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一、实验目的1. 熟悉共聚焦显微镜的基本原理和操作方法。
2. 利用共聚焦显微镜观察细胞结构、细胞器和细胞内分子的分布情况。
3. 掌握共聚焦显微镜在生物学研究中的应用。
二、实验原理共聚焦显微镜（Confocal Microscopy）是一种利用激光光源、共聚焦光学系统和计算机图像处理技术进行细胞和组织结构观察的显微镜。
其基本原理是利用激光光源在样品上形成点光源，通过物镜聚焦到样品的焦平面上，激发荧光物质发出荧光。
由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，只有焦平面上的光才能通过探测针孔，从而实现对焦平面的荧光信号采集，同时抑制了背景光的干扰。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：细胞样品（如酵母细胞、植物细胞等）、荧光染料（如DAPI、FITC 等）、荧光标记抗体等。
2. 实验仪器：共聚焦显微镜、激光光源、物镜、扫描模块、探测器、计算机等。
四、实验步骤1. 样品制备：将细胞样品固定、染色，并进行适当处理，使其适合共聚焦显微镜观察。
2. 设定共聚焦显微镜参数：包括激光光源的波长、扫描速度、扫描范围等。
3. 观察细胞结构：使用共聚焦显微镜观察细胞的结构，如细胞核、细胞质、细胞器等。
4. 观察细胞器：使用荧光染料和荧光标记抗体对细胞器进行染色，观察其分布和形态。
5. 观察细胞内分子：使用荧光标记抗体对细胞内分子进行染色，观察其分布和动态变化。
6. 图像采集与处理：使用共聚焦显微镜采集图像，并通过计算机图像处理技术进行图像分析和三维重建。
五、实验结果与分析1. 观察到细胞核、细胞质、细胞器等细胞结构清晰可见，荧光染料和荧光标记抗体在细胞内分布均匀。
2. 观察到线粒体、内质网、高尔基体等细胞器在细胞内的分布和形态，为细胞器功能研究提供依据。
3. 观察到细胞内分子在细胞内的分布和动态变化，为细胞信号传导和分子调控研究提供线索。
六、实验讨论1. 共聚焦显微镜具有较高的分辨率和信噪比，能够观察细胞内部精细结构，为生物学研究提供有力工具。
共聚焦激光显微镜原理共聚焦激光显微镜是一种高分辨率的显微技术，它利用激光光束对样品进行扫描，通过聚焦和探测来获取高分辨率的图像。
下面将详细介绍共聚焦激光显微镜的原理。
1. 激光扫描共聚焦激光显微镜使用一个激光束对样品进行扫描。
这个激光束可以是单色或多色的，并且可以调节其波长和功率。
在扫描过程中，激光束会被反射、散射或吸收，从而产生不同的信号。
2. 共聚焦共聚焦是指将激光束聚焦到一个非常小的点上，通常在几百纳米以下。
这个点称为焦点，在这个点上产生了强烈的电磁场，可以使样品中的荧光物质发出荧光信号。
同时，在这个点周围也会有一定程度的荧光信号。
3. 探测探测是指检测样品中发出的荧光信号，并将其转换成电子信号。
探测器通常使用光电倍增管或者CCD相机，可以捕捉到非常微弱的荧光信号。
4. 三维成像共聚焦激光显微镜可以进行三维成像。
通过改变激光束的焦距，可以在样品中扫描不同深度的区域。
这样就可以获得样品的三维结构信息。
5. 高分辨率共聚焦激光显微镜具有非常高的分辨率。
由于激光束被聚焦到一个非常小的点上，因此可以获得非常高的空间分辨率。
同时，由于只有在焦点处才会产生荧光信号，因此也可以获得非常高的时间分辨率。
6. 应用共聚焦激光显微镜广泛应用于生物医学研究领域。
它可以用于观察细胞、组织和器官中的结构和功能，并且还可以用于研究生物大分子如蛋白质、核酸等的结构和功能。
总之，共聚焦激光显微镜是一种高分辨率、非侵入性、三维成像技术，在生物医学研究领域具有广泛的应用前景。
一、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。
Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA，能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合，与EGTA 不同的是Fura-2可发出荧光，并且结合Ca2+后荧光特性有改变，Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm和340 nm，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。
Fura-2为一极性很大的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。
后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2，与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。
并且，Fura-2与Ca2+解离容易，随着游离Ca2+的增加或减少，其荧光强度便随之变化。
因此，Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系，据此可以测定[Ca2+]i及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。
Fluo-3/AM是继Fura-2/AM等之后研制的新一代Ca2+ 荧光指示剂，与Fura-2/AM类似，Fluo-3/AM进入细胞后，酯基被水解掉，Fluo-3与细胞内游离Ca2+ 结合，因而其荧光强度可以反映细胞内游离Ca2+ 的浓度。
但优于Fura-2/AM的是，Fluo-3与Ca2+ 结合时的荧光强度较未结合Ca2+ 的游离形式高40 ~ 100倍，避免了自发荧光的干扰，因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映[Ca2+]i的变化。
此外，Fluo-3与Ca2+ 亲和力低，易解离，适合测定细胞内Ca2+ 的快速、微量变化。
Fluo-3 在可见光光谱激发，激发波长为488 nm，可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers, R., et al., 1996)。
共聚焦显微镜原理
共聚焦显微镜是一种高分辨率显微镜，它利用共聚焦原理观察样品的表面形貌和结构。
共聚焦显微镜具有高分辨率、高对比度和三维表面重建的优点，因此在材料科学、生物医学和纳米技术等领域得到了广泛的应用。
首先，共聚焦显微镜的工作原理是基于共焦原理。
共焦原理是指在焦平面上同时聚焦激光束和检测信号，通过这种方式可以获得高分辨率的图像。
共聚焦显微镜利用激光光源照射在样品表面，样品表面反射的光信号被激光束收集，然后经过光学系统聚焦到探测器上，最终形成样品的高分辨率图像。
其次，共聚焦显微镜的成像原理是通过探测器接收样品表面反射的光信号，并将这些信号转换成电信号。
然后通过信号处理系统对这些电信号进行处理，最终形成样品的图像。
共聚焦显微镜的成像原理保证了其在观察样品表面形貌和结构时具有高分辨率和高对比度的特点。
另外，共聚焦显微镜在成像过程中还可以实现三维表面重建。
通过对样品表面反射的光信号进行处理，可以获取样品表面的高度信息，从而实现对样品表面的三维重建。
这种特点使得共聚焦显微镜在观察微纳米结构和纳米材料时具有独特的优势。
总的来说，共聚焦显微镜是一种基于共焦原理的高分辨率显微镜，其工作原理是利用激光束和检测信号在焦平面上同时聚焦，成像原理是通过探测器接收样品表面反射的光信号，并将这些信号转换成电信号，最终形成样品的图像。
共聚焦显微镜在观察样品表面形貌和结构时具有高分辨率、高对比度和三维表面重建的优点，因此在材料科学、生物医学和纳米技术等领域得到了广泛的应用。
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。
把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。
1 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。
1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。
而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。
这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1．4用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。
而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。
由于综合利用了以上技术。
可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。
2 ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用目前,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ)、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ)等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
扫描共聚焦显微镜原理一、引言扫描共聚焦显微镜（Scanning Confocal Microscope，SCM）是一种先进的显微成像技术，它在生物学、医学、材料科学等领域有着广泛的应用。
与传统的显微镜相比，扫描共聚焦显微镜具有更高的分辨率和更好的成像质量。
本文将重点介绍扫描共聚焦显微镜的工作原理。
二、扫描共聚焦显微镜的工作原理扫描共聚焦显微镜的基本原理是通过逐点扫描样品，并对每个像素点的荧光信号进行检测和记录，从而获得高分辨率的图像。
以下是扫描共聚焦显微镜的工作原理：1.逐点扫描：扫描共聚焦显微镜使用快速振镜或声光器件等扫描装置，对样品进行逐点扫描。
在每个像素点上，激光束聚焦在样品上，激发荧光。
2.激发荧光：当激光束照射到样品上时，会激发荧光。
这些荧光信号是样品特性的反映，可以用于成像。
3.检测荧光信号：在每个像素点上，荧光信号被检测器收集并转换为电信号。
这个过程是在焦平面上完成的，因此每个像素点都有良好的焦深。
4.记录图像：电信号被记录并转换为数字信号，然后通过计算机进行图像处理和显示。
由于每个像素点的荧光信号都被独立记录，因此最终获得的图像具有高分辨率和高对比度。
5.图像重建：通过将所有像素点的图像信息组合起来，可以重建出整个样品的图像。
这个过程可以通过计算机软件实现。
三、扫描共聚焦显微镜的特点和优势扫描共聚焦显微镜具有以下特点和优势：1.高分辨率：由于逐点扫描和独立检测每个像素点的荧光信号，扫描共聚焦显微镜可以获得高分辨率的图像，远高于传统的显微镜。
2.更好的焦深：由于在焦平面上进行检测，每个像素点都有良好的焦深，使得获得的图像具有更好的立体感。
3.减少杂散光干扰：通过只检测焦平面的荧光信号，扫描共聚焦显微镜有效地减少了杂散光干扰，提高了图像的对比度。
4.定量分析：由于每个像素点的荧光信号都可以独立记录，因此可以对样品进行定量分析，如测量荧光强度、测量荧光光谱等。
5.适合各种样品：扫描共聚焦显微镜适用于各种样品，如生物切片、细胞培养物、组织样本等。
激光共聚焦显微镜样品制备激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率、高对比度的显微镜。
它采用了激光光源和共聚合焦系统，可以获得非常清晰的三维显微图像。
这种显微镜主要应用于生物学、药学和材料科学等领域，并且被广泛用于细胞和组织病理学研究，以及纳米材料表征等方面。
首先，样品制备的第一步通常是固定。
固定是指将样品中的细胞或组织固定在特定的位置和形态上，使其保持原有的结构和功能。
最常用的细胞固定方法是使用乙醛或甲醛进行化学固定。
这些化学试剂可以使细胞中的蛋白质交联并固定，保持细胞的形态和结构。
对于组织样本，常用的固定方法是将其浸泡在缓冲福尔马林中，然后进行脱水和浸渍。
然后，经过固定的样品通常需要进行处理和染色。
处理包括去除不需要的物质，如脂肪和胆固醇等。
通常使用洗涤剂，如Tween 20或Triton X-100来帮助去除这些物质。
染色是为了增强对细胞或组织的观察，通常使用DNA染料，如荧光素和硫醇葡萄糖等。
这些染料可以与DNA结合，形成荧光信号，从而使细胞核和染色体能够清晰可见。
接下来，样品需要进行脱水和包埋。
脱水是为了将样品中的水分逐渐去除，从而使其适应显微镜对环境要求。
这通常通过逐渐加入浓度递增的乙醇溶液来实现。
包埋是将样品固定在透明块中，以便于显微观察。
常用的包埋介质有琼脂和覆盖玻璃等。
总结起来，激光共聚焦显微镜样品制备是一项复杂的工作。
它需要对样品进行固定、处理、染色、脱水、包埋等一系列步骤，以便获得高质量的成像结果。
正确选择和操作样品制备方法是确保显微镜成像质量和结果准确性的关键。
因此，在进行激光共聚焦显微镜样品制备时，科研人员和实验室人员应该仔细参考上述步骤和技巧，以获得理想的实验结果。
激光共聚焦使用步骤总结共聚焦实验步骤1.提前将PBS放在37度水浴锅中。
2.将小皿从细胞培养箱中取出，弃掉培养液，用PBS洗2——3次，轻晃几下即可。
注，此步加PBS时一定要轻一点，否则细胞会漂浮起来。
3.弃掉PBS后加1ml 4%多聚甲醛，固定细胞，室温静置30min。
4.弃掉后加PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃。
5.弃掉后加0.1%Triton-X100 1ml，室温透膜静置15min。
6.弃掉后加PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃。
7. 5%PBS脱脂乳，封闭1h，可在摇床上轻晃，也可以室温静置。
8.一抗1h，可在摇床上轻晃。
9. PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃10.二抗1h。
避光可在摇床上轻晃11. PBS，1ml，3次，5min/次避光，可在摇床上轻晃12.DAPI染色15min避光，室温静置13. PBS，1ml，3次，5min/次，避光，可在摇床上轻晃14.激光共聚焦显微镜观察。
激光共聚焦显微镜使用步骤1.打开五个绿色按钮和一个钥匙2.将物镜调至最低点。
3.电脑开启，选择TCS_User4.双击LAS AF 注意，双击软件后就耐心等待不要碰显微镜上任何东西，此时系统正在校准数据。
5.点击OK6.选择configuration7.点击像“注射器”一样的图案Laser，此时后便会出现一个画面，四个小格405 Diode，Ardon，HeNe543，HeNe633和一个尺子一样的长线Stand by。
8.点击选择前三个小格405 Diode，Ardon，HeNe543，将Stand by拉到45左右。
9.选择Acquire10.先确定右侧区域油镜型号是Objective：63×1.4，如果不是点击下拉菜单选择。
11.选择seq，最下面会弹出Sequential Scan区域，该区域作用是根据自己实验需求选择相应激光通道，其中“＋”代表增加激光通道，“－”代表删除激光通道。
激光共聚焦样品制备步骤激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy，简称LSM）是一种高分辨率的光学显微技术，广泛应用于细胞和组织的研究领域。
在进行激光共聚焦样品制备之前，需要确保实验环境干净整洁，仪器设备正常运行。
下面是激光共聚焦样品制备的一般步骤。
1.样品准备：选择合适的细胞或组织样品。
可以使用活体细胞、培养细胞、切片等多种样品。
样品应该具备较好的生物活性和显微结构。
2.样品固定：为了保持样品的形态和结构，需要进行样品的固定处理。
根据不同的样品类型和研究目的，可以选择适合的固定方法，如甲醛、乙醇、冰醋酸、戊醛等。
3.渗透处理：有些样品在固定后会出现浸泡不透的情况，需要进行渗透处理，使固定液更好地渗透进入样品中。
常用的渗透处理方法有冷冻冰醋酸渗透、冷冻减压渗透、甘油渗透等。
4.包埋：将处理好的样品包埋到透明的固定剂中，以保持形态和结构。
常用的包埋材料有琼脂糖、明胶、聚乙二醇、树脂等。
包埋时要注意使样品均匀分布在包埋剂中，以免出现偏移或扭曲。
5.切片：将包埋好的样品切割成适当的厚度，通常为几十微米至几百微米。
切片的方法有冰刀切片、冷冻切片、石蜡切片等。
切片时需保持样品的完整性和结构。
6.平片处理：将切好的样品平片放在载玻片上，用适当的方法将其固定在玻片上。
常用的固定方法有热熔、冷冻、电荷吸附等。
固定后要确保样品牢固地固定在玻片上并保持平坦。
7.染色：根据需要，可以对样品进行染色增强显微镜观察的效果。
常用的染色方法有荧光染色、荧光蛋白标记、核酸染色等。
8.抗体处理：对于需要检测其中一种特定蛋白质的样品，可以使用特异性抗体进行处理，以增强该蛋白质的信号。
9.清洗：处理完样品后，要对样品进行适当的清洗，去除余留的固定剂、染色剂等。
10.封片：将处理好的样品加入封片介质，如卡宾胶、密封剂等，以减少光透射损失和防止样品变干。
11.显微镜观察：将制备好的样品放入激光共聚焦显微镜中，调整焦距和曝光时间，进行观察和拍摄。
第29卷第2期2010年4月电子显微学报Journal of Chinese Electron Microscopy SocietyVol-29，No.22010-04文章编号：1000-6281（2010）02-0185-04激光共聚焦显微镜样品制备方法（一）———细胞培养样品余礼厚（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海200031）摘要：随着激光共聚焦显微镜在生物学研究中的广泛应用，绿色荧光融合蛋白能够提供蛋白质在细胞体内的精确时空信息。
因此免疫荧光样品的制备也成为基本的细胞生物学实验方法。
本文主要介绍在培养细胞中表达绿色荧光融合蛋白及免疫荧光样品的制备过程。
关键词：绿色荧光蛋白；细胞培养；免疫荧光；激光共聚焦显微镜中图分类号：Q336文献标识码：A收稿日期：2010-03-20作者简介：余礼厚（1982－），男（汉族），四川自贡人，博士，E-mail ：lhyu@.随着生物学研究的不断深入，越来越多的研究要求在细胞体内（in vivo ），甚至是动物体水平上研究蛋白质功能或动态变化。
而随着检测设备的提升、各种显微技术的发展和标记手段的提高，使得研究者能够迅速、准确地观察到蛋白质在细胞内的表达情况和定位。
通过激光共聚焦显微镜观察荧光标记细胞内的蛋白质和分子，为生物学的研究提供了更直观的观测手段。
因此免疫荧光样品的制备也成为生物学研究中的基本技术方法。
鉴于生物体内的复杂多样性，制备免疫荧光样品的方法也存在一些差异。
本文主要介绍构建绿色荧光融合蛋白表达载体，并在培养细胞中表达绿色荧光融合蛋白及免疫荧光样品的制备过程。
1绿色荧光融合蛋白表达载体的构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein ，GFP ）及其突变体能在各种不同的生物系统中表达，这对细胞生物学的研究具有重要意义［1］。
而荧光蛋白的折叠能力及其同细胞内蛋白的融合能力，使研究者能直接在细胞体内观察到蛋白质的特性。
