核酸分离纯化技术共70页

核酸的分离纯化技术从细胞中提取核酸后，仍混杂着蛋白质、多糖和各种大小分子核酸同类物。

除去这些“杂质”的过程，也就是核酸提纯过程。

在核酸的分离纯化时，为防止核酸大分子的变性降解，必须在0～4℃的低温条件下操作。

核酸酶的水解作用，是过去制备具有活性核酸大分子的严重障碍，现普遍采用加入去污剂或加入EDTA、8-羟基喹啉、柠檬酸钠以除去核酸酶的激活剂Mg2+，就可以抑制核酸酶的活性，保证在提纯过程中核酸大分子的完整。

关于核酸分离纯化阶段中除去多糖、蛋白质及不同类型核酸之间分离的一些方法，分别介绍如下：（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化学性质与核酸有许多相似之处，常在提取液中残存下来。

除去的方法常有：①取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死，可使细胞内肝糖元大大减少。

②加入淀粉酶，将大分子多糖分解为小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去。

③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机层中。

④以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离。

（2）蛋白质的除去：由于核酸在细胞内以核蛋白体形式存在，不论采用哪种方法提取核酸，蛋白质都不同程度地存在于体系中。

因此，除去蛋白质是核酸分离纯化不可避免的步骤。

常用方法有下列几种：①加入去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。

去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用，效果更加理想。

②氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶液中。

此法在分离纯化中也常反复使用。

③苯酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，DNA或RNA都可以进入水相，蛋白质则沉淀于酚层，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA 或DNA，残余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去。

（3）不同类型核酸的分离：两种类型核酸的制备过程中，DNA制品中混杂着少量RNA或RNA制品中混杂着少量DNA是经常发生的。

Kanamycin resistance gene
Stanley Cohen & Annie Chan
Plasmi d
pSC10 1
Tetracycline resistance gene
E. coli transformed with recombinant plasmid
Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycline
（五）核酸的保存
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前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
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22
一、核酸分离、纯化原整版课件ppt
10
一把特殊的剪刀 —限制性内切酶的发现
阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)， 获1978年诺贝尔生理学和医学奖
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11
Herbert Boyer, Stanley Cohen 1972年获得第一 个重组DNA分子 (实现不同来源 DNA的重组)
1 意义
遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸 的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其 他生物大分子结合的方式。
2 分离核酸原则：
1）温度不要过高；
2）控制一定的pH值范围(pH值5-9);
3）保持一定的离子强度;
4）减少物理因素对核酸降解的机械剪切力.
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（二）防止核酸的生物降解

前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
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核酸的分离纯化优秀课件
一、核酸分离、纯化原则
（一）保持核酸分子一级结构的完整性
1 意义
遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸 的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其 他生物大分子结合的方式。
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General process of gene engineering
1. 从生物有机体基因组中， 分离出带有目的基因的DNA片 段。
2. 将带有目的基因的外源DNA片段连 接到能够自我复制的并具有选择记号 的载体分子上，形成重组DNA分子。
3. 将重组DNA分子转移到适当的受体 细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增 殖。 4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出 获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛 核酸的分离纯选化出优秀已课件经得到扩增的目的基因。
1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA 侵染细菌实验
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2. 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交 替问题；
Rosalind Franklin拍出 了第一张 能反映DNA美丽双螺旋结构的X
射线照片
X-ray source
（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-
Ribonucleoside Complex, VRC)
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2.4.2 溴乙锭荧光法测定核酸的含量
原理：DNA.RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA.RNA样品在紫外光激发 下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA 溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。
注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。
一般强调, 核酸沉淀在低温长时间下进行。 低温长时间沉淀, 易导致盐与DNA共沉淀, 影响以后的实验。一般使用0℃冰水, 1015min, DNA样品足可达到实验要求。
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2.4 核酸的浓度测定
2.4.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量 前提: 核酸样品要较纯，无显著蛋白质、 酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应 大于0.25 μg/ml 。 结论: 在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸 光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链 DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L 的MgCl2。
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（4）精胺
精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀 DNA。 原理是:
精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝 缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质 杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。
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2.3.3 核酸沉淀的温度和时间
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2.3 核酸的沉淀
• 重新调整核酸的浓度, 起到浓缩核酸的作用； • 去除溶液中某些盐离子与杂质； • 改变核酸的溶解缓冲液。
DNA纯化柱
核酸提取（离心柱型） 利用硅胶膜特异吸附核酸
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2.3.1 核酸沉淀的盐类及浓度
当核酸溶液的pH值大于4时, 核酸分子呈多聚阴离子 状态, 它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中 不溶解, 也不会被有机溶剂变性。

（2）异丙醇 ）
优点： 优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的 DNA样品沉淀 一般不需低温长时间放置。 样品沉淀。 DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点： 缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀． DNA共沉淀 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70 乙醇漂洗数次。 70％ 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
(2) DEPC(二乙基焦碳酸盐 (C2H5OCOOCOOC2H5) 二乙基焦碳酸盐) 二乙基焦碳酸盐
粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。
作用机制：与蛋白质中 结合使蛋白变性 结合使蛋白变性。 作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。 使用注意： 使用注意： 1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。 ） 也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。 但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。 ～ 2）容易降解，保存在4 ℃或液氮中； ）容易降解，保存在 或液氮中； 3）提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿 ℃ 2 h。 ） 浸泡器皿37℃ 时 浸泡器皿 。 4）剧毒。 ）
1.1.2 分离核酸原则： 分离核酸原则：
1）温度不要过高； 温度不要过高； 不要过高 控制pH 范围(pH pH值 (pH值 2）控制pH值范围(pH值5-9); 保持一定离子强度 离子强度; 3）保持一定离子强度; 减少物理因素对核酸的机械剪切力 机械剪切力. 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
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2.2
核蛋白的解聚、 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电 吸力(核酸与碱性蛋白的结合) 吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非 极性的范德华力。 极性的范德华力。 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合 最困难 的蛋白质分开，同时避免核酸降解。 的蛋白质分开，同时避免核酸降解。

性； ❖ 根据电泳条带的数目、位置和形状判定,RNA分子可以
通过荧光强度强弱来判定有无降解 ❖ 基因组DNA如果发生降解,电泳图呈拖尾状
5 核酸的鉴定与保存
DNA的降解
5 核酸的鉴定与保存
③ 完整性鉴定
完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中,原核生 物5S、16S、23S3条带；真核生物：5S和5.8S、18S、 28S3条带；而且3条带荧光强度应呈特定的比值 ❖ 沉降系数大,电泳迁移率低,荧光强度高 ❖ 沉降系数小,电泳迁移率高,荧光强度低
核酸的分离纯化技术
概述
✓ 核酸 nucleic acid 是遗传信息的携带者,是基因表达 的物质基础
✓ 无论是进行核酸结构还是功能研究,首先需要对核 酸进行分离和纯化
✓ 核酸样品质量将直接关系到实验的成败
1、核酸分离、纯化原则
1 保持核酸分子1级结构的完整性 1.意义：遗传信息全部储存在1级结构之中,核酸的—
➢TE的pH为8.0时,DNA的脱氨反应减少,pH低7.0时DNA 易变性
➢长期保存样品中可加入1滴氯仿
5 核酸的鉴定与保存
2. 核酸的保存——RNA的保存
➢RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc pH5.2 或双蒸灭菌 水中,-70℃保存 ➢长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; ➢在RNA溶液中,加1滴0.2 mol/L VRC 氧钒核糖核苷 复合物 冻贮于-70℃,可保存数年
➢ 注意：此法的比较主要基于目测,是估计水平
EB与DNA的结合
5 核酸的鉴定与保存
②纯度鉴定
紫外分光光度法： 主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的
污染 比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳
5 核酸的鉴定与保存

核酸提取方法——分离与纯化
——盐析法
产量较低，但方法简单，比较酚氯仿方法无化学危害；
同样不适合大规模自动化提取。
提取好的DNA用蛋白酶处理纯度会提高。
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
核酸提取方法——分离与纯化
每一步骤又可由多种不同的方法单独或 联合实现。
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核酸提取方法——细胞裂解
细胞裂解可通过以下几种方法实现：
物理作用 化学作用 酶作用 （生物作用）
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碱性pH环境：强碱(NaOH) 或碱性缓冲液 ( TE、
STE 等)
在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋 白质和多糖沉淀,核酸释放到水相；某些缓冲液中的一些金属离 子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子 Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。
核酸提取方法——分离与纯化
——硅胶吸附法
产量较低，纯度很好； 也能造成大片段核酸的损伤； 对极小片段核酸提取不够好； 简单方便，可进行自动化处理。
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核酸提取方法——分离与纯化
——硅胶吸附法
1、细胞裂解和酶处理同前述；

核酸分离纯化
主要内容
前言 1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.2. 防止核酸的生物降解
2 分离提取核酸的主要步骤
2.1 细胞的破碎 2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 2.3 核酸的沉淀 2.4 核酸的浓度测定 2.5 核酸的保存
（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-
DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点：
易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
（3）聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。 低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀， 影响以后的实验。一般使用0℃冰水，1015min， DNA样品足可达到实验要求。
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2.4 核酸的浓度测定
2.4.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、 琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml 。 结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度 相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
2.4.2 溴乙锭荧光法测定核酸的含 量
原理：DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基 平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，可 发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使 用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照， 可比较出被测DNA溶液浓度。 注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。

三、核酸的鉴定与保存
2、纯度鉴定 ⑴ 紫 外 分 光 光 度 法 ： 该 法 主 要 通 过 A260 与 A280
的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升 高与
降低均提示不纯。 在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280
纯RN第A25的页/共A12562页0/A280比值为
三、核酸的鉴定与保存
1. DNA或RNA的定量 OD260相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸
三、核酸的鉴定与保存
• 完整或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带 荧光强度积分应呈特定的比值，沉降系数大的 核酸区带，电泳迁移低，荧光强度积分高；反 之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分 低。
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三、核酸的鉴定与保存
• 一般而言，28S（23S）RNA的荧光强度约为 18S（16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降 解。若 在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA 的污染。
75%的乙醇洗涤去除
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三、核酸的鉴定与保存
（一）核酸的鉴定 （二）核酸的保存
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三、核酸的鉴定与保存
（一）核酸的鉴定 1、浓度鉴定 2、纯度鉴定 3、完整性鉴定
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三、核酸的鉴定与保存
1、浓度鉴定 ⑴ 紫外分光光度法：该法是基于核酸分子 中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸 收 紫外线，其最大吸收波长为260nm。
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第五章 核酸的分离纯化
核酸分离纯化的原则 一、 保持核酸一级结构的完整性 二 、尽可能提高核酸制品的纯度
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提取DNA总的原则

但对5SRNA、tRNA及多糖不产生沉淀。一般不需在低温条件下长时 间放置。其缺点是易使盐类与DNA共沉淀；在DNA沉淀中的异丙醇 难以挥发除去，所以常规需要70%乙醇漂洗DNA沉淀物。 5. 室温下放置16h或65℃放置1h, 可加快基因组DNA沉淀的溶解。
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核酸的鉴定与分析
紫外分光光度法可用于确定核酸的浓度及纯度。
000rpm×10min。 5. 吸取上层水相350μl置一新Ep管中，加纯异丙醇200μl, 混
匀。 6. 室温放置15min, 离心14 000rpm×12min。
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STEP 5
Water phase (DNA)
proteins precipitate
chloroform /isoamyl alcohol (lipids)
Water phase(DNA)
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7. 小心弃去上清，再加37%异丙醇（或70%乙醇）1 ml(勿 摇动)，离心14000rpm×12min.
8. 小心弃异丙醇（或乙醇），于室温敞口放置直至可见的 痕量液体挥发殆尽。
9. 加50μl TE缓冲液溶解DNA, 以琼脂糖凝胶电泳鉴定或20℃保存。
核酸的分离纯化和鉴定
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核酸包括DNA、RNA，在细胞中都与蛋白质结合 而存在。
分离纯化核酸总的原则 :
1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研究核酸
结构和功能的基础；
减少化学、物理、生物因素对核酸的降解： 避免过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏；
避免机械剪切力以及高温煮沸； 抑制DNase或RNase的活性； 2、排除蛋白质、脂类、糖类等分子的污染。
思考题
1、分离核酸的基本原则包括哪两方面？ 2、试比较用EB进行DNA凝胶电泳前（加在上样