曹宗平教授简介

２０２１．０６　ＬＡＮＺＨＯＵＸＵＥＫＡＮ 收稿日期：２０２０－１２－０９。

作者简介：李国和，广西艺术学院马克思主义学院讲师；曹宗平，华南师范大学教授、博士生导师、华南师范大学高质量发展研究中心主任。

基金项目：国家社会科学基金重点项目“乡村振兴战略背景下农民工返乡创业风险的防控机制与治理对策研究”（项目编号：１８ＡＪＹ０２０）。

乡村振兴战略背景下农村留守老人关爱服务的困境与出路李国和　曹宗平摘　要　乡村振兴战略提出加强农村社会保障体系建设，健全农村留守老人关爱服务体系。

其作为破解城乡分化及发展不平衡的一项重要战略举措，对农村留守老人关爱服务体系建设提出了新要求。

当前农村留守老人关爱服务面临着经济供养资源不足、生活照料缺乏人力支持、精神关爱匮乏、健康状况渐差等问题与挑战。

为此，政府需要抓住乡村振兴战略的发展契机，推进农村留守老人关爱服务体系的建立与完善：巩固家庭关爱照顾的支柱地位；落实政府关爱服务的责任体系；发挥村两委、老年社会组织的权益保障作用；推动社会力量广泛参与，形成家庭履责、政府保障、基层主导、社会力量参与的多元共治型农村留守老人社会支持体系。

关键词　乡村振兴战略；农村；留守老人；关爱服务体系中图分类号Ｃ９１３．６ 文献标识码Ａ 文章编号１００５－３４９２（２０２１）０６－０１５１－１０一、问题提出与文献综述党的十九大报告提出实施乡村振兴战略，增加农村公共服务供给，提升农村养老服务能力。

在乡村振兴战略的推进中，必须深刻把握农村人口老龄化的基本国情。

根据２０２０年民政部统计数据显示，截至２０１９年底，我国６０岁及以上老年人口达２．５４亿，占总人口的１８．１％，其中农村留守老年人口规模达１．４亿。

在我国传统的农业社会向现代化的工业社会转型进程中，区域间、行业间要素自由有序流动的壁垒逐渐打破，吸引大量农村青壮年向城市迁移，原有依靠土地维持生计的方式日益固化为以代际分工为基础“半工半农”型的家计模式，致使农村家庭结构出现破损，①乡村逐渐形成了一个以留守老人为主体稳态的留守社会。

曹宗平教授简介
曹宗平，男，湖北广水市人，1968年10月生，华南师范大学经济与管理学院教授。

理论经济学博士，应用经济学博士后，政治经济学专业博士生导师。

主要研究方向为政治经济学、区域经济学、资本运营与公司治理等。

曾先后在国家权威和核心学术期刊《求是》、《经济学动态》、《经济学家》、《改革》、《经济与管理研究》、《当代经济研究》、《中国经济问题》等杂志上公开发表论文30余篇，其中多篇论文被《中国社会科学文摘》、《新华文摘》和《中国人民大学报刊复印资料》转载。

出版个人专著《中国城镇化之路——基于聚集经济理论研究的新视角》，主编教材2部，参编教材多部。

承担并完成多项国家及省部级科研课题，目前正主持2013年度国家社科基金项目《我国东部地区产业演化与城市化动态协调发展模式比较与经验借鉴》（13BJL077）。

马克思主义经济学博士后流动站研究方向：马克思主义经济学与中国经济发展应用经济学博士后流动站研究方向：区域经济发展与城市化研究。

Email:caozongping@
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㊀２０２１年第４期㊀总第５７期１㊀ʌ课堂评论ɔ全局意识：课堂教学的战略定位曹周天（人民教育出版社课程教材研究所，北京㊀１０００８１）ʌ摘㊀要ɔ全局意识是课堂教学中的战略定位问题，它强调教师在进行教学设计时要从整体出发，站在全局的高度看待教学全过程，从宏观层面对整个教学活动做出统筹规划㊂全局是一个相对概念，一方面可以把一节课的总体教学内容看作这节课的全局，另一方面该课所教内容在学科体系中所处的位置，同样也涉及全局问题，其实质是具体教学与学科课程的关系问题㊂树立全局意识，处理好课堂教学中的细节问题，有助于课堂全面育人目标的完美实现㊂ʌ关键词ɔ课堂教学；全局意识；教学统筹规划ʌ作者简介ɔ曹周天，教育学博士，人民教育出版社课程教材研究所研究人员㊁报刊社编辑，主要从事课程与教学论㊁教育出版史研究㊂ʌ基金项目ɔ中国博士后科学基金第６８批面上资助项目（２０２０Ｍ６８０６０５）；教育部人文社会科学重点研究基地重大项目（１７ＪＪＤ８８０００２）；国家社会科学基金 十三五 规划２０１８年度教育学一般课题（ＢＨＡ１８０１２３）；北京市教育科学 十三五 规划２０１８年度优先关注课题（ＡＥＦＡ１８０１１）课堂是发挥学校综合育人功能的主阵地，受到一线教育工作者和教育理论研究者的广泛关注㊂随着基础教育改革的深入推进，围绕课堂教学工作的开展问题进行研究，涌现出一大批富有真知灼见的理论成果与实践方略㊂这些成果多聚焦在课堂教学中的某一具体环节或者具体方法，从不同维度㊁不同层次对课堂教学展开研究，却缺乏了对课堂教学活动整体运行状态的全面把握㊂众所周知，课堂教学往往作为一个系统来运作，唯有这个系统中的各要素都能发挥自身优势㊁通力协作，才能实现课堂教学效益最大化的预期成果㊂鉴于此，我们要积极树立课堂教学中的全局意识，以此为统领，全面谋划，协同推进课堂教学的各项工作㊂一㊁对课堂教学中全局意识的基本认识古语云：不谋全局者，不足谋一域㊂它的字面意思是说，若是不能从全局的角度来考虑问题，就不足以治理好一个局部地区㊂我们将之迁移到教学领域便可发现，在处理诸多课堂教学问题时，同样存在如何把握好全局这个问题㊂要谈课堂教学中的全局意识，首先需要明确什么是全局意识㊂所谓全局意识，就是指在统筹课堂教学的过程中，始终能够从教学设计的整体出发，站在全局的高度对课堂教学做出相应的决策规划，让教学真正成为促进学生全面发展的伦理活动㊂著名语文特级教师于漪曾以 胸有成竹 的典故来比喻课堂教学中的全局意识，她认为， 画家胸中先有整幅画的布局，才可做到：有疏有密，疏密得当，不是密不通风，令人窒闷，也非东零西散，给人以支离破碎之感；条畅理顺，斐然成幅，或貌似乱笔，而乱中有致，秩序井然㊂ ［１］１８４做到胸有成竹，自然是教师对教学全局有了通盘的把握，在此基础上开展课堂教学活动，其目的性和针对性则会大大增强㊂众所周知，教师㊁学生㊁课程㊁活动㊁环境等教学要素之间的有机融合，可以带来课堂教学系统的优化与效能的提升㊂课堂教学中全局意识的具体内涵，可以概括提炼为宏观性㊁整合性和融通性这三个理论特征㊂具体来说，宏观性强调的是对课堂㊀２０２１年第４期㊀总第５７期２㊀教学中关键问题的关注㊂所谓课堂教学中的关键问题，主要是指能主宰并支撑整个课堂教学活动的基本要点，比如教学的目标㊁教学内容中的重点知识与核心技能㊁教学的主要环节等㊂之所以对这些问题要予以优先关注，是因为对它们的理解与安排将直接影响课堂教学的整体运行轨迹㊂安排好这些内容，教师就能在教学过程中事先占据宏观调控的有利位置，对教学中的环节设置㊁节奏调整㊁内容选择㊁时间分配等一系列具体而琐碎的问题做好周密的安排与部署㊂整合性则是从统整教学各要素的角度来说的㊂ 任何一种因素作用的发挥，只能收到局部的效果，而不能取得教学的整体效果㊂要想取得最优化的整体效果，应力求教学的各要素按照它们之间内在联系的规律性合理地加以配置㊂这样，把每一个局部因素，综合到教学过程的整体结构中，既充分发挥它们各自的作用，又使教学取得最优的整体效果㊂ ［２］课堂教学活动的顺利开展在依赖教师和学生这两个主体参与的同时，还与课程内容的选择㊁教学设计的安排㊁教学环节的设计㊁教学方法的选择㊁教学手段的运用等有着密切的联系㊂做好课堂教学中各要素㊁各环节之间的统整安排，是教师实现教学有序㊁高效㊁协调发展的基础工作㊂融通性则是从动态的视角审视课堂教学㊂毕竟，静止的课堂是不存在的，从上课铃响的那一刻开始，课堂教学便始终处于运动㊁变化的状态，任何希望通过一套固定的教学设计完成该课堂所有的教学任务的想法几乎都是天方夜谭㊂因此，在时间线性变化的发展过程中，各教学环节之间的配合与协调显得至关重要㊂在教学过程中，教师要在不断发展变化的课堂教学运行轨迹中把握好教学主基调，在不影响整体教学设计的大前提下，根据教学中出现的新变化适时做出调整，以求得教学全局的稳定与坚实，这是融通性特征的核心要义㊂综合来看，全局意识中的宏观性㊁整合性和融通性启示我们，要用一种综合的视角来审视课堂教学，统筹规划整体教学活动，才能在教学实施过程中达到游刃有余㊁拿捏自如的理想境界㊂二㊁关键要理解 全局 概念在课堂教学中的相对性对课堂教学中 全局 概念的准确理解是树立全局意识的关键，也是充分发挥全局意识引领作用的关键㊂苏联教育家赞科夫在‘教学论与生活“一书中就曾指出，教学过程中的 整体 和 局部 是一组相对的概念㊂他举例说： 学校某一年级中学习的一门学科，对它的各个章节或专题来说是一个整体㊂同时，就该年级的全部教学工作来说，一门学科又是它的局部㊂ ［３］这一观点对我们进一步理解课堂教学中 全局 概念的相对性具有启发意义㊂对此，我们可以做如下解读㊂首先，从整节课的角度看，一节课的教学内容可以称为全局㊂这是对课堂教学中全局概念最直观的理解，可近似等同于一节课的教学设计㊂通常来说，一节课总是围绕某一项或某几项教学目标而展开的，为实现这些教学目标，教师往往需要组织相应的教学内容，综合运用多种教学方法，开展有针对性的课堂教学活动㊂ 每堂课也是有机整体，忽视了这一点，上课时东捡一点，西拽一块，拾在篮里就是菜，课上得鸡零狗碎，学生窥不到一斑，更不用说能见全豹，同样受不到教益㊂ ［１］１８３教师只有在全面把握本节课的教学内容时，才能在课堂上自如地调配各种课程资源，综合运用多种教学手段㊂其次，从学科课程的整体角度审视，一节课的内容同样关涉该学科课程教学的全局问题㊂如果教师把对教学内容的认识局限在具体的某一课时上，则不能充分把握某一门课程的整体框架与知识结构㊂毕竟，教材中某一篇课文或某一章节的内容，往往需要用若干课时才能完成㊂有鉴于此，我们在理解全局概念时，就要从单一教学活动的局限中跳脱出来，转而思考该教学内容与其他内容的关联性及其在整个学科体系中的地位㊂复旦大学哲学教授俞吾金曾在‘语文教学的形式化倾向“一文中指出，当前语文教学中存在 关注细节，失了全局 的问题㊂他认为， 出于形式化考试的需要，教师在教学中讲解课文时，常常把学生的注意力引向语㊀２０２１年第４期㊀总第５７期３㊀法细节和表达的技巧，忽略了把整篇课文所要表达的精神传递给学生，从而使学生的兴趣集中在边缘化的形式和技巧上，在感情上缺乏对所学的课文的总体精神的沟通㊁把握和认同㊂结果是捡了芝麻，丢了西瓜，最需要学的东西反而没有学到㊂ ［４］其实，不光是语文课的教学，其他学科，特别是在理科教学中，因过分注重公式运算的技巧训练而忽视科学思想方法和价值观教育的情况时有发生㊂究其根本，都与教师在教学过程中缺乏全局意识有关㊂总的来看，对课堂教学全局意识理解的关键是要把握好 相对性 的尺度，即根据具体的教学内容和教学任务，选择恰当的参照体系㊂对课堂教学中全局的概念设定，既不过分夸大，也不过分聚焦；既不让有关课程知识体系的大框架干扰每一课时的教学设计，把四十五分钟的课堂教学时间塞满，也不让个别教学中的重难点成为干扰或是阻碍总体教学进度的拦路虎和绊脚石㊂不论是把某一节课看作全局，还是把一门课程的整个知识体系看作全局，教师都必须在筹备课堂教学之时站得高㊁看得远，有超前意识，能够提早规划㊂只有在备课谋划中抢占了先机，才能在教学中获得主动㊂三㊁树立课堂教学中的全局意识不能忽视对细节的关注当然，树立全局意识并不意味着忽略或无视细节㊂处理好课堂中教学中的细节问题有助于课堂全面育人目标的实现㊂我们既强调树立课堂教学的全局意识，也不放松对细节的关注，是因为任何一节课都是若干教学流程与教学活动的组合，缺少了具体的教学细节，整节课的教学流程就变得残缺不全，全局意识的确立也就成了无源之水㊁无本之木㊂一节课或一门课程的教学环节设计安排得精细与否，直接影响实际教学的呈现效果㊂对细节的周全考虑，既有助于丰富和凸显课堂教学主线，又能为课堂教学活动的开展提供充足的素材㊂如果教师在备课时，能在设计出一条贯穿全课的教学主线的基础上，还为教学的各环节准备了丰富的教学材料，则定能收到良好的教学效果㊂需要注意的是，对细节的关注也不是漫无目的的平均用力㊂著名哲学家胡绳先生曾强调， 照顾全局不等于平等地照顾所有的各局部㊂如果在任何情况下必须把所有的局部都认得清清楚楚，然后才能对全局有所判断，那就反而会使我们永远不敢说关于全局的话㊂ ［５］这就启示我们，对重点教学细节的选择要把好准入关，对承担推进教学功能的重要环节进行精细设计，使之成为实现课堂全面育人目标的核心动能㊂如语文课上对著名作家的简介㊁历史课上对重要史实的介绍等就属于这类 承担推进教学功能的重要环节 ㊂教师在备课时，需针对这些内容广泛查阅相关文献资料，综合各方素材，写出较为精当㊁简洁的完整讲稿㊂这些介绍性的文字可能只有几句话，在整节课的教学时长中所占比例微乎其微，但却是教学中最有可能出彩的地方㊂综合来看，全局意识在整个课堂教学过程中处于战略核心地位㊂可以说，把握好了课堂教学的全局，也就抓住了课堂教学的命脉㊂正如 牵牛要牵牛鼻子 一样，调节课堂教学中诸要素之间的矛盾及相互关系需要找到一个关键抓手，全局意识的确立或许可以为我们顺利破解课堂教学中的诸多难题提供有益支持㊂参考文献：［１］于漪．我和语文教学［Ｍ］．北京：人民教育出版社，２００３．［２］李秉德．教学论［Ｍ］．北京：人民教育出版社，２００１．［３］赞科夫．教学论与生活［Ｍ］．俞翔辉，杜殿坤，译．北京：教育科学出版社，２００１．［４］俞吾金．哲学随感录［Ｍ］．北京：北京师范大学出版社，２０１６．［５］胡绳．胡绳全书：第四卷［Ｍ］．北京：人民出版社，１９９８．（责任编辑：蒋素利）。

爱伦・坡是美国文学史上一位有影响、有争议的作家，１７０年来，西方文学评论界一直都没有放弃对他的研究，其原因有三：一是他是一位有争议的作家。

人们对他的评价褒贬不一。

不同时期的不少伟大作家都给予他截然不同的评价，如：萧伯纳（ＢｅｒｎａｒｄＳｈａｗ）认为：“美国出了两个伟大的作家———埃德加・爱伦・坡和马克・吐温”。

丁尼生（Ｔｅｎｎｙｓｏｎ）说坡是“美国最具独创性的天才”。

（ｔｈｅｍｏｓｔｏｒｉｇｉｎａｌＡｍｅｒｉｃａｎｇｅｎｉｕｓ）叶芝（Ｙｅａｔｓ）说他是“美国最伟大的诗人，而且永远是全世界伟大的抒情诗人”。

（ａｇｒｅａｔｌｙｒｉｃｐｏ－ｅｔｏｆｔｈｅｗｏｒｌｄ）。

（Ｂｅｌｇｉｏｎ：１９５１：５１）Ｊ・Ｓ・戴也说：“坡在小说中，对环境造成的极度痛苦的恐怖，能给读者留下最深刻的印象”。

（ＲｕｓｓｅｌｌＢｌａｎｋｅｎｓｈｉｐ，１９７３：２１５）爱默生（Ｅｍｅｒｓｏｎ）称他为“打油诗人”。

（ａｊｉｎｇｌｅｍａｎ）惠特曼（Ｗｈｉｔｍａｎ）说他“在想象文学的电光之中明亮、旋目，但没有热”。

（ａｍｏｎｇｔｈｅｅｌｅｃｔｒｉｃｌｉｇｈｔｓｏｆｉｍａｇｉｎａｔｉｖｅｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ，ｂｒｉｌｌｉａｎｔａｎｄｄａｚｚｌｉｎｇ，ｂｕｔｗｉｔｈｎｏｈｅａｔ）还有人则无视爱伦・坡的才华，认为他的艺术是：“不道德的或没有道德意识的”。

（ｉｍｍｏｒａｌｏｒａｍｏｒａｌ）在对他的生平介绍中，把他描写成为“醉鬼和恶魔”。

（ｄｅｍｏｎｒｕｍａｎｄａｄｉｓｃｉｐｌｅｏｆｔｈｅｄｅｖｉｌ）。

（ＧｅｒａｌｄＭ．Ｇａｒ－ｍｏｎ，１９７３：１９）世人对他的争议从这些褒贬不一的评价中可见一斑。

二是不少后世人都或多或少地受到过爱伦・坡的影响。

美国的诺里斯、德莱塞、福克纳，英国的罗塞蒂、史文朋、史蒂文森、肖伯纳等都深受他的影响。

三是在进入２０世纪以来，爱伦・坡作为美国浪漫主义时期的作家引起了现代派的极大的关注和兴趣，各批评流派，如社会历史学派、精神分析学派、新批评派、女权主义者、读者反应批评派、结构主义、解构主义等都从不同的角度来审视他和他的作品。

第49卷第1期 2021年1月硅 酸 盐 学 报Vol. 49，No. 1 January ，2021JOURNAL OF THE CHINESE CERAMIC SOCIETY DOI ：10.14062/j.issn.0454-5648.20200390质子导体基固体氧化物燃料电池的新认识曹加锋1，冀月霞1，邵宗平2(1. 安徽工业大学数理科学与工程学院，光电信息材料与技术研究所，安徽 马鞍山 243032；2. 南京工业大学化工学院，材料化学工程国家重点实验室，南京 210009)摘 要：质子导体基固体氧化物燃料电池(P-SOFC/PCFC)是建立在质子传导机制上的全固态、绿色、经济的发电装置。

鉴于目前固体氧化物燃料电池(SOFC)的低温化发展趋势，本综述系统分析了PCFC 内部的质子传导机制，总结了目前常见的PCFC 电解质和电极材料，探讨了PCFC 内部质子传导通道的高效构建问题。

在材料研究方面，重点分析了各类PCFC 材料的设计理念和目前仍存在的问题。

针对PCFC 的未来发展趋势，指出开发新型的质子导体电解质和电极材料仍然是目前这一领域亟需进行的工作。

关键词：质子导体基固体氧化物燃料电池；钙钛矿结构氧化物；电解质材料；电极材料中图分类号：TK91 文献标志码：A 文章编号：0454–5648(2021)01–0083–10 网络出版时间：2020–12–17New Insights into the Proton-Conducting Solid Oxide Fuel CellsCAO Jiafeng 1, JI Yuexia 1, SHAO Zongping 2(1. Institute of Optoelectronic Information Materials and Technologies, School of Mathematics and Physics, Anhui University of Technology, Maanshan 243032, Anhui, China; 2. State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College ofChemical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 210009, China)Abstract: Proton-conducting solid oxide fuel cells (P-SOFCs/PCFCs) are all-solid-state, eco-friendly, and economic power generation devices for proton conduction in oxide lattices. This review represented the proton conduction mechanism, the typical electrolyte and electrode materials used in PCFCs, and the efficient construction of the internal proton conduction pathways based on the development of low-temperature working SOFCs. The principles of designing these materials were analyzed and some possible problems in this aspect were discussed. This review also indicated the future work on PCFCs to develop some novel electrolytes and electrode materials with an improved proton conductivity.Keywords: proton-conducting solid oxide fuel cells; perovskite-type oxides; electrolyte materials; electrode materials固体氧化物燃料电池(SOFC)，又名陶瓷燃料电池，是以全固态氧化物作为主要工作介质的电化学能源转化装置[1]。

曹教授妙手回春作者：杨秉辉来源：《食品与生活》 2020年第8期杨秉辉中华医学会常务理事，中国健康教育协会副会长。

一省立医院急诊室里依旧灯火通明，5 分钟前一位急性心肌梗死的病人刚刚转入心导管室抢救；一个急性阑尾炎的病人送进了手术室手术；10 分钟前送来的消化道大出血的病人内镜科医生正在给他做胃镜下的止血治疗；内科医生正在给服下40 粒安眠药的病人洗胃……大医院的急诊室永远在忙碌之中。

从急诊室门前一辆救护车上跳下两位医生，动作麻利地抬着一位女病人，放到急诊室护士推过来的带轮子的推床上。

女病人40 余岁，面色苍白，骨瘦如柴，腹部高度膨隆，吃力地反复地说着：“不行了，不行了，我透不过气了。

”陪着她的是一位六七十岁的老妇人，衣着也还整齐，带着近视眼镜，估计是病人的母亲，慈爱地抚摸了一下病人的头。

“珍珍，这是省立医院，医生一定会想办法的，我让他们给你吸氧气。

”医生过来了，询问病史、症状，得知是一位卵巢癌患者，病史已经四五年了，似乎未经正规治疗，因为大量腹水，已属晚期，曾去过几家医院，因属晚期肿瘤，医生皆表示无能为力，未能接受入院治疗。

此次因呼吸困难而送来急诊。

急诊科医师做了初步检查：病人极度衰弱，腹部隆起，据家属称外院诊断为卵巢癌，估计是晚期卵巢癌伴大量腹水，上推膈肌以致呼吸困难。

这让急诊医师很犯难，除了给予吸氧之外，似乎无法处理，于是便邀请妇科医师前来会诊协助处理。

前来会诊的妇科医师是该院妇科老主任曹教授的博士研究生，姓刘，她研究的内容恰好就是关于卵巢癌的课题。

在急症室里，她面对这样一位晚期卵巢癌病人，也觉并无良策。

不过看着病人无助的眼神、家属“救救她吧”的哀求，想起老师的教导：做医生的人应该敬畏生命，对于病人应该有“永不言弃”的精神。

内心很是纠结了一阵子，终于下了决心：接受病人入院治疗。

晚期肿瘤病人住院治疗一直是个难题：病人症状严重，当然希望得到大医院的住院医疗，但是肿瘤晚期已无法治疗，甚至症状都难以缓解。

2270㊀㊀2023年第64卷第9期收稿日期:2022-08-18基金项目:浙江省农业(蔬菜)新品种选育重大科技专项(2021C02065);温州市科技项目(2019ZX007-2);浙江省教育厅科研项目(Y202045786)作者简介:徐谦(1985 ),女,浙江绍兴人,讲师,博士,主要从事植物生物技术,E-mail:xuqian@㊂通信作者:唐征(1974 ),男,江西宜春人,副教授,硕士,主要从事蔬菜遗传育种研究,E-mail:tangzheng@㊂文献著录格式:徐谦,张圣美,黄宗安,等.青花菜转录因子BoiWRKY 15的克隆及表达分析[J ].浙江农业科学,2023,64(9):2270-2276.DOI:10.16178/j.issn.0528-9017.20220882青花菜转录因子BoiWRKY 15的克隆及表达分析徐谦,张圣美,黄宗安,钟伟杰,唐征∗(温州科技职业学院/温州市农业科学研究院浙南作物育种重点实验室温州特色作物生物技术创新重点实验室,浙江温州㊀325006)㊀㊀摘㊀要:WRKY 转录因子广泛参与植物生长发育的调控过程,在植物逆境防御中起着重要作用㊂本研究以青花菜高代自交系为材料,在克隆转录因子基因BoiWRKY 15的基础上,开展序列分析和系统发育分析,并明确其组织定位和在野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris )侵染下的表达模式㊂结果表明,BoiWRKY 15的DNA 全长1058bp,具有2个内含子,长度均为31bp;开放阅读框全长996bp,编码331个氨基酸;系统发育分析表明,BoiWRKY 15与野甘蓝WRKY 15亲缘关系最近;实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qRT-qPCR)结果表明,BoiWRKY 15存在组织表达差异,在花和幼嫩角果中具有较高表达量;BoiWRKY 15的表达还受野油菜黄单胞菌的诱导,0~7d 表达量持续升高㊂本研究为后续研究青花菜BoiWRKY 15的功能和作用机制提供了参考依据㊂关键词:青花菜;WRKY;序列分析;黑腐病中图分类号:S635.3㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀文章编号:0528-9017(2023)09-2270-07㊀㊀青花菜(Brassica oleraceal var.italica )又名绿菜花㊁木茎花椰菜,俗称西兰花,原产于地中海东部沿岸地区,为十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种,一二年生草本植物㊂以肥嫩短缩的花枝和花蕾作为食用部分,营养丰富,风味极佳,且含有抗癌类芥子油苷[1],已成为我国有发展前途的鲜用或加工出口创汇的重要蔬菜品种之一㊂近年来随着消费需求逐年增加,种植面积不断扩大,轮作倒茬时限逐渐缩短,黑腐病的危害呈逐年加重的趋势㊂十字花科黑腐病由革兰氏阴性植物病原菌野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.Campestris ,Xcc)引起,是一种能使全球范围内所有十字花科植物形成黑腐病的重要病害[2],染病后引起叶脉变黑㊁叶片枯死,影响植株光合作用,造成产量和花球品质的下降,对甘蓝类蔬菜的生产危害极大[3-4]㊂中国不是青花菜原产地,种质资源较为匮乏,抗病材料尤其稀缺,利用抗病相关基因培育新种质是解决这一问题的重要途径㊂作为转录因子中的一大类,WRKY 转录因子存在于所有的植物中,拟南芥(Arabidopsis thaliana )中有74个,水稻(Oryza sativa )中有109个,甘蓝(Brassica oleraceal var.oleracea )中有148个成员[5-8]㊂WRKY 转录因子参与植物的诸多生物学过程,在生长发育㊁非生物胁迫和生物胁迫的调控过程中起着重要作用[9]㊂WRKY 转录因子参与病原菌的胁迫响应,例如,拟南芥中的AtWRKY 38㊁AtWRKY 46㊁AtWRKY 53㊁AtWRKY 54㊁AtWRKY 62和AtWRKY 70均参与植物对丁香假单胞菌的抗性调控[10-12];结球白菜的8个成员在胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum )的侵染下差异表达,另有5个成员的表达受镰刀霉菌的诱导[13];甘蓝型油菜中有21个WRKY 基因响应根肿菌胁迫且在根肿病抗病和感病品种中差异表达[14];芜菁BrWRKY 46-2㊁BrWRKY 70-2参与根肿菌响应过程,与芜菁品种抗病和感病密切相关并受水杨酸(SA )和茉莉酸(JA )的强烈诱导[15];青花菜中,BoWRKY 2㊁BoWRKY 3㊁BoWRKY 6和BoiWRKY 7的表达都受霜霉菌诱导升高,BoWRKY 6过表达植株表现出对霜霉病的抗性,BoWRKY 2和BoiWRKY 7还分别受核盘菌和野油菜黄单胞菌诱导升高[16-18]㊂本研究以青花菜为材料,在克隆BoiWRKY15的基础上进行序列分析,利用荧光定量PCR检测其组织定位与在野油菜黄单胞菌侵染下的表达,为将来开展该基因的功能研究和分子育种提供依据㊂1㊀材料与方法1.1㊀实验材料与试剂㊀㊀以青花菜自交系青12为试验材料,于育苗大棚中培养至四叶一心期㊂采用喷雾法接种野油菜黄单胞菌,浓度为1ˑ108CFU㊃mL-1,对照采用等量的无菌水㊂收集接种0㊁1㊁3㊁5和7d时的叶片,用于RNA的提取㊂青12种子消毒后于MS 培养基萌发生长7d,幼苗分根冠取材㊁田间种植的青12植株于花期取花蕾㊁花和幼嫩角果用作组织表达分析㊂取材后迅速放入液氮中,置于-80ħ超低温冰箱冷冻保存㊂幼苗叶片也用于基因组DNA的提取㊂植物基因组DNA提取试剂盒㊁植物RNA提取试剂盒购自百泰克生物技术有限公司;Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶㊁5min TA/Blunt-Zero Cloning Kit克隆试剂盒㊁Fast-T1感受态细胞㊁HiScriptⅢ1st Strand cDNA合成试剂盒㊁HiScript ⅢRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反转录试剂盒㊁ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix荧光定量试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司㊂引物由华大基因合成㊂1.2㊀DNA、RNA提取与基因克隆㊀㊀按照试剂盒方法要求,提取纯化分离DNA和RNA㊂采用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性㊂分别以青花菜基因组DNA和cDNA为模板, 5ᶄ-ATGGCGGTGGAGCTCATGA-3ᶄ和5ᶄ-TCAAGACG ATTCCAAAATGAG-3ᶄ为上游与下游引物,引物用无菌水配制成浓度为10μmol㊃L-1的溶液备用㊂目标基因的扩增体系为50μL,包括5ˑSF Buffer 10μL,1μL dNTP(10mmol㊃L-1),上下游引物各2μL(10mmol㊃L-1),1μL模板和1μL Phanta Super-Fidelity DNA酶(1U㊃μL-1)㊂程序为: 95ħ预变性5min;95ħ变性20s,56ħ退火30s,72ħ延伸1.5min,30次循环;72ħ延伸10min㊂PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带,直接连接克隆载体,转入大肠埃希氏菌感受态细胞,随机挑选多个阳性克隆送华大基因进行测序,测序结果与NCBI比对㊂1.3㊀基因序列分析㊀㊀测序结果的核苷酸序列用DNAMAN等软件进行分析,利用在线软件ProtParam(https://web. /protparam/)进行蛋白质分子量㊁等电点㊁不稳定系数等分析;利用ProtScale(https:// /protscale/)进行亲疏水性分析;采用SMART在线工具(http://smart.embl.de/ smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)进行蛋白保守域分析,勾选PFAM domains选项;利用Cello (.tw/)进行亚细胞定位预测;采用DeepTMHMM(https://dtu.biolib. com/DeepTMHMM)进行跨膜结构预测㊂将获得的序列结果在NCBI数据库中进行BLAST分析,利用DNAMAN对相似蛋白序列进行同源比对㊂利用MEGA6.06软件以NJ法构建系统进化树,自举检测(Bootstrap)次数设为1000,并生成报告图形㊂1.4㊀基因的表达分析㊀㊀根据测序得到的基因序列,设计上下游引物5ᶄ-AGCATCTCCACAACGGAAAC-3ᶄ㊁5ᶄ-TTCTTGGA GCAATGACAACG-3ᶄ用于表达分析,以肌动蛋白基因5ᶄ-GACAACTTACAACTCCATCAT-3ᶄ和5ᶄ-CTCAT ACGGTCAGCGATA-3ᶄ为内参基因[19]㊂ABi7500实时荧光定量PCR仪用于PCR反应,反应体系包括:2ˑMaster Mix10μL,模板2.0μL,上下游引物(10μmol㊃L-1)各0.4μL,cDNA1μL,用水补充体积至20μL㊂反应参数:95ħ,10s; 95ħ,5s;60ħ,1min(40循环);基因相对表达量采用2-әәC T法[20]计算㊂2㊀结果与分析2.1㊀BoiWRKY15基因的克隆㊀㊀分别以青花菜基因组DNA和反转录所得cDNA为模板,利用PCR对青花菜BoiWRKY15基因全长进行扩增,琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果,获得片段的长度均为1000bp左右(图1)㊂经克隆后进行测序,测序结果在NCBI上进行比对,显示BoiWRKY15编码区序列与野甘蓝(Brassica oleracea var.oleracea)WRKY15(XM_013778166.1)和青花菜BOLC4T26829H完全一致㊂编码区全长为996bp,编码331个氨基酸㊂基因的DNA全长1058bp,具有2个长度均为31bp的内含子,内含子符合GT-AG规则㊂2.2㊀序列特征分析2272㊀㊀2023年第64卷第9期M Trans 5K DNA marker ladder;1 基因组DNA 扩增;2 编码区扩增㊂图1㊀青花菜BoiWRKY 15基因扩增结果㊀㊀对推导的蛋白质序列进行结构功能域分析发现,BoiWRKY15具有1个Plant _Zn _Clust 和1个WRKY 结构域,分别位于氨基酸的205~251和253~313处;WRKY 结构域中的锌指结构为C2H2型,可用通式C-X5-C-X23-H-X-H (X 为任意氨基酸)表示(图2)㊂ProtParam 在线分析BoiWRKY15的氨基酸序列得知,分子式为C 1544H 2479N 469O 488S 13,预测蛋白质分子量35837.30ku,理论等电点为9.75,不稳㊀㊀阴影部分为Plant_Zn_clust 结构域,方框内为WRKY 结构域㊂图2㊀青花菜BoiWRKY 15及其推导的氨基酸序列定系数为58.32,系不稳定蛋白㊂该基因编码的多肽中苏氨酸(Ser )含量最高,占总氨基酸的16.3%,其次为丙氨酸(Ala),约为9.7%㊂其总疏水平均系数(GRAVY)为-0.517,亲水性氨基酸比例较高,与ProtScale 分析结果具有一致性,可知该蛋白为亲水性蛋白(图3)㊂图3㊀BoiWRKY15的亲疏水性预测Cello 分析结果表明,BoiWRKY15定位于细胞核;跨膜结构域预测表明,BoiWRKY15不具有跨膜结构域㊂这与其作为转录因子发挥作用一致㊂2.3㊀氨基酸序列多重比对及聚类分析㊀㊀在GenBank 中,青花菜BoiWRKY15的氨基酸序列与众多十字花科植物的WRKY15蛋白序列具有较高的相似度,如野甘蓝(Brassica oleracea var.oleracea )XP_013633620.1㊁甘蓝型油菜(Brassica napus )XP _013686177.2㊁芜菁(Brassica rapa )NP_001288916.1㊁萝卜(Raphanus sativus )XP _018477660.1㊁山嵛菜(Eutrema salsugineum )XP_006404816.1㊁玉山筷子芥(Arabidopsis lyrata subsp.lyrata )XP _002878677.1㊁亚麻荠(Camelinasativa )XP _010429281.1㊁XP _010417085.1㊁拟南芥(Arabidopsis thaliana )NP _179913.1和荠(Capsella rubella )XP _006294625.1㊂将青花菜BoiWRKY15与这些已知WRKY15蛋白进行多重比对,结果表明,不同物种间的WRKY结构域具有高度相似性,它们的核心序列均为WRKYGQK,11个WRKY结构域序列仅玉山筷子芥和萝卜有两处氨基酸差异(图4)㊂NP_179913.1 拟南芥;XP_002878677.1 玉山筷子芥;XP_006294625.1 荠;XP_010417085.1 亚麻荠;XP_010429281.1 亚麻荠;XP_006404816.1 山嵛菜;XP_013633620.1 野甘蓝;XP_013686177.2 甘蓝型油菜;NP_001288916.1 芜菁;XP_ 018477660.1 萝卜㊂图4㊀WRKY多序列比对2274㊀㊀2023年第64卷第9期㊀㊀利用MEGA软件计算遗传距离,结果表明,这11条氨基酸序列的遗传距离为0~0.145,青花菜与野甘蓝之间的遗传距离最低,青花菜和荠的遗传距离最高(表1)㊂图5展示的家族系统进化关系分析表明,青花菜与野甘蓝的进化关系最近,二者与甘蓝型油菜㊁萝卜㊁芜菁可以归为一组,拟南芥和玉山筷子芥归为一组,亚麻荠和荠为一组,山萮菜自成一组㊂表1㊀青花菜BoiWRKY15及其同源序列的遗传距离BoiWRKY15及其同源序列BoiWRKY15NP_179913.1NP_001288916.1XP_002878677.1XP_006294625.1XP_006404816.1XP_010417085.1XP_010429281.1XP_013633620.1XP_013686177.2NP_179913.10.133 NP_001288916.10.0280.133 XP_002878677.10.1250.0420.125 XP_006294625.10.1450.0530.1330.075 XP_006404816.10.1100.1100.1060.1100.110 XP_010417085.10.1410.0680.1330.0790.0610.121 XP_010429281.10.1290.0610.1210.0720.0530.1130.014 XP_013633620.10.0000.1330.0280.1250.1450.1100.1410.129 XP_013686177.20.0070.1330.0280.1250.1450.1060.1410.1290.007 XP_018477660.10.0610.1100.0570.1020.1210.1060.1290.1130.0610.061㊀㊀注:NP_179913.1 拟南芥;NP_001288916.1 芜菁;XP_002878677.1 玉山筷子芥;XP_006294625.1 荠;XP_006404816.1 山嵛菜;XP_ 010417085.1 亚麻荠;XP_010429281.1 亚麻荠;XP_013633620.1 野甘蓝;XP_013686177.2 甘蓝型油菜;XP_018477660.1 萝卜㊂图5㊀青花菜BoiWRKY15及同源序列系统进化关系分析2.4㊀表达分析㊀㊀为明确青花菜BoiWRKY15的组织表达,通过qRT-PCR检测青花菜BoiWRKY15在幼苗根㊁冠,花期花蕾㊁花和幼嫩角果中的表达情况,结果发现,青花菜BoiWRKY15在苗期根冠中都有表达,根部表达略高于冠部,而在生殖器官中的表达都高于苗期营养器官,在开放的花和幼嫩角果中的表达量远高于苗期根冠中的表达(图6中A)㊂A 组织表达;B 野油菜黄单胞菌侵染下表达㊂图6㊀青花菜BoiWRKY15基因的表达情况㊀㊀而BoiWRKY15在野油菜黄单胞菌侵染下的表达模式检测结果表明,BoiWRKY15受野油菜黄单胞菌诱导,基因表达水平持续升高(图6中B)㊂0~3d增长缓慢,而5~7d表达量显著上升㊂3　讨论WRKY是植物特有的一类转录因子,其DNA 结合结构域包含约60个氨基酸,氨基端包含高度保守的WRKYGQK(色-精-赖-酪-甘-谷氨酰胺-赖氨酸)基序,并因此得名[21],羧基端含有一个类锌指结构的基序(CX4-7CX22-23HXH/C)[22]㊂依据WRKY结构域和锌指结构特点,WRKY转录因子分为3组,GroupⅠ包含两个WRKY结构域, GroupⅡ和Ⅲ仅有一个WRKY结构域,GroupⅠ和Ⅱ转录因子中的锌指结构类型为C2H2,而Group Ⅲ为C2HC[23]㊂本研究中,克隆得到的青花菜BoiWRKY15,它的序列与野甘蓝WRKY15最为接近,编码蛋白序列具有1个典型的WRKY结构域,特征序列为WRKYGQK,锌指结构为C2H2型,属于GroupⅡ㊂随着生物技术的发展成熟,大量WRKY家族成员逐渐被鉴定㊁分离和表达㊂已有大量研究发现WRKY转录因子响应多种生物和非生物的响应,参与调控植物生长发育过程㊂在青花菜BoiWRKY15的同源基因中,已报道拟南芥AtWRKY15受活性氧诱导以调节植物生长和盐/渗透胁迫反应,在AtWRKY15过表达植株中,受刺激的内质网与细胞核通讯被联系起来,从而在盐胁迫条件下破坏线粒体应激反应[24]㊂在油菜中, BnWRKY15过表达可能通过下调受菌核菌诱导的BnWRKY33的表达而增加了甘蓝型油菜对菌核病的易感性[25]㊂本研究中,青花菜BoiWRKY15基因的表达受野油菜黄单胞菌的诱导升高,暗示该基因可能与黑腐病抗性相关,同时,该基因在花中的高表达暗示其参与生长发育过程,具体作用需要进一步构建转基因植物株系来进行功能验证㊂本研究克隆了青花菜BoiWRKY15基因,并对其结构特征㊁系统进化㊁亚细胞定位预测及表达模式进行了分析,该基因表达受野油菜黄单胞菌的诱导,推测其参与抗性响应㊂为后续研究青花菜BoiWRKY15的功能和作用机制奠定了基础㊂参考文献:[1]㊀ILAHY R,TLILI I,PÉK Z,et al.Pre-and post-harvestfactors affecting glucosinolate content in broccoli[J].Frontiersin Nutrition,2020,7:147.[2]㊀WILLIAMS P H.Inheritance of resistance in cabbage to blackrot[J].Phytopathology,1972,62(2):247. 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