猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活力测定、同工酶电泳

一、原理1.超氧化物歧化酶（SOD）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一种能专一地清除超氧离子自由基（O2−）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、抗炎及抗癌等作用因而在医药、化妆品及食品工业等方面有了广泛的应用前景。

SOD是一种酸性蛋白，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。

按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD（二聚体，蓝绿色）、Mn-SOD（紫红色）和Fe-SOD（黄褐色）三种。

SOD催化下述反应：2H++2O2−→ H2O2+O2。

机体内O2−的过量和不足均对机体不利，SOD 对过量的O2−的及时清除保证了机体内O2−的含量相对的平衡。

机体内的O2−形成可分为生理性和病理性两方面。

在一些正常生理过程中会形成一些O2−。

例如：呼吸链中电子传递结果可产生一些O2−。

在某些疾病（如氩中毒、辐射病等）过程中会产生大量的O2−。

过量的O2−如不及时清除，会对细胞损伤。

SOD将O2−歧化为 H2O2和O2，而过氧化氢（物）酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化或氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。

2.有机溶剂沉淀法分离纯化蛋白质本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行分离纯化。

有机溶剂沉淀法的基本原理：①亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀；②水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。

常见的有机溶剂有丙酮和乙醇等。

3.邻苯三酚自氧化法测定酶活力酶活性测定的方法有以下几种方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法及亚硝酸法等。

本实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为1个酶单位。

邻苯三酚自氧化法的原理：利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，产生O2−，生成有颜色的中间产物。

猪血红细胞SOD分离纯化及活性分析一．概述自从人类从牛的红细胞中提取SOD以来，至今已经建立了一整套快速而有效的SOD分离及分析方法，并对它的化学、药理、临床及其作用机制进行了一系列研究。

SOD无抗原性，不良反应较小，是很有临床价值的治疗酶，掌握其一整套完善实用的实验室制备技术具有深远意义。

超氧化物歧化酶广泛存在于自然界各种生物体内，而目前动物血液是生产超氧化物歧化酶的主要原料，牛血和猪血较为常见，虽然猪血很少用于生产，但是鉴于猪血价格低廉且资源丰富，对于实验室研究制备比较适合。

本实验中采用一系列技术方法对SOD进行提取纯化分析，虽然大部分都是一些常规技术，但是很多技术的细节前人尚不甚明了，因此与实验结果相比，本实验所应用的技术处理手段及其相关理论解释对后续实验者操作的启发意义显得更为重要，并且很多技术原理并不是局限于一种或一类实验而是广泛应用于化学研究领域的。

二．实验所用到的主要仪器与技术仪器：大容量离心机，分光光度计，电泳槽，层析柱，紫外分光光度计，记录仪等等技术：离心配平，洗涤溶胀，盐析，透析，电泳，分光光度法，柱层析等等。

三．所用到的试剂3.8%柠檬酸钠，0.9%NaCl, 95%乙醇，氯仿，K2HPO4.3HO2,KH2PO4, 丙酮，0.0025mol PH7.8磷酸钾缓冲液，1mol K2HPO4 90.8ml+1mol KH2PO4 9.2ml,稀释40倍。

比色分析试剂BSA冰醋酸PAGE试剂DEAE试剂四．关键的试验无水磷酸氢二钾盐析，磷酸钾缓冲液透析，蛋白质含量测定，SOD活性测定，PAGE电泳，DEAE柱层析，SOD精酶液蛋白含量测定，SOD 精酶液SOD活性测定五．实验流程第一天：（1）取新鲜抗凝猪血800ml。

在天平上与另外一组进行配平，由于对方重了一些，我组加入了一些备用的抗凝猪血。

配平完后，放入大容量离心机，待其他组放好后，关上盖子，设置温度为4度，转速为2800rpm/min开始离心。

超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活⼒测定、同⼯酶电泳实验⼆猪⾎中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活⼒测定、同⼯酶电泳⼀、实验原理超氧化物岐化酶SOD⼴泛存在于⽣物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的⾦属类酶。

它作为⽣物体内重要的⾃由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离⼦，在防御⽣物体氧化损伤⽅⾯起着重要作⽤。

SOD是⼀种酸性蛋⽩，对热、pH和蛋⽩酶的⽔解较⼀般酶稳定。

根据⾦属辅基的不同，它可以分为四类，分别为Mn-SOD、Cu-Zn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD，其中最常见是(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中。

CuZn-S0D酶蛋⽩的分⼦量约为3.2×104，每个酶分⼦由2个亚基通过⾮共价键的疏⽔基相互作⽤缔合成⼆聚体，每个亚基(肽链)含有铜、锌原⼦各⼀个，活性中⼼的核⼼是铜。

SOD作为机体内最重要的抗氧化酶体之⼀，可以直接清除过量的超氧⾃由基，阻⽌机体的过氧化，对机体有较⾼的防护作⽤及保健价值。

本实验采⽤有机溶剂沉淀法以新鲜猪⾎为原料，从中提取SOD硬进⾏纯化。

酶活⼒测定可⽤以下⽅法：黄嘌呤氧化酶法、细胞⾊素C法、肾上腺素⾃氧化法亚硝酸法、NBT光还原法、化学发光法以及邻苯三酚⾃氧化法等。

⽽该实验SOD酶活性采⽤邻苯三酚⾃氧化法测定。

酶活性单位定义为:在1ml的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚⾃氧化速率达50%时的酶量定义为⼀个活⼒单位。

SOD同⼯酶奠定采⽤不连续聚丙烯酰胺-的作⽤，因此，电泳分离SOD后，凝凝胶电泳技术分离鉴定。

⽤“负”显⾊法显⽰。

由于SOD能够抑制O2胶上⽆SOD处显⽰为蓝⾊，⼜SOD处为⽆⾊透明，由此可以鉴定SOD同⼯酶酶谱。

⼆、实验试剂与器材ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%⼄醇、氯仿、考马斯亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐溶液、3mmol/L 邻苯三酚溶液等以及752分光光度计、分析天平、具塞试管、刻度吸管、离⼼机、烧杯、电泳装置、微量进样器、注射器等。

高级生物化学实验指导四川农业大学生化研究室二零一二年十月目录实验一猪血中超氧化物歧化酶(sod)的分离纯化及活力测定、同工酶电泳 (1)实验二蛋白质分子量测定——凝胶层析法 (8)实验三纳米磁珠法小规模提取质粒DNA及纯化鉴定 (18)实验四DNA的琼脂糖凝胶电泳 (21)实验一猪血中超氧化物歧化酶（sod）的分离纯化及活力测定、同工酶电泳一、原理超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）是一种能专一地清除超氧离子自由基（ChJ 的金属酶,他具有抗衰老•抗辐射、抗炎和抗癌等作用，因而在医药化妆品、食品工业等方面具有了广泛地应用前景。

SOD是一种酸性蛋白，对热、PH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。

按照它所含金属离子的不同，可分为Cu・・・Zn…SOD、Mn—SOD> Fe一SOD等三不巾。

Cu—Zn—SOD为二聚体，呈蓝绿色；Mn—SOD呈紫红色；Fe-—SOD呈褐色。

SOD催化下述反应：2H++2O2-H2O2+O2O机构内（T的过量和不足均对集体不利，SOD 对过量的02•的及时清理保证了集体内02•的含量相对平衡。

集体内的02■的形成可病理性和生理性两方面。

在一些正常的生理过程中形成一些02\例如：呼吸链中电子传递结果可以产生一些02・。

在某些疾病的过程产生大量02■如不及时清理，会对细胞损伤。

SOD将02・, 歧化为H202,而过氧化酶、股胖肝泰过氧化酶可以催化过氧化氢分解，在集体内形成一套解毒系统，对集体起防护作用。

本实验采用邮寄溶剂沉淀方法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并惊酮纯化。

酶活力测定可用以下方法；邻苯三分口氧化法、黄瞟吟氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺自氧化法、亚硝酸法等。

该实验sod酶活性采用邻苯三分自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应中，每分钟抑制邻苯三分氧化速率达50%的酶含量定义为一个酶的单位。

样品中的蛋口质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。

实验三猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定生物化学与分子生物学刘志坚S2*******一、超氧化物歧化酶（SOD）概述SOD是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅基，因此它对热、PH以及某些理化性质表现出异常的稳定性。

SOD根据所含金属辅基不同可分为三种：第一种是铜（Cu）锌（Zn）金属辅基称（Cu/Zn-SOD）最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于肌体细胞浆中。

它为同源二聚体酶，其中一个亚基结合一个Cu原子，另一个亚基结合一个Zn原子，两个亚基间的相互作用提高了酶的催化活性和稳定性，金属原子的氧化还原完成了酶的催化功能。

第二种是含锰（Mn）金属辅基的称（Mn—SOD），呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内。

Mn—SOD是由203个氨基酸残基构成的四聚体，Mn3+处于三角双锥配位环境中，其中一轴向配位为水分子，另一轴向被蛋白质辅基的配位His-28占据，另3个配位His-83、His-170和Asp-166位于赤道平面。

第三种是含铁（Fe）金属辅基的称（Fe—SOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。

其活性中心是3个His，1个Asp和1个H2O扭曲四面体配位而成。

其中，Mn—SOD 、Fe—SOD的结构特征是不含半胱氨酸，含有较多的色氨酸和酪氨酸，因此紫外吸收光谱类似一般蛋白质，在280nm附近有最大吸收峰，Mn—SOD的可见光谱在475nm处附近有最大吸收，Fe—SOD在350nm处有最大吸收，这都反映了所含金属离子的光学性质。

SOD为自由基清除剂，它广泛存在于生物体的各种组织中，能清除O2-（超氧阴离子）自由基，而超氧阴离子自由基具有细胞毒性，可使脂质过氧化，损伤细胞膜，引起炎症，肿瘤和自身免疫性疾病，并可能促使机体衰老。

它的功能为：（1）抑制心脑血管疾病：机体的衰老与体内氧自由基的产生与积累密切相关，SOD课清除人体内过多的有害的氧自由基，是对健康的有益的功效成分。

猪超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒使用方法本试剂盒仅供研究使用。

检测范围：96T0.7U/mL - 20 U/mL使用目的：本试剂盒用于测定猪血清、血浆及相关液体样本中超氧化物歧化酶（SOD）含量。

实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中猪超氧化物歧化酶（SOD）水平。

用纯化的猪超氧化物歧化酶（SOD）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入超氧化物歧化酶（SOD），再与HRP 标记的超氧化物歧化酶（SOD）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。

TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的超氧化物歧化酶（SOD）呈正相关。

用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中猪超氧化物歧化酶（SOD）浓度。

试剂盒组成1 30 倍浓缩洗涤液20ml×1 瓶7 终止液6ml×1 瓶2 酶标试剂6ml×1 瓶8 标准品（40 U/mL）0.5ml×1 瓶3 酶标包被板12 孔×8 条9 标准品稀释液1.5ml×1 瓶4 样品稀释液6ml×1 瓶10 说明书1 份5 显色剂A 液6ml×1 瓶11 封板膜2 张6 显色剂B 液6ml×1/瓶12 密封袋1 个标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。

若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3 的样品，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

20U/mL 5 号标准品150μl 的原倍标准品加入150μl 标准品稀释液10U/mL 4 号标准品150μl 的5 号标准品加入150μl 标准品稀释液5 U/mL 3 号标准品150μl 的4 号标准品加入150μl 标准品稀释液2.5 U/mL 2 号标准品150μl 的3 号标准品加入150μl 标准品稀释液1.25 U/mL 1 号标准品150μl 的2 号标准品加入150μl 标准品稀释液2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。

超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术证明SOD提取过程工艺不同浓度的硫酸铵对纯化SOD蛋白酶的效果的综合影响一、摘要：通过对绿豆的研磨破碎获得SOD粗酶，经过(NH4)2SO4分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶中的杂质及干扰蛋白。

二、关键词：SOD 连苯三酚自氧化法SOD酶活性测量透析除盐三、前言：超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶.它是一种源于生命体的活性物质，SOD是机体内危害最大的氧自由基专一清除剂，亦是其他自由基最有效的清除剂，它与体内的谷胱甘肽过氧酶、过氧化氢酶联手，把自由基转化为水和氧分子。

能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。

对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。

本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。

四、实验技术路线：我们的这次试验主要的路线是通过测定经过不同浓度的硫酸铵分离出来的不同的SOD蛋白的上清和沉淀，以此来确定硫酸铵沉淀SOD酶和其他杂蛋白的一个大致区间。

经过40%的硫酸铵和50%的硫酸铵作用过后的提取液，得到40%的上清和沉淀，50%的上清和沉淀。

然后分别测定这4份样品的SOD酶活力，来推理出硫酸铵沉淀区间。

五、材料和试剂：绿豆（实验使用前需先用蒸馏水浸泡20h）；连苯三酚（使用时需先稀释5倍）；硫酸铵（粉末）；Tris-HCL缓冲液；蒸馏水。

六、仪器：匀浆机；低温离心机；分光光度计；移液枪；500ml量筒；纱布；烧杯和试管若干。

七、实验步骤：1、取30g绿豆，并加入300ml蒸馏水，用匀浆机匀浆。

2、匀浆出来的豆液用二层纱布过滤，离心（5℃，3000rpm / 8min）取上清液，取1ml上清液测量其总活性（用连苯三酚自氧化测SOD活性法），其余量取150ml分装成两支各75ml。

猪血超氧化物歧化酶分离纯化工艺改进及其抗氧化活性研究王保全;庞晓斌;李昭华;平娟;王玲玲;董先智【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2010(000)002【摘要】以新鲜猪血为原料,首次利用改进的新工艺提取分离超氧化物歧化酶,经过溶血,热变,丙酮沉淀,超滤浓缩,SephadexG-75凝胶过滤层析和DEAE-sepharose-fast flow离子交换层析纯化,冷冻干燥等步骤,得到高纯度酶,并对酶的相关性能进行研究.试验结果显示产品粗酶活性在3 000 U/mg左右,分剐经SephadexG-75和DEAE-sepharose-fast flow层析纯化后,酶活分别达到5 585 U/mg和6 148 U/mg产品得率分别为13.4%和10.32%,SDS-PAGE凝胶电泳显示为单一条带达到电泳纯,其分子量在31 kD附近,其临苯三酚抗氧化活性明显.【总页数】5页(P168-172)【作者】王保全;庞晓斌;李昭华;平娟;王玲玲;董先智【作者单位】河南大学药学院,开封,475001;中国科学院生物物理研究所,北京,100101;河南大学药学院,开封,475001;中国科学院生物物理研究所,北京,100101;河南大学药学院,开封,475001;河南大学药学院,开封,475001;中国科学院生物物理研究所,北京,100101【正文语种】中文【相关文献】1.苦瓜抗氧化活性成分的分离纯化及抗氧化活性研究 [J], 刘苇芬;郭丽萍2.麦苗中超氧化物歧化酶抗氧化活性研究 [J], 张志清;丛军;林虹;晁正3.红花籽抗氧化肽的分离纯化及抗氧化活性研究 [J], 孙立;毛晓英;陈计峦;李保山4.湖南猪血桃花色苷提取工艺优化及抗氧化活性研究 [J], 杨玉;陈为峰;袁野;廖琼;邓文;徐海;卜范文5.猪血中抗菌肽类物质的分离纯化和抗菌活性研究 [J], 张艳梅;佘锐萍;刘天龙;李文贵;贾君镇;包汇慧因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。