核酸的分离纯化

核酸纯化方大全一：酚氯仿抽提—经典的纯化技术酚氯仿抽提可算得上是核酸分离纯化技术中最经典的方法之一，该方法是由冷泉港实验室中的研究人员首先提取的，并被大量的科研究工作者进行改良使用。

其原理是：在酚氯仿的共同作用下，蛋白质会被变性，形成不溶解的物质。

由于蛋白质的密度小于酚而大于水，所以离心后，会在酚相和水相于之间，形成蛋白质中间层，从而有效地将蛋白质和核酸分离开来。

由于DNA的抽提方式有很多，这个技术并没有被试剂公司接受。

但是另一方面，使用酸性酚氯仿抽提RNA的纯化方式却被广泛接受（因为有效的RNA纯化方式并不多），其纯化原理为：在酸性酚的条件下，DNA溶解于有机相，RNA溶解于水相，而蛋白质则在中间相；从而有效地将DNA，RNA和蛋白质一起分开。

该技术的创始人是Chomczynski。

RNA-Solv Reagent （Omega Bio Tek）就是这一技术的改良产品。

这一技术的最大优点就是经济，灵活。

二：盐析法—经济型核酸抽提技术该技术原理是在组织或细胞裂解液中，加入高浓度盐（NaCl或NH4Cl，KI，KAC）来沉淀去除蛋白质，从而得到高纯度的基因组DNA。

Omega公司在这一方面有着非常卓越的产品。

基于这一技术的产品，其名称都有’SQ’。

该系列的产品最大的优点就是：经济和灵活，是目前提取基因组DNA最经济的试剂盒。

此外，Omega在首次研发了基于这一技术的DNA，RNA和蛋白质共提取的试剂盒，这一个目前最方面最快速的DNA，RNA和蛋白质共提取的试剂盒。

三：玻璃珠—第一个固液相核酸纯化技术在高离液盐（盐酸胍，异硫氰酸胍，NaI）条件下，玻璃珠会同核酸发生吸附反应，而在低盐条件下，核酸又可以被洗脱下来。

但是玻璃珠的残留以及干燥问题影响了这一技术的运用。

至目前为止，大部分的公司已经去除这个纯化技术。

早期的Omega也有许多基于这个技术的试剂盒，但是今天Omega公司只在凝胶回收中保留了这个试剂盒（Ultra-Sep Gel Extraction Kit）。

核酸提取的基本步骤及原理
核酸提取的基本步骤包括以下几个步骤：
1. 细胞或组织的损毁与裂解：将样品中的细胞或组织破坏并裂解，使内部的核酸暴露在溶液中。

常用方法包括机械破碎、化学裂解或酶裂解等。

2. 蛋白质去除：通过加入蛋白酶等蛋白质分解酶，将样品中的蛋白质降解，以便之后纯化核酸。

3. 核酸纯化：通过溶液的调节和加入适当的试剂，使核酸与其他杂质分离。

常用的方法有酚-氯仿萃取、硅胶柱层析、磁珠吸附等。

4. 洗涤：通过洗涤溶液的加入和溶液对样品的冲洗，去除残留的杂质，提高核酸的纯度。

5. 脱盐：通过洗涤和纯化步骤，使核酸处于含有适量盐浓度的溶液中。

6. 浓缩：通过溶液的挥发、沉淀和离心等方法，将核酸溶液浓缩到适当的体积。

7. 质量检测：使用紫外吸收光谱、凝胶电泳等方法进行核酸的质量和纯度检测。

8. 储存：将提取得到的核酸转移到适当的储存条件下，保存以备进一步应用。

核酸提取的原理是利用细胞或组织中核酸与其他成分的生化性质的差异，通过物理或化学方法分离和纯化核酸。

核酸提取的关键步骤是细胞裂解和蛋白酶处理。

在细胞裂解过程中，细胞壁和膜被破坏，同时蛋白质酶降解细胞中的蛋白质。

随后通过柱层析或吸附等方法，分离纯化核酸。

最后，通过洗涤、脱盐和浓缩等步骤去除杂质，获得纯净的核酸溶液。

核酸分离与纯化的技术路线与原则核酸包括DNA 、RNA两类分子，在细胞内均与蛋白质结合成核蛋白。

真核生物基因组中，95%DNA 为双链线性分子，存在于细胞核中，5%为双链环状分子，存在于细胞器中；原核生物DNA 及质粒DNA 为双链或单链环状分子；RNA 为单链线性分子，主要存在于细胞质中。

DNA 与RNA 性质的不同导致对其分离与纯化的条件也不相同。

一、核酸分离与纯化的原则(1)保证核酸一级结构的完整性。

生物的遗传信息全部贮存在核酸一级结构中，而且核酸的一级结构还决定其高级结构的形式及和其他大分子结合的方式。

所以，所提取的核酸一级结构的完整性直接影响着后续实验中对其结构与功能研究的质量。

因此，在制备核酸的过程中，要做到：尽量简化操作程序，缩短提取过程；避免过酸、过碱等化学因素对核酸链中磷酸二酯键的破坏，在pH 值4～10条件下进行操作；操作时动作要轻缓，提取的样品小包装保存，以免诸多的物理因素对核酸的降解；避免细胞内及环境中核酶对核酸的生物性降解。

(2)排除其他生物大分子的污染，如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应尽可能降低到最低程度，特别是提取DNA 分子时应除去RNA 分子，反之亦然。

(3)排除核酸样品中有机溶剂和过高浓度的金属离子。

二、分离与纯化的技术路线(一)核酸的释放通常情况下DNA 及RNA 均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是制备单个细胞，再破碎细胞，从而释放核酸。

破碎细胞的方法包括机械法与非机械法两大类。

机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法；非机械法可分为干燥法与溶胞法。

由于溶胞法采用适宜的化学试剂与酶，能有效地裂解细胞，方法温和，能保证较高的核酸获得率，并能较好地保持核酸的完整性，从而得到广泛的应用。

(二)核酸的分离与纯化利用核酸与其他物质性质上的差异，可以分离与纯化核酸。

这种差异包括细胞定位与组织分布上的差异，物理、化学性质上的不同，以及各自独特的生物学特性。

操作过程中，既可以从复杂样品中抽提出核酸分子，也可以将样品中的非核酸成分(非核酸的生物大分子、非需要的核酸分子及在操作过程中加入的溶液与试剂)逐步清除。

核酸分离纯化方法
核酸分离纯化方法包括以下几种常用方法：
1. 酚酸法（Phenol-Chloroform Extraction）：通过酚酸混合液溶解蛋白质，然后进行醚抽提，可分离出核酸。

该方法通常用于大量样品的纯化。

2. 高盐法（Salt Precipitation）：通过加入高浓度盐溶液，如氯化钠，使核酸在低温下形成沉淀，然后离心分离。

3. 硅胶柱法（Silica Column）：将核酸样品通过硅胶柱，利用硅胶对核酸的亲合性，使核酸固定在柱中，通过洗脱剂洗脱纯化的核酸。

4. 钠离子交换柱法（Sodium Ion Exchange Column）：利用柱内载体对核酸的亲合性，在一定的钠离子浓度下，核酸与载体结合，通过洗脱缓冲液洗脱纯化的核酸。

5. 凝胶电泳法（Gel Electrophoresis）：利用电场作用，将核酸样品在凝胶上进行分离和纯化。

根据核酸的大小，可选择琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。

核酸分离纯化的技术原理核酸提取是核酸检测实验的第一步，也是最关键的一步。

核酸提取的纯度、产量和质量是影响下游实验的关键。

核酸提取主要有两个步骤，分别是裂解和纯化，其中，裂解的目的是通过各种方法裂解细胞，将核酸释放到溶液中，纯化的目的则是将核酸分子从裂解液中特异性地分离出，从而避免裂解液中原有的蛋白分子、脂类、糖类、多肽、其他有机或无机分子对后续核酸检测实验的干扰。

在核酸提取过程中还应遵循以下原则：保证核酸分子一级结构的完整性；去除其他污染分子。

一、液相核酸分离纯化技术（一）胍硫氰酸酚-氯仿提取法盐类通常是核酸样本中最常见的杂质成分，因此，在将核酸样本进行下游处理和分析前，通常需要去除盐类成分。

因此，通常需一或多个分离和（或）纯化步骤来使样本脱盐。

核酸纯化的常规步骤包括细胞裂解，该步骤通过破坏细胞结构而形成细胞裂解液，同时灭活包括DNA酶和RNA酶在内的细胞内源性核酶，并最终从细胞碎片中获得纯净的核酸样本。

有机溶剂-苯酚-氯仿提取法正是基于上述原理最常见的核酸经典提取方法之一。

苯酚-氯仿-异丙醇按照一定比例混合后（即：25∶24∶1）可抵制RNA酶活性，从而克服单用苯酚无法抑制RNA酶活性的不足。

蛋白、脂质、碳水化合物和细胞碎片可通过提取苯酚和氯仿有机试剂混合物的水相而去除。

含有DNA样本的水相可通过加入2∶1或1∶1比例的乙醇或异丙醇沉淀，最后，沉淀下来的DNA用70%乙醇洗涤并最后溶解于TE缓冲液或无菌去离子水中。

异硫氰酸胍（guanidinium isothiocyanate）用于RNA提取的方法最早见于1977年，但是，由于该方法比较繁琐，后来逐步被称之为胍硫氰酸酚-氯仿提取法（guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction）代替，该方法可一步完成RNA提取。

其基本原理是：硫氰酸胍是蛋白质强变性剂，能裂解组织细胞，释放RNA，抑制RNA酶的活性，同时与RNA形成可溶性复合物，经过酚-氯仿抽提，使RNA 与组织中的DNA和蛋白质分离开，达到分离提取总RNA的目的。