血栓与止血的质量控制
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血栓与止血检验的质量控制技术与方法浙江省人民医院检验医学中心费鲜明血栓与止血检验的基本内容血栓与止血检验(六个方面)血管内皮损伤检测vWF 、TM 等血小板检测PLT 、PAgT 、活化标志凝血系统检测凝血试验、凝血因子血液流变学检测血液黏度及相关参数抗凝活性检测AT 、PC纤溶活性检测纤溶成份、纤溶产物血栓与止血检验的常用技术与方法 凝固法免疫比浊法发色底物法干化学试剂法流式细胞术物理学方法手工法血栓与止血检验的质量控制方法目录凝血试验质量控制方法PAgT及PLT活化标志物测定质量控制方法 血液流变学检验质量控制方法血栓与止血试验的特殊性影响测定的因素众多:凝血网络易激活、凝血反应的复杂性、采血前到结果报告整个过程变异大。
测定对象含量低:远低于临床生化、免疫等测定的血浆蛋白。
定量测定参数少:多以时间和百分率为单位。
缺乏参考方法:仅FIB测定有(Jacobsson法)。
校准品溯源性差:准确性、精密度与临床生化检验有差距质量控制难度较大,应加强全面质量管理(分析前、中、后)分析前中后因素所致误差分布分析前因素:占总误差的46-68.2%;*分析后因素:占总误差的18.5-47%;*分析中因素:占总误差的<15%。
(*Errors in clinical laboratories or errors in laboratory medicine? Plebani M. Clin Chem Lab Med.2006; 44(6):750-9)分析前变异的影响临床医生对血栓与止血相关疾病的诊断与治疗很大程度依赖PT(INR),APTT,血小板功能、凝血因子以及D-D等的检测。
分析仪器的性能改善,血栓与止血试验结果错误大多数来自分析前---保证分析样本的质量非常重要。
分析前变异(检验者可控或不可控)无法客观、准确地反映患者的实际止、凝血功能,导致误诊或漏诊甚至误治。
分析前变异的影响血栓与止血试验结果的准确性对样本质量非常敏感:样本采集开始直接启动凝血与抗凝血过程。
凝血试验的质量控制流程凝血试验在临床中扮演着重要的角色,特别是在血栓和止血检测方面。
因此,规范凝血项目检测过程,提供及时、可靠和准确的检验结果至关重要。
以下是质量控制流程:一、试剂试剂包括凝血活酶含钙试剂(ThromborelS)、激活剂、氯化钙溶液、凝血酶试剂、D-DimerPlus试剂盒、缓冲液、乏因子血浆、SysmexClean I清洁液、质控血浆(Control)、蒸馏水以及其他消耗品。
二、方法使用SysmexCA-7000型全自动血凝仪,按照操作指南进行操作。
三、标本的采集、制备和保存1.采血时,首先确认病人姓名,并将姓名和编号写在真空采血管的标签处。
2.尽可能在同样的条件下进行每次采血,即病人处于休息状态,并在早餐前采血。
3.最好不要将凝血实验标本与其他实验一起采集,以避免血液在针管中停留时间过长。
4.取血时,病人应松弛,环境温暖,防止静脉痉挛,止血带的压力应尽可能小,取血速度平稳顺利,防止产生气泡。
5.使用定量为2毫升的一次性枸橼酸钠(109mmol/L)真空采血管采血至指定刻度,取血完毕后立即轻轻颠倒混匀,不要剧烈震荡,并避免产生气泡。
6.及时离心,以除去血小板。
离心标本的转速为3000转/分,离心时间为10分钟。
7.务必在采血后2小时内测定完毕。
如果不能立即完成试验,冷冻贮存少量血浆(0.5-1ml),最好在-70℃条件下存储。
当贮存时间较短时,可以置于-20℃条件下。
在实验前将血浆于37℃下快速融化。
血浆用塑料试管存放,并用塑料吸管移取标本。
四、质量控制一)室内质控1.1靶值设定:当更换新批号的控制品时,应在“旧”批号控制品使用结束前,将新批号控制品与旧批号控制品平行进行测定。
在20天内,进行20次或更多的独立批次控制测定,剔除超过3SD的数据进行统计,计算出平均数作为靶值。
1.2 标准差的设定方法是,根据至少20个独立批次获得的20次或更多质控测定结果,计算出标准差,并将其作为暂定标准差。
凝血试验分析前的质量控制众所周知分析前质量控制是检验质量控制中的重要环节。
凝血试验对之血、血栓等疾病的诊治有非常重要的意义。
试验中除了仪器的校正、保养、试剂等因素外,凝血试验分析前的质量控制尤其重要。
一、标本的采集1叮嘱患者处于平静、放松、空腹状态,因为情绪激动,剧烈运动会引起血浆成分变化(如血小板增加、血凝和纤溶系统被激活致凝固活性增强)。
2采用肘部较粗且弹性好的静脉取血,止血带不可束缚过紧,束臂时间不应超过1min,禁止用力拍打穿刺部位,回血反应立即松开止血带。
3穿刺应顺利,尽量一针见血。
4采血量应以专用管刻度要求为准(一般2ml),不易过多或过少,抗凝比例。
5采血结束后应立即颠倒混匀5-10次,不可用力猛摇。
二、标本的处理对采集或收到的标本确定是否合格,包括采集量、是否有微小凝块、病人姓名、性别、年龄、标本采集时间、标本类型、检验目的、临床诊断等。
离心速度和时间也要进行控制,对大多数常规血浆凝固试验,离心速度在2500r/min,10min可满足要求,在测定因子V和因子VIII时,使用冷冻离心机在4℃条件下离心。
应避免溶血,因红细胞膜磷脂具有凝血酶的活性,且红细胞释放出的物质影响凝血时间,高血脂、高胆红素对光学原理的仪器判定凝固终点有干扰。
三、抗凝剂的选择和使用抗凝剂的种类很多,选用合适的尤为重要。
EDTA能抑制或干涉纤维蛋白凝块形成时纤维蛋白单体聚合,使纤维蛋白原结果偏高,而且对因子V保护性差;肝素可抑制许多凝血因子反应。
最好选择使用0.109mol/L的枸橼酸钠为为凝血因子检测抗凝剂,枸橼酸钠对因子V、VIII有一定保护作用,因不受肝素影响,还适用于监控肝素治疗。
四、标本的运送和保存血浆标本原则上立即检测,室温放置应在2h内检测,2-4℃内4h检测,若无法在此时间内完成,血浆可置于-20℃保存两周,-70℃可保存半年。
对于PT、APTT、TT\、FIB检测项目可按上法进行标本保存,对凝血因子的检测不推荐使用上述方法。
血栓与止血标本采集和处理的标准操作程序
【目的】指导凝血标本的采集,为了获得准确的检验结果,标本采集和处理必须规范化,也是质量控制的重要条件。
【该SOP变动程序】本标准操作程序的改变,可由任一使用本SOP的工作人员提出, 并报请专业组长及科主任签字后生效。
【标本采集】
1、病人的准备:首先确认病人姓名,并将姓名写在真空管上,安慰病人,以减轻其恐惧心理,尽可能保证每次早餐前采血,且病人处于休息状态。
了解近期用药情况和特殊生理状况,并注明。
例如阿斯匹林、潘生丁等药物能抑制血小板聚集;口服避孕药会使血小板粘附、聚集功能、纤维蛋白原及多种凝血因子活性明显增高;当剧烈运动或输注肾上腺素时Ⅶ因子活性会快速上升。
2、标本采集:按真空采血管采血法标准操作程序用蓝色帽(枸椽酸钠抗凝剂)的采血管准确收集血液至刻度,血液与抗凝剂比例为1:9。
【标本处理】
1、采血完毕,立即摇动试管,使血液与抗凝剂充分混匀,但要避免用力振摇。
2、离心取血浆:3000r/min离心10分钟,取血浆进行试验。
3、标本保存:血浆标本原则上应立即送检,并在2小时内检测完毕。
2-8℃保存不宜超过6小时,22-24℃保存不宜超过2小时。
4、样本暴露于空气中可使PH 值升高,因此若不能立即测定应将样本加塞保存。
【注意事项】
1、采血人员应技术熟练,要求“一针见血”以防止组织损伤、外源性凝血因子进入针管。
采血时病人应放松,环境应温暖,防止静脉挛缩,止血带压力要尽可能小,并且不要超过3分钟,采血前也不要拍打静脉。
2、当需收集几份标本时,应将血凝管放在第二管收集。
3、不可在输液侧手臂采血,更不可在输液针头内抽血。
血栓与止血的质量控制在血栓与止血检验的全过程中,实验结果会受到诸多因素的影响。
质量控制是保证实验结果准确的重要措施。
当实验出现意想不到的结果时,应从各方面寻找原因,最后找到问题所在,通过改进措施,得到一个准确的结果。
一、受检状态的影响:受检者的状态,如被测者生理变化、饮食改变、环境因素、服用药物等引起变化,在采集血标本时若未注意到这些因素也会对结果做出错误判断。
不同的药物和某些生理状况(如怀孕、情绪激动、剧烈运动)会对一些凝血结果造成影响。
阿斯匹林、潘生丁和抵克利德等药物能抑制血小板聚集,肝素和口服抗凝剂能抑制凝血机能。
尿激酶(UK)和链激酶(SK)等可进促纤溶功能。
口服避孕药会使血小板粘附功能、血小板聚集功能、纤维蛋白原、凝血酶原以及凝血因子Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅻ因子活性明显升高。
剧烈运动和月经期纤溶活性明显升高,高脂肪食物造成血脂升高可抑制纤溶活性。
吸烟可使血小板聚集性明显升高。
饮酒可抑制血小板聚集性。
剧烈运动或输注肾上腺素时,Ⅷ因子活性会快速上升。
因此,当出现一些意想不到的结果时,应考虑是否有以上因素的影响。
二、标本的采集:1.确认病人的姓名,采血管上应注明病人的姓名,同检验申请单核对,避免张冠李带。
2.受检者必须在休息状态下,并且在早餐前采血,对于观察疗效和预防临床出血病人的监测最好在同一条件下采血。
3.采集血液必须用塑料或硅化的玻璃注射器,避免凝血因子激活,最好使用双筒注射器采血,禁用血气用的注射器。
4.针头必须采用21号(外径0.8mm)以上,儿童可用23号。
5.止血带不应扎得过紧,最好不要超过5分钟。
6.采血人员应技术熟练,“一针见血”,以防组织损伤,由于外源性凝血因子进入针管,会使凝血因子激活,可造成PT和APTT时间缩短。
取血时,拉针的速度要慢并且均匀,使血液平稳地进入注射器,防止气泡产生。
泡沫的产生可使纤维蛋白原,因子V和因子Ⅶ变性。
7.迅速将血液与抗凝剂轻轻的颠倒混匀,避免用力振荡而破坏凝血蛋白。
8.采集后的血液应放在加塞子的试管内,因为未加塞子的试管会使血液中的CO2丢失,PH升高,使PT和APTT时间延长。
9.分离血浆时用塑料吸头移取,并盛放在塑料管内。
因玻璃表面能激活凝血过程,从而使凝血时间缩短。
总之,实验人员采血最好,因为他们知道采血的注意事项,也能尽量缩短采血后至实验前标本放置的时间。
三、标本的制备:1.采血之后血液在室温放置时间不能超过2小时。
2.全血贮存在4-10℃不超过2小时,最好在1小时内分离血浆,-20℃可保存2周,-80℃可保存18个月,冷冻血浆中的凝血因子在越低温度下越稳定。
3.如果检测冷冻血浆,必须在37℃水浴中快速溶解,冷冻过的血浆不能再次冷冻。
冷冻血浆融化时,不能在室温中让其自然融化,这样会使纤维蛋白原析出和凝血因子消耗。
4.溶血标本可造成PT和APTT轻微缩短。
5.血浆制备,血样应在2000-2500g离心10-15分钟。
四、抗凝剂1.标本应采集在含有枸橼酸钠(109mmol/L)抗凝剂的试管内,抗凝剂与血的比例应为1:9,混匀要充分。
2.应准确把握抗凝剂的浓度。
即Na3C6H5O7.2H2O为3.2%,Na3C6H5O7.5H2O为3.8%。
3.当Hct>0.55或Hct<0.25时,务必用MacGann推荐的公式计算抗凝剂的用量,抗凝剂的用量(ml)=0.00185×全血量(ml)×〔1-Hct (%)〕,否则结果不可信,Hct低可使PT和APTT凝固时间缩短,Hct高可使PT和APTT凝固时间延长。
4.如果自配抗凝剂,枸橼酸钠应为基准试剂或分析纯试剂。
5.抗凝剂+抗聚剂:通常选用CTAD液,成份:枸橼酸钠0.11mol/L,茶碱15mmol/L,腺苷3.7mmol/L,潘生丁0.198mmo1/L.优点:采血后血小板很少活化,且保存时间可超过15小时。
6.抗凝剂+抗纤溶剂:在溶栓治疗的实验室监测中,若用常用抗凝剂会使纤溶系统持续激活,可使纤维蛋白原及其降解产物(FDP)的定量比现差异。
应该使用“抗凝剂十抗纤溶剂”的抗凝剂,抗纤溶剂可选用抑肽酶,它可以抑制激肽释放酶,胰蛋白酶,糜蛋白酶、凝血因子和纤溶活性,能精确测定纤维蛋白原,但会引起凝血酶时间的延长。
五、试剂1.蒸馏水:使用重蒸水比用去离子水好,蒸馏水的PH为6.0-7.0.水质不能有混浊,应无菌,无Ca2+、无致热源。
2.有保护剂、抗生素、抗体或其它添加剂的水不能用于溶剂试剂。
3.复溶后的试剂,不用时应加盖子,储存在2-8℃,APTT和FIB均不要冷冻保存。
冬天运输时,注意防冻。
4.稀释倍数要准确,并标明复溶或开瓶时间。
复溶后在冰箱中贮存时间不能过长,国产试剂最长7天,复溶试剂需用几天的,不应在预温槽中放置时间过长,最好取出部分试剂,剩余即放回冰箱内冷藏。
5.试剂与质控品均应在有效期内使用。
6.溶解试剂时不能剧烈振摇,防止产生气溶胶。
六、操作1.检查所有试剂和缓冲液是否有沉淀、污染等问题,发现异常情况应及时更换。
2.更换不同厂家或同一厂家不同批号的试剂时,使用之前必须重新进行定标,这一点必须切记!3.检查孵育或温度设置是否正常。
4.血浆标本和试剂在37℃预温时间均不应超过10分钟,否则会使凝固时间延长。
5.在操作时,血浆和试剂均应预温,若预温时间不足可导致凝固时问延长。
因此在操作时,应仔细阅读试剂盒使用说明书。
6.每次测定之前,第一管最好放上参比血浆或质控血浆,以确保检测结果的准确性。
7.最佳激活时间,指试剂与血浆标本相互作用的时间,目的是使凝血标准激活,APTT在操作时,血浆与试剂应先预温后再加CaCl2,不然凝固时间延长。
8.每一样本需做双份测定,其重复性应在1秒以内,否则需重新测定。
9.在测试时,标本中如出现凝块,无论该凝块多么小,均影响实验结果。
10.加样要准确,不能有气泡产生。
七、仪器1.大多数血凝仪开机20分钟才能达到平衡,检测室的温度应保持在37±1℃。
由于凝血试验属于酶促反应,最适温度为37℃,温度过高可导致凝固时间缩短,温度过低可导致凝固时间延长。
2.仪器不同,采用的方法不同,测定结果有差异。
3.每台仪器上使用的凝血活酶试剂都应有特定的ISI值,而不应使用厂商标定的ISI值。
重新标定ISI值的做法是购买标定INR的冻干血浆,然后在自己所用的仪器上再标定凝血活酶试剂的ISI值,这样才能使病人INR的结果具有可比性和可信性。
4.光学法在测量血凝试验时,若存在溶血、黄疸和乳糜血会影响实验结果。
而采用磁珠法测量时可避免上述因素的影响。
5.在测量FIB时,应使用Clauss法,不应使用凝血酶原时间(PT)衍生纤维蛋白原的方法。
6.使用新鲜混合血浆校正仪器时,其定值要直接或间接溯源至国际标准。
7.仪器的质量准确度:PT、APTT:均值士15%,FIB:均值土25%.精密度:批内,PT<2%,APTT<3%,FIB<5%;批间,PT<3%,APTT<3%,F IB<7%;日间,PT<4%,APTT<5%,FIB<7%。
8.保持机械和光学部件清洁,确保仪器处于良好的运行状态。
9.仪器的安装环境应防热、防尘、防震、防腐蚀、防潮湿和远离磁场,相对湿度<80%,最适温度15-30℃,电压220±10V.因为这些因素均能影响仪器的运行状态或影响仪器的光学信号而影响测定。
10.仪器的调试与校正与仪器匹配的校正液,合理的校正点及校正参数,校正后的参数不能随意更改。
在仪器投入使用前搬动、更换部件维修、质控漂移找不出别的原因时,及时校正仪器,这样才能确保仪器的准确性,检测结果才能得到保证。
11.参数的设置要准确、合理。
如试剂量、样本量、孵育时间、激活时间、反应温度这些都会影响结果的准确性。
12.仪器的质量准确度:PT、APTT均值±15%,FIB均值±25%.精密度:批内PT<2%,APTT<3%,FIB<5%;批间PT<3%,APTT<3%,FIB <6%;日间PT<4%,APTT<5%,FIB<7%,携带污染率等指标要符合要求。
13.及时正确地保养和维修仪器定时测试和校正仪器的性能。
如温度、波长,特别是对光源灯要定期检查、校正,避免因光源灯光学性能衰减对测定的影响。
八、用品1.试验时应使用清洁的,刻度合适的样品分配器和一次性枪头。
2.各种用品均应使用硅化的玻璃器皿或塑料制品,以免激活凝血过程,从而使许多试验结果受影响。
3.使用的磁珠不能有油腻和磁性。
4.磁珠应使用厂家规定型号的珠子,珠子直径大小不同,可导致错误的结果5.反应杯必须清洁,无任何损坏,正确放置。
九、质控品1.质控品是用来监测试剂质量及检测仪器的准确性,而不能用来控制样本的采集、处理和贮存。
2.建立实验室自己的质控范围,要求测定质控血浆20次,计算均值、标准差和变异系数。
十、参考区间1.凝血试验并没有正常区间,如果要判断一个PT或APTT是否正常,要求与“正常对照”值做比较,大于或小于“正常对照”某个数值才算异常。
2.自备正常对照血浆:要求30份以上健康、年龄在18-55岁间的男女个体,且删除服药者,须在平静、休息状态下抽血。
标本离心取出血浆后混匀,分装小瓶,冷冻于-80℃备用或冷冻干燥。
每个工作日,取一份对照血浆,重复测定3次,取平均值,作为当天正常对照值。
报告结果时,应附当天正常对照值。
3.建立参考区间用于建立参考区间标本来源同正常对照血浆。
应特别注意的是,建立的参考区间只能适用于同一批号,同一批正常人血浆,同一仪器检测的结果。
如果更换试剂批号,则应另外建立参考区间。