管滴加碘化钾溶液。

过程中需要均匀淋洗整个菌涂片，以确保染色均匀。

6. 解染：使用解染液（醋酸）轻轻冲洗涂片，直到洗液变干净为止。

解染液的使用量要适量，避免过度冲洗，以免溶解染色的细菌。

7. 染色：将蓝色染色液（甲基蓝）倒在染色盘上，将解染后的菌涂片放在染色液上浸泡大约1分钟，然后用水冲洗涂片，直到冲洗液没有颜色溢出。

8. 洗涤：染色后，要将涂片用水冲洗干净，去除多余的染料和试剂残留。

冲洗时需要轻柔地冲洗，避免涂片撞击或擦伤。

9. 干燥：冲洗完后，用纸巾或吹风机将涂片表面的水分吸干，然后将涂片放置在通风处自然晾干。

10. 观察：将干燥的涂片放置在显微镜的载玻片夹中，以100倍至1000倍的放大倍数进行观察。

革兰氏染色后，革兰阳性细菌呈紫色或深蓝色，革兰阴性细菌呈粉红色。

观察时注意镜片清洁干净，避免污染。

以上就是革兰氏染色法的注意事项。

实验室常用染色液配方1、吕氏(Loeffler）美蓝染色液A液:美蓝(Methylene blue) 0.3 克95％酒精毫升B液：氢氧化钾（KOH) 0。

01 克蒸馏水100 毫升分别配制A液和B液，然后混合即成。

2、齐氏（Ziehl）石炭酸复红染色液A液：碱性复红（Basic fuchsin）0。

3 克95％酒精10。

O 毫升B液：石炭酸(苯酚）5.0 克蒸馏水95 毫升将碱性复红溶于95％酒精中,配成A液。

将石炭酸溶于蒸馏水中，配成B液。

将两者混合即成。

3、结晶紫染色液(Huclker改订）A液：结晶紫（Crystai violet）2.5 克95%酒精25.0 毫升B液：草酸铵(NH4）2C2O4H2O 1.0 克蒸馏水100 毫升将结晶紫研细后，加入95%酒精，使之溶解，配成A液。

将草酸铵溶于蒸馏水，配成B液。

两液混合即成.4、路戈氏（LugoI)碘液（革氏鉴别染色用)碘1。

0克碘化钾2。

0克蒸馏水300毫升先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,再将碘溶于碘化钾溶液中,溶时可稍加热，最后加足蒸馏水量。

5、番红染色液(革氏鉴别染色用)番红O(Safranin O) 2.0克蒸馏水100毫升6、孔雀绿染色液（芽孢染色用）孔雀绿（Malachite green）5。

0克蒸馏水100毫升先将孔雀绿研细，加少许95％酒精溶解,再加蒸馏水。

7、Dorner黑素液（英膜染色用）黑素(Nigrosin）10。

0克蒸馏水100毫升福尔马林(40%甲醛）0.5毫升将黑素在蒸馏水中煮沸5分钟，加入福尔马林作为防腐剂,用玻璃棉过滤。

8、刚果红染色液刚果红(Congo red）2.0克蒸馏水100毫升9、稀释结晶紫染液(放线菌染色用)结晶紫染色液(同3） 5.0毫升蒸馏水95。

010、乳酸石碳酸棉蓝染色液（真菌制片,短期保存）石炭酸10。

0克甘油20.0毫升乳酸（比重l。

21) 10.0毫升棉蓝0。

02克蒸馏水10。

0毫升将碳酸加在蒸溜水中加热溶化，加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，溶解即成。