7-1第七章 食品微生物检验-菌落总数测定

第七章食品中真菌的检验（酵母菌和霉菌的检验）目的要求：掌握食品中霉菌、酵母菌总数的测定方法重点难点：菌落计数课时安排：2教学过程：一、检验程序检样→处理→稀释→平板分离培养→菌落计数→报告二、操作要点（一）采样1、粮食(包括粮库贮粮，粮店或家庭小量存粮)样品的采集，可根据粮囤或粮垛的大小和类型，分层定点取样，一般可分三层五点，或分层随机采取不同点的样品，充分混合后，取500g左右送检。

小量存粮可使用金属小勺采取上、中、下各部位的混合样品。

2、海运进口粮的采样：每一船仓采取表层、上层、中层及下层四个样品，每层从五点取样混合，如船仓盛粮超过10000t，则应加采一个样品。

必要时采取有疑问的样品送检。

3、谷物加工制品(包括熟饭、糕点、面包等)、发酵食品、乳及乳制品以及其他液体食品，用灭菌工具采集可疑霉变食品250g，装入灭菌容器内送检。

（二）样品处理（稀释）1、以无菌操作称取检样25g(或25mL)，放人含有225mL灭菌水的玻塞三角瓶中，振摇30min，即为1：10稀释液。

2、用灭菌吸管吸取1∶10稀释液10mL，注入试管中，另用带橡皮乳头的1mL灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。

3、取1mL1∶10稀释液注入含有9mL灭菌水的试管中，另换一支1mL灭菌吸管吹吸5次，此液为1∶100稀释液。

（三）培养倒置于25～28℃温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。

（四）、计数报告选取菌落数10～150之间的平板进行计数。

（稀释度选择和菌落报告方式参考菌落总数的测定）小结：主要介绍了食品中酵母菌和霉菌总数的测定方法思考题：列表说明霉菌、酵母菌数的测定与菌落总数的测定有什么相同的地方和不同的地方。

食品微生物学检验菌落总数测定一、定义菌落总数是指样品经过处理，在一定条件下培养后(如培养基成分、培养温度和时光、pH、需氧性质等)，所得1mL(g)检样中形成的微生物菌落总数。

菌落总数不等同于细菌总数，有两方面的缘由：一方面，每种细菌生长时对环境条件的要求都不太一样，如厌氧菌和嗜冷菌在菌落总数测定条件下难以生长繁殖，有特别养分要求的一些细菌也受到了限制，因此，所得的结果，只反映一群在一般养分琼脂中发育的、嗜温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。

另一方面，细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在平板上浮现的菌落可能来源于单个细胞，也可能来源于细胞块。

二、卫生学意义菌落总数是食品卫生指标中的重要项目，主要作为判定食品被污染程度的标记。

通常认为，食品中菌落总数越多，被致病菌污染的可能性越大。

菌落总数的多少在一定程度上标记着食品卫生质量的优劣，但不能单凭菌落总数一项指标来评定食品卫生质量的优劣，必需协作大肠菌群和致病菌项目的检验，才干做出比较全面精确的评价。

三、检验办法根据GB4789.2-2016举行，标准规定了食品中菌落总数(aerobic plate count)的测定办法。

菌落总数的检验程序见图4-4。

图4-4菌落总数的检验程序四、注重事项 (1)要有“无菌操作”的概念。

所用玻璃器皿必需是彻低灭菌的，剪刀、镊子等器具要举行消毒处理，假如样品有包装，应用70%在包装开口处擦拭后取样，全部操作应该在超净工作台或经过消毒处理的无菌室中举行。

(2)应注重取样的代表性，液体样品取样前须先振摇，固体样品取样时宜多采几个部位，不要集中于一点。

(3)稀释液可选用灭菌生理盐水、蒸馏水或蛋白胨水(1g/L)，蛋白胨水最为合适，由于蛋白胨水对细菌细胞有更好的庇护作用。

假如对含盐量较高的样品举行稀释，则宜采纳蒸馏水。

(4)在做10倍递增稀释时，吸管或吸头插入样品匀液内不能低于液面2.5cm，以防吸管或吸头从稀释液内取出时有过多的液体黏附于管外。

食品微生物检验中菌落总数测定的注意事项介绍如下：
在食品微生物检验中，菌落总数测定是非常重要的一项。

以下是菌落总数测定的注意事项：
1.样品的制备要求：样品制备应该遵循相应的样品处理方法，保证样品的代表性和可
检出性。

2.培养基的选择：选择适当的培养基，要求菌落总数检测的准确性和有效性。

3.培养条件：菌落总数的测定需要适宜的培养条件，包括适宜的温度、湿度、通气等。

4.培养时间：菌落总数的测定需要适宜的培养时间，过短或过长都可能影响检测结果
的准确性。

5.培养基的存放条件：培养基的存放条件应符合要求，以保证培养基的质量和菌落的
生长。

6.检测设备的清洁与消毒：仪器和设备应经常清洁和消毒，以防止交叉污染。

7.操作人员的卫生要求：操作人员应穿戴干净的工作服，戴手套，避免污染样品或检
测设备。

总之，菌落总数测定的注意事项主要涉及样品制备、培养基选择、培养条件、培养时间、培养基的存放条件、检测设备的清洁与消毒、操作人员的卫生要求等方面。

只有严格遵守相关的要求和规定，才能得到准确可靠的检测结果。

探究食品微生物检验中菌落总数测定的注意事项1.样品密闭保存在取样过程中，要尽量避免空气等外界因素的影响，样品必须密闭保存。

一般样品应当在到达实验室后尽快进行检验，以免样品受外界影响导致结果不准确。

如果无法及时检验，则可以将样品冷藏或者冷冻，但是也需要注意将样品密封好，以避免外界细菌的污染。

2.采样量的重视采样量对于总菌落数的测定是非常重要的。

一般情况下，菌落总数的测定一般要求采样量在1-5g之间，但是如果样品比较稀疏，则需要增加采样量，以确保菌落总数的准确性。

另外，在进行样品采集的时候，需要使用无菌工具，并且避免手部与样品接触，以免造成样品的污染。

3.温度和时间的掌控细菌的生长繁殖受到温度和时间的影响，针对食品微生物检验中菌落总数测定，也需要掌控恰当的温度和时间，以获得准确可靠的结果。

通常情况下，菌落总数的测定需要在30°C ± 1°C的温度下进行，持续48个小时，如果菌落总数比较高，则可以适当延长测定时间，但是通常测定时间不应当超过48小时。

4.选择合适的培养基依据不同的食品种类和样品的特性，需要选择合适的培养基，以保证菌落总数的测定准确可靠。

在选择培养基的时候，需要考虑菌落总数测定的灵敏度和特异性，并且需要注意培养基的配制和保存条件，以避免培养基失效。

5.样品的处理和消毒在进行食品微生物检验中，样品的处理和消毒是非常重要的，以避免外界因素的干扰。

通常情况下，需要用适当的方法对样品进行消毒和处理，并确保采样和样品处理的全过程无菌操作。

如样品含有硬壳，应先将其表面用肥皂水清洗干净，并用70%的酒精或经消毒的火柴棒或火烤器在表面进行消毒。

如果样品是炊后食品，可用蒸汽或高压杀菌，使其达到消毒的效果。

如果样品含有高浓度的盐、糖或醋等食品添加剂，需要在消毒前进行浓度调整，以确保检验的准确性。

总之，食品微生物检验中菌落总数的测定需要全过程无菌操作，以确保样品不受外界因素的影响，并且需要在采样、培养基选择、样品处理和等方面注意细节，以保证检验结果的准确、可靠、科学和客观。

食品微生物检测：菌落总数测定标准要点解析一、称样（1）一般称量25g，由于称样量较大，标准中对于称样的准确性未作出明确规定，微生物室常用称样的电子天平最大允许误差为±0.1g，一般遵循“宜多不宜少”的原则，即实际称样时可根据样品情况称取超出25g（如硬质糖果等，检验人员应依据样品实际情况决定如何称样）；（2）对于部分食品添加剂已明确须称取1.0g的，则须严格精确称量。

二、样品稀释（1）固体或半固体：称取25g样品于均质袋中，加入已灭菌的生理盐水225g，稍捏碎（特别是糕点/面包及其他淀粉制品），放入拍击式均质器均质1min，此时即制备成1：10的样品匀液。

以移液器或灭菌吸取该液体至9mL灭菌生理盐水试管中，换上新的灭菌移液器枪头，缓缓吸取液体后反复吹打2次，此时即制备成1：100的匀液，以此类推，制备10倍系列稀释匀液。

（2）液体样品：直接吸取原液进行检验，稀释时可直接吸取1mL原液到9mL灭菌生理盐水试管中按照“固体或半固体”的方式稀释。

三、稀释度的选取液体样品可直接取原液进行检验；固体或半固体则必须依据检验经验，选取2-3个适宜稀释度进行检验（一般样品选取1：10，1：100，1：1000三个稀释度进行检验。

若遇到不常做的样品，可适当延长稀释度至1：100000甚至1：1000000）。

四、质量控制空白对照：分别吸取1mL灭菌生理盐水到平皿中做空白对照。

（若空白有菌落生长则该实验无效）。

五、平板计数琼脂（PCA）灭菌条件为121℃、15min。

一般情况下于500mL敞口锥形瓶（三角瓶）中配制400mL/瓶。

六、有时样品基质比较特殊，样品匀液有细小的颗粒与菌落不易区分，此时可采用如下方法进行区分：（1）配制1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑溶液（又称红四唑或红四氮唑，简称TTC），高压灭菌后避光冷藏备用。

红四唑灭菌条件为：121℃、20min；（2）待PCA琼脂培养基冷却至适宜倾注温度时，无菌加入上述TTC溶液2mL，充分摇匀（此时PCA中TTC浓度为0.005%）。

Apr. 2020 CHINA FOOD SAFETY 121分析与检测1　检验前的准备事项1.1　器皿灭菌处理为了保证测定结果的精确性，应当对检验所用的各类器皿、设备（如吸管、移液器等）做严格的消毒处理，避免这些器皿、设备携带细菌、微生物而影响检验结果。

另外，检验人员进入实验室前，应当换上经过严格消毒的防护服，戴上无菌口罩等，排除外界干扰因素[1]。

1.2　材料准备待检测的食品种类多样，有的是固体，还有的是液体；在固体中有的是溶于水的，还有的是不溶于水的。

为了方便检验，需要对这些样品材料提前做好准备。

例如将固体食品研磨成粉，提高其溶解性，避免菌落堆积，使菌落总数测定结果更加精确。

对于一些液体样品，还要检验其pH 值，如果pH 值明显偏酸性或偏碱性，也有可能会导致菌落难以在培养基上存活。

针对这种情况，检验人员应提前调节样品溶液的pH 值，使其尽量保持中性，为下一步的菌落培养与微生物检验提供良好的条件[2]。

2　制备稀释液的注意事项在制备稀释液之前，首先要准备好25 mL 的样品以及225 mL 经过灭菌处理的稀释液，将这两者进行混合并且搅拌均匀。

而后结合样品受污染程度以及食品卫生标准，来判断选择何种稀释度，并且围绕这一稀释度进行连续的递增稀释，其递增的幅度为10倍，在稀释时，为了保证稀释倍数的准确性，使用1 mL 的灭菌吸管进行稀释。

3　平板接种与培养的注意事项3.1　注入稀释液选取一个带盖的平底器皿，将制备好的稀释液注入到器皿中。

注意不要将器皿的盖子完全打开，而是打开一个小口。

先使用量筒，量取2 mL 稀释液，然后使用吸管吸取量筒内的稀释液，将吸管的一端从缺口处插入，约1 cm，让稀释液从缺口位置沿着器皿侧壁流下[3]。

3.2　加热琼脂块琼脂块是制作培养基的主要材料，需要将固体琼脂块加热融化。

高温会破坏琼脂块的营养，因此加热时应当选择50 ℃的水浴，保证温度适宜。

升温过程要缓慢，温度升高的过快会造成水汽凝结，这些冷凝水滴入培养基上，会加速细菌的繁殖。

食品中菌落总数的测定(一)菌落总数与食品卫生质量食品中菌落总数的测定,目的在下了解食品在生产过程中,从原料加工到成品包装受外界污染的情况;也可以应用这一方法观察在食品中繁殖的动态,确定食品的保存期,以便对被检样品进行卫生学评价提供依据.食品有可能被多种类群的微生物所污染,每种细菌都有它一定的生理特性,培养里应用不同的营养条件及其生理条件(如温度、培养时间、ph值、需氧性质等)去满足其要求, 才能分别将各种细菌培养出来。

但在实际工作中, 一般都只用一种常用的方法去作菌落总数的测定, 所得结果, 只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧菌落数.国家标准所规定的菌落总数(Aerobic bacterialcount)就是指食品工业检样经过处理,在一定条件下培养后,所得1g或1ml检样中所含细菌菌落的总数.食品中菌落的总数的多少,直接反映着食品的卫生质量.如果食品中菌落总数多于10万个,就足以引起细菌食物中毒;如果人的感官能察觉食品因细菌的繁殖而性变质时,细菌数大约已达到106~107个/g(或ml或cm2)。

食品的变质反映与菌落总数的增多有一定联系, 但有时食品中细菌含量很高, 即使已达到相当于同种食品已变质时的细菌数, 而食品并未有任何变质现象, 这种情况也是经常会遇到的。

有时食品遭受污染的程度不同特别严重严重, 食品中虽含有大量的细菌, 由于时间短暂或细菌系列条件不具备, 就见不到变质现象。

例如: 细菌难以生长的一些干制食品和冰冻食品, 它们含有细菌的多少, 就可以用表明这些食品在生产、运输、贮藏等过程中卫生管理的状况。

从食品卫生观点来看, 食品中菌落总数越多, 说明了食品质量越差, 也就应考虑到病原菌污染的可能性愈大；当菌落总数仅少量存在时, 则病原菌污染环境的可能性性就会降低, 或者几乎不存在。

但也有少数情况并不完全如此, 有人曾报道, 从市售的一批冰蛋制品中, 在所检出的菌落总数在5000个/g以下样品, 和其中仅含菌落总数380个/g的样品中, 均可分离出沙门氏菌, 并且都有大肠菌群存在。

菌落总数测定详细讲解一、茵落总数的概念和测定意义菌落(colony)是指细菌在固体培养基上发育而形成的能被肉眼所识别的生长物，它是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有细菌集落之称。

菌落总数是指在被检样品的单位重量(g)、容积(m1)或表面积(clni)内，、所含能于某种周体培养基上，在一定条件下培养后所生成的细菌集落的总数。

菌落总数主要是作为判定食品被细菌污染程度的标记，也可以应用这一方法观察食一中细菌的性质以及细菌在食品中繁殖的动态．以便对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据．二、茵落总数测定的几项说明1．菌落总数的测定。

是以检样中的细菌细胞和营养琼脂混合后，每个细菌细胞都能形成一个可见的单独菌落的假定为基础的。

由于检验中采用37℃于有氧条件下培养(空气中含氧约20％)，因而并不能测出每g或ml检样中实际的总活菌数，厌氧菌、微嗜氧菌和冷营菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的一些细菌也受到了限制，因此所得结果，只包括一群能在普通营养琼脂中发育、嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。

2．鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个，成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在营养琼脂平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因此平板上所得需氧和兼性厌氧菌菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容量或表面积内的菌落数或菌落形成单位数(colony forming units，CFU)报告之。

3．每种细菌都有它一定的生理特性，培养时，应用不同的营养条件及其他生理条件(如温度、培养时间、PH、需氧性质等)去满足其要求，才能分别将各种细菌都培养出来。

因此，要得到较全面的细菌菌落总数，应将检样接种到几种不同的非选择性培养基上，并培养在不同条件下，如温度，氧气供应等。

但国家颁发的食品卫生标准对不同食品的菌落总数的规定，都是根据用普通营养琼脂进行需氧培养所得的结果确定的，因此在食品的一般卫生学评价中并不要用几种不同的非选择性培养基培养。

食品微生物学检验菌落总数测定1 范围本标准规定了食品中菌落总数（Aerobic plate count ）的测定方法。

本标准适用于食品中菌落总数的测定。

2 术语和定义2.1 菌落总数aerobic plate count 食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL ）检样中形成的微生物菌落总数。

3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，30 ℃±1 ℃。

3.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。

3.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。

3.4 天平：感量为0.1 g。

3.5 均质器。

3.6 振荡器。

3.7 无菌吸管：1 mL （具0.01 mL 刻度）、10 mL （具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。

3.8 无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL。

3.9 无菌培养皿：直径90 mm。

3.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。

3.11 放大镜或/和菌落计数器。

4 培养基和试剂4.1 平板计数琼脂培养基：见附录A 中A.1 。

4.2 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.2 。

4.3 无菌生理盐水：见附录A 中A.3 。

5 检验程序菌落总数的检验程序见图图1 菌落总数的检验程序6 操作步骤6.1 样品的稀释6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或放入盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。

6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。