下载文档原格式
狂犬病毒PV-2061株的病毒滴度测定方法的研究发表时间：2018-11-22T13:05:51.323Z 来源：《医药前沿》2018年27期作者：李爽1 姚宇1 李鹤1 田威2（通讯作者）[导读] 建立狂犬病毒PV-2061株病毒滴度的快速、准确的检测方法。
方法：取12批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品李爽1 姚宇1 李鹤1 田威2（通讯作者）（1辽宁成大生物股份有限公司辽宁沈阳 110179）（2沈阳药科大学生命科学与生物制药学院辽宁沈阳 110015）【摘要】目的：建立狂犬病毒PV-2061株病毒滴度的快速、准确的检测方法。
方法：取12批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品，分别采用蚀斑法、免疫荧光法检测病毒滴度，与小鼠脑内注射法进行比较，验证其检测结果的相关性。
另取一批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品，用蚀斑法和免疫荧光法重复检测6次，比较两种实验方法的精密性。
结果：蚀斑法和免疫荧光法测得的结果与小鼠脑内注射法之间呈正相关性;重复测定同一病毒样品，免疫荧光法的变异系数更低，表明免疫荧光的重复性更好。
结论：以细胞法替代小鼠法检测狂犬病毒的毒力是可行的。
免疫荧光法检测病毒滴度，快速、准确、精密度好，为狂犬病毒PV-2061株的疫苗的研究奠定了基础。
【关键词】狂犬病病毒；免疫荧光法；蚀斑法【中图分类号】R373.9 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）27-0251-02Determination of virus titer of rabies virus PV-2061 strain Li Shuang 1,Yao Yu 1,Li He 1,Tian Wei 2 (Corresponding author)1. Liaoning Cheng Da biological Limited by Share Ltd, Shenyang , Liaoning 1101792. School of life sciences and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Liaoning 110015【Abstract】Objective To establish a fast and accurate method to detect the titer of the PV-2061 strain of rabies virus. Methods The virus samples of rabies virus PV-2061 strain of 12 batches were measured by plaque assay and immunofluorescence, and compared with the intracerebral injection in mice to verify the correlation of the test results. A sample of rabies virus PV-2061 strain was also repeated for 6 times by plaque assay and immunofluorescence. The accuracy of the two methods was compared. Results The results of plaque assay and immunofluorescence were positively correlated with the intracerebral injection in mice; Repeated determination of the same virus sample showed that the coefficient of variation of immunofluorescence method was lower, indicating that immunofluorescence was more reproducible. Conclusion It is feasible to detect the virulence of rabies virus by cell method instead of mouse method. The detection of virus titer by immunofluorescence is rapid, accurate and precise, which lays the foundation for the research of vaccine against rabies virus PV-2061 strain.【Key words】Rabies virus; Immunofluorescent assay;Plaque assay狂犬病，俗称恐水病，是一种由狂犬病病毒感染引起的人兽共患传染病，一旦感染发病，病死率高达100%。
狂犬病病毒实验室检测方法摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。
一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。
现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。
关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。
RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。
脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎100%。
据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。
尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。
中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。
检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。
下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。
1、狂犬病病毒形态特征RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因1 型，单股负链RNA病毒。
电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。
病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。
病毒蚀斑技术病毒蚀斑，又称空斑，是指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。
将适当稀释的病毒悬液接种敏感的单层细胞，再在单层细胞上覆盖一层固体介质，例如琼脂糖、甲基纤维素等，则当病毒在最初感染的细胞内增殖后，由于固体介质的限制，只能进而感染和破坏邻近的细胞。
经过几个这样的增殖周期，就将形成一个局限性的肉眼可见的变性细胞区，直径小到1～2mm，大至3～4mm，这就是蚀斑。
某些病毒在一般单层细胞培养内不形成CPE，但是却可在加入覆盖层后形成可见的蚀斑。
因此可用蚀斑方法进行此类病毒的检测。
混悬于琼脂等固体介质中的稠密细胞，在接种病毒后，也可产生蚀斑。
为了便于观察，常在覆盖琼脂中加入使细胞着染的染料。
这些染料或着染死细胞而不染活细胞，如台盼蓝；或着染活细胞而不着染死细胞，如中性红。
中性红是蚀斑技术中最常应用的一种染料。
这种染料在中性时呈红黄色，偏碱时变黄，偏酸时呈玫瑰色。
在以中性红着染的细胞培养瓶内，当蚀斑长到1mm直径以上时，可在白色衬底上清楚看到红色背景中不着色的蚀斑。
某些病毒，例如新城疫的某些变异株和SV40病毒感染的细胞，其对中性红的亲和力反而高于未感染细胞，因此可形成红色蚀斑。
从理论上讲，一个病毒粒子可以形成一个蚀斑。
反过来说，每产生一个蚀斑，也就是说明原接种物中含有一个活的病毒粒子。
但是实际情况远非如此，因为并非每个病毒粒子都有感染和增殖的能力，操作过程中也常有许多病毒粒子灭活,而且即使是有增殖能力的病毒粒子，也不一定能够遇上合适的敏感细胞。
根据电子显微镜的观察，经常是几百个乃至上千个病毒粒子才能形成一个蚀斑，即使在最好的试验条件下，例如应用增殖力和抵抗力较高的病毒、敏感的细胞以及十分严密和适当的实验条件，也需几十个病毒粒子才能产生一个蚀斑。
因此，以蚀斑形成单位(PFU)表示病毒悬液中的感染病毒浓度，似乎更为确切，例如说某个病毒悬液每ml含有108个PFU……等等。
病毒蚀斑技术的原理，实际上就是将病毒悬液作连续的10×稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂，待其出现蚀斑后计数，即可算出病毒悬液中每ml所含的蚀斑单位。
消毒技术(主管技师)：相关专业知识考试试题（题库版）1、单选乙型和丙型肝炎的传播主要是通过（）A.空气B.土壤C.食品，水D.血液，体液E.动物正确答案：D参考解析：霍乱、甲型和戊型肝炎可主要通过被污染的食品和（江南博哥）饮用水而传播或流行；流行性腮腺炎可由患者和健康带毒者的唾液或呼吸道分泌物的飞沫经空气传播；获得性免疫缺陷综合征（AIDS）、乙型和丙型肝炎主要是通过患者和无症状病毒感染者的血液、体液而传播。
2、单选检测病毒核酸可采用（）A.免疫荧光ELISAB.免疫荧光中和实验C.RT-PCRD.组织培养观察细胞病变（CPE.中和实验E.原位杂交正确答案：C3、单选狂犬病毒所致的疾病是（）A.黑死病B.恐水病C.军团病D.莱姆病E.钩端螺旋体病正确答案：B参考解析：狂犬病毒能感染人类引起人的狂犬病，表现为急性、进行性、几乎不可逆转的脑脊髓炎，因其有恐水的临床特征，又称恐水病。
4、单选结核菌素试验的应用价值不包括（）A.用于选择卡介苗接种对象B.用于接种卡介苗免疫效果的测定C.结核病诊断的依据D.测定肿瘤病人的非特异性细胞免疫功能E.接种过卡介苗的人群中调查结核病的流行情况等正确答案：E参考解析：结核菌素试验的应用包括：评价卡介苗接种前后结核免疫功能的转变，作为婴幼儿结核病诊断的参考，测定肿瘤病人的非特异性细胞免疫功能，在未接种过卡介苗的人群中调查结核病的流行情况等。
5、单选涂片镜检钩端螺旋体的染色方法是（）A.革兰染色法B.镀银染色法C.抗酸染色法D.吉姆萨（GiemsA.染色法E.美蓝染色法、Albert法和Neisser法正确答案：B6、单选鼠疫菌的微生物分类隶属是（）A.变形杆菌属B.埃希菌属C.耶尔森菌属D.克雷伯菌属E.肠杆菌属正确答案：B参考解析：鼠疫菌的微生物分类隶属是：原生生物界，原核细胞型微生物，革兰阴性兼性厌氧菌类，肠杆菌科，耶尔森菌属。
7、单选用胰酶消化血液或肝脏培养鼠疫菌，在下列何种条件下可获最佳的培养结果（）A.pH6.9～7.1，温度16～20℃B.pH6.9～7.1，温度26～28℃C.pH7.9～9.1，温度26～28℃D.pH2.6～4.6，温度16～20℃E.pH2.6～4.6，温度26～28℃正确答案：B参考解析：用胰酶消化血液或肝脏培养鼠疫菌，在pH6.9～7.1和温度26～28℃时可获最佳的培养结果。
病毒蚀斑技术病毒蚀斑，又称空斑，是指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。
将适当稀释的病毒悬液接种敏感的单层细胞，再在单层细胞上覆盖一层固体介质，例如琼脂糖、甲基纤维素等，则当病毒在最初感染的细胞内增殖后，由于固体介质的限制，只能进而感染和破坏邻近的细胞。
经过几个这样的增殖周期，就将形成一个局限性的肉眼可见的变性细胞区，直径小到 1 ~2mrp大至3~4mm这就是蚀斑。
某些病毒在一般单层细胞培养内不形成 CPE但是却可在加入覆盖层后形成可见的蚀斑。
因此可用蚀斑方法进行此类病毒的检测。
混悬于琼脂等固体介质中的稠密细胞，在接种病毒后，也可产生蚀斑。
为了便于观察，常在覆盖琼脂中加入使细胞着染的染料。
这些染料或着染死细胞而不染活细胞，如台盼蓝；或着染活细胞而不着染死细胞，如中性红。
中性红是蚀斑技术中最常应用的一种染料。
这种染料在中性时呈红黄色，偏碱时变黄，偏酸时呈玫瑰色。
在以中性红着染的细胞培养瓶内，当蚀斑长到1mm直径以上时，可在白色衬底上清楚看到红色背景中不着色的蚀斑。
某些病毒，例如新城疫的某些变异株和 SV40病毒感染的细胞，其对中性红的亲和力反而高于未感染细胞，因此可形成红色蚀斑。
从理论上讲，一个病毒粒子可以形成一个蚀斑。
反过来说，每产生一个蚀斑，也就是说明原接种物中含有一个活的病毒粒子。
但是实际情况远非如此，因为并非每个病毒粒子都有感染和增殖的能力，操作过程中也常有许多病毒粒子灭活，而且即使是有增殖能力的病毒粒子，也不一定能够遇上合适的敏感细胞。
根据电子显微镜的观察，经常是几百个乃至上千个病毒粒子才能形成一个蚀斑，即使在最好的试验条件下，例如应用增殖力和抵抗力较高的病毒、敏感的细胞以及十分严密和适当的实验条件，也需几十个病毒粒子才能产生一个蚀斑。
因此，以蚀斑形成单位(PFU)表示病毒悬液中的感染病毒浓度，似乎更为确切，例如说某个病毒悬液每ml含有10 8个PFU••…等等。
病毒蚀斑技术的原理，实际上就是将病毒悬液作连续的10 X稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂，待其出现蚀斑后计数，即可算出病毒悬液中每ml所含的蚀斑单位。
狂犬病的实验诊断方法狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的致命的神经系统疾病。
早期的病毒检测方法依赖于动物的大脑组织或脊髓液样本，但这些方法不仅需要病毒在大脑中进行复制，而且也有传播病毒的风险。
因此，近年来，研究人员已经发展出一些实验室诊断方法来检测狂犬病病毒。
目前，主要的实验室诊断方法包括直接免疫荧光试验（Direct Immunofluorescence Assay，DFA）、滴度测定法（VirusNeutralization Test，VNT）、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）和免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，IHC）。
直接免疫荧光试验是一种常用的狂犬病病毒检测方法。
它使用特异性单克隆抗体来识别狂犬病病毒的抗原。
通过在疾病动物的脑组织切片上施加单克隆抗体并且经过染色，病毒抗原会与抗体结合形成荧光染色，并通过荧光显微镜观察。
这种方法的优点是快速和准确，可以在病毒分离和动物死亡之前得出结果。
然而，它需要经过训练的实验室技术人员进行操作，并且有时可能出现假阴性结果。
滴度测定法是通过将狂犬病病毒与病毒中和抗体混合来测定病毒的滴度。
该方法基于当病毒与病毒中和抗体结合时，不能侵入新宿主细胞。
这种方法需要一定时间，通常需要3-5天才能得到结果。
这种方法的优点是可以测定病毒的效价，并且可以用于评估深度冷冻疫苗的效果。
然而，该方法需要繁琐的操作步骤，并且对实验室条件要求较高。
聚合酶链式反应是一种在检测狂犬病病毒中应用广泛的方法。
它通过扩增病毒RNA或DNA的特定区域来检测病毒。
首先，通过提取样品中的RNA或DNA，然后进行逆转录反应（对于RNA）或核酸扩增反应（对于DNA）以合成相应的cDNA或DNA，并最后通过PCR扩增目标区域。
这种方法极其敏感，可以检测到非常低浓度的病毒，但在操作过程中需要谨慎处理以避免污染。
此外，PCR方法已经逐渐从传统的实验室检测中发展到快速诊断方法，如实时定量PCR。
应用病毒蚀斑法滴定狂犬病毒毒力的方法验证
摘要：目的：建立病毒蚀斑法作为狂犬病毒毒力滴定的比较精确的方法。
方法：我们采用比较法，平行测定35批狂犬病vero细胞疫苗，比较病毒蚀斑法与nih小鼠法测定狂犬病毒滴度的结果。
结果：病毒蚀斑法和nih小鼠法具有一定相关性，且判定结果时间由nih小鼠法测定的21天缩短为病毒蚀斑法测定的10天。
结论：病毒蚀斑法具有快速、经济、操作简单、重复性好等诸多优点，适用于狂犬疫苗生产研究中的病毒毒力滴定。
关键词：bhk细胞vero细胞人用狂犬疫苗病毒滴定蚀斑法
pfuld50
【中图分类号】r4【文献标识码】a【文章编号】1671-8801（2013）04-0007-02
狂犬病毒（rv）属于弹状病毒科狂犬病毒属，是人和动物狂犬病的病原体。
外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链rna。
能使各种温血动物如狼、狐、猫、牛、羊、马、猪等感染狂犬病。
在狂犬病毒的疫苗生产和研制过程中，对病毒毒力的测定是很重要的一步。
世界卫生组织的《生物制品规程》狂犬病毒抗原滴度检测的方法建议采用小鼠法和其他适宜的生物学方法。
一般实验室采用小鼠ld50法测定，但是由于动物实验需要鉴定员有较高的操作技术，且动物存在个体差异，测定费用较高，测定结果的时间较长等不足之处，国内外已经开始尝试使用蚀斑法进行毒力
测定。
细胞培养形成单层后接种病毒形成的蚀斑技术，是较精确地测定病毒感染力的方法。
将各稀释度的病毒悬液接种到平皿或细胞培养板中的单层细胞上，先让细胞吸附病毒一定时间，然后在单层细胞上覆盖营养琼脂或者甲基纤维素培养基以限制病毒复制释放后的
相对移动，只能感染周围细胞。
被感染的细胞由于退化或死亡细胞不能摄入染料，从而形成肉眼可见的不染色区域，称为蚀斑形成单位（pfu）。
狂犬病毒的蚀斑形成主要决定条件有两个，一是要有适应细胞培养的病毒株，二是要有敏感的细胞株。
本实验室通过大量的实验证明bhk细胞对狂犬病毒（pm株）颇为敏感，使用bhk细胞测定毒力滴度比vero细胞上接种病毒测定结果高2—3倍，且出斑清晰可数，现将实验结果报告如下：
1材料和方法
1.1材料。
1.1.1病毒株。
狂犬病毒pm株购于美国atcc，于vero细胞上适应传代后的病毒液。
1.1.2细胞株。
bhk细胞株系国外引进，保存于液氮中。
实验前，经复苏、传代、无菌试验，确认无支原体及其它微生物污染。
1.1.3生长液、维持液、覆盖液。
1.1.3.1生长液配方。
1.2方法。
1.2.1蚀斑滴定法。
将病毒样品在冰浴中用病毒维持液作10倍系
列稀释，取10-1-10-6六个稀释度各0.2ml分别接种于12孔细胞培养板内的bhk细胞单层，每个稀释度平行接种2孔，10-1接种一孔，最后留一孔作对照（ck）。
37℃吸附1小时后每孔加入1%的甲基纤维素覆盖物，继续在37℃孵育10天后用甲醛固定，吸出覆盖物，用1%的结晶紫染色30min，水冲洗自然风干后数斑并计算病毒滴度。
1.2.2小鼠ld50滴定方法。
将病毒样品在冰浴中用病毒维持液作10倍系列稀释，取10-1-10-6各稀释度病毒液分别颅内接种10-12克昆明小鼠6只，每只脑内0.03ml，逐日观察并于第7天后记录小鼠发病及死亡数至第21天，用《中国生物制品规程》2005版中reed 和muench法计算每批病毒的ld50值。
2结果
2.1蚀斑滴定法。
2.2pfu与小鼠ld50的关系。
蚀斑法与nih小鼠法平行测定35批狂犬病vero细胞疫苗，结果表明用蚀斑法滴定的毒力结果略高于nih小鼠法，二者呈正相关系（见图3），可以考虑用蚀斑法替代nih 小鼠法测定狂犬病vero细胞疫苗的病毒滴度。
3结论
病毒蚀斑法不仅具有快速、经济、操作简单、重复性好等诸多优点，而且可以避免使用nih小鼠法时小鼠间个体差异，其测定结果更为可靠。
可以考虑通过进一步探索出斑条件和方法使其测定的病毒滴度能更真实的反映待测样品的病毒感染滴度，从而替代nih小
鼠法测定病毒疫苗的滴度。
4讨论
本实验室实验结果阐明了狂犬病毒在bhk细胞上形成蚀斑的若干因素。
实践中须注意的是bhk细胞虽然对多种病毒易感，而且细胞也容易传代培养，但细胞维持期短暂。
采用较低温度（33℃）培养是延长细胞维持期的措施之一，但其出现蚀斑的时间也相应延长。
我们在实验中适当提高维持液的ph，减少维持液中的小牛血清含量以及每隔2天左右更换维持液的方法，可使病毒在bhk细胞上较为稳定地出现蚀斑。
文献介绍用1%的石炭酸复红甲醇液与1%结晶紫甲醇液对感染单纯疱疹病毒的人胚肌皮单层细胞进行染色观察蚀斑形成，我们简化后仅采用1%结晶紫甲醇液进行细胞染色，观察狂犬病毒蚀斑的形成也取得良好的效果。
实际操作中要注意的是，在滴加染色液时必须均匀地使细胞着色，否则细胞染色深浅不匀，有损细胞的显示。
在细胞染色过程中，用流水冲洗残余染色液时，水流切勿直接冲及细胞面，以免将细胞层冲散影响蚀斑的观察。
综上所述，应用病毒蚀斑法滴定狂犬病毒毒力，具有快速、廉价、简便、重复性高、不用动物等优点是替代小鼠ld50滴定方法测定狂犬病毒毒力可行方法。
参考文献
[1]kamesaburo yoshino et al. plague assay of rabies virus in chick embryo cells.arch virusforsch 1966；18：370
[2]肖泽帅等.狂犬病毒甲基纤维素蚀斑及蚀斑减少中和试验的
建立，实验和临床病毒学杂志，1987，1：11
[3]严子林等.狂犬病毒蚀斑方法的建立。
病毒学杂志，1988，2：142
[4]李宏玲等.用细胞病变及蚀斑形成滴定狂犬病毒方法的建立，中华微生物学和免疫学杂志，1990，10（3）：197
[5]郑民实等.单纯疱疹病毒空斑形成影响因素的研究.病毒学杂志.1987；8：22-27vero细胞广泛应用与病毒疫苗的生产
[6]wiktor tj，et al；tissue culture b tech in rabies who：geneva，1973；109
[7]李淑云等.应用蚀斑法滴定黄热疫苗效力.中国生物制品学杂志，2000，13（3）：180-182
[8]严家新等.用细胞培养法取代动物实验法检定狂犬病疫苗.中国生物制品学杂志.2003，16（3）：192-193
[9]郑筱萸等.《中华人民共和国药典》2005版.三部
[10]《世界卫生组织生物制品规程》.who trs.840，p.202-204，1994。
