激光共聚焦显微镜样品制备

电子显微学报J.Chin.Eleetr.Microse.Soc.第29卷图I气体CO:冷冻装置。

Fig.1Gas C02frozen equipment.镜下操作后,置于干冰上(临时无干冰,也可置于一80℃冰箱,待冷冻完全后,将样品移至冷冻切片机中,温度平衡后,将样品从冷冻包埋模具中取出,进行冷冻切片。

冷冻包埋模具见图2。

图2冷冻包埋模具。

Fig.2Frozen embedding mold.液氮冷冻法:成年小鼠和大鼠的脑及稍大一些的组织块也可采用此方法冷冻。

将组织块置于样品台的OCT中,为防止组织块爆裂,先在液氮中迅速浸提几次,时间从1s开始逐渐增加,直至样品温度与液氮温度平衡,之后移至冷冻切片机中,使温度与切片机箱体温度一致,进行冷冻切片。

直接冷冻法:将样品直接粘着在涂有OCT的样品台上,于冷冻切片机(箱体温度在一20℃以下中直接冷冻。

3冷冻组织切片的免疫荧光标记将冷冻组织切片从一80℃冰箱中取出,室温放置10min,待切片回温并干燥,浸于PBS中10min 洗去OCT,可以无需Triton处理,即可进行免疫荧光抗体标记,操作步骤与培养细胞反应方法相同口]。

反应在避光湿盒中进行,反应结束时用无荧光封固剂封片,4oC保存。

先用荧光显微镜观察,确认标记成功,移至激光共聚焦显微镜扫描成像。

4荧光染料及荧光蛋白传统应用于荧光标记的染料如异硫氰酸荧光素(fluoreseinisothiocyanate,FITC,ex490nm/em520 nm、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC,ex550nm//em 620am、罗丹明(Rhodamine,ex560nm/em540~ 660nnl、四甲基罗丹明(tetramethyl rhodamine, TMR,ex570nm/em595—600nm、德克萨斯红(Texas red,ex592nm/em610rim、氨甲基香豆素(Aminomethylcoumarin aceticacid,AMCA,ex345 nm/em425am等,结合激光共聚焦显微镜技术的发展,这些经典的荧光染料逐渐被层出不穷的新的荧光染料所替代。

激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope)激光扫描共聚焦显微镜(laser sea nning con focal microscope)，英文简写LSCM，俗称con focal。

LSCM是一种高科技显微镜，属于最先进的细胞生物学分析仪器。

我们学院使用的是瑞士徕卡公司(Leica)的TCS SP5型号的LSCM。

使用流程1、登陆或5号楼606室公用电脑下载?激光共聚焦预约使用审核表?，打印并填写。

2、联系卢剑清(手机：)审核并签名。

3、持已签名的?激光共聚焦预约使用审核表? 至5号楼610室预约使用时间，及领取钥匙，联系人：窦凯飞(手机：。

4、在熟练使用者的指导下，进行实验。

5、实验结束，及时归还钥匙。

仪器构造和原理LSCM的根本结构主要包括荧光显微镜系统及样品台、激光发射器、扫描器、检测器、图像存储处理和输出设备、计算机控制系统。

激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源，普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。

而LSCM以激光为光源，激光具有单色性强、方向性好、高亮度、相干性好等优点,可以防止普通显微镜的缺点。

一般常用的气体激光器如氩(Ar)、氪(Kr)、氦(He)、氖(Ne)。

illu min ati ng pin hole (照明针孔)：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。

且与detector pinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。

分光镜(BeamSplitter)：点光源发出的光经分光镜反射后，通过物镜在样品聚焦。

对标本内焦平面上的每一点进行扫描，Focal plane (焦平面)：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。

该光斑经过物镜和分光镜等一系列装置的处理，分别在照明针孔及探测针孔两处聚焦。

激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共焦显微镜是在传统光学显微镜的基础上，利用激光作为光源，采用共轭聚焦原理和装置，通过计算机对被观察物体进行数字图像处理的一套观察、分析和输出系统。

光学成像的分辨率提高了30%～40%。

荧光探针被紫外线或可见光激发，以获得细胞或组织内部微观结构的荧光图像。

在亚细胞水平上观察生理信号和细胞形态的变化。

它已成为形态学、分子生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域的新一代研究工具。

1激光扫描共聚焦显微镜（lscm）的原理就基本原理而言，共焦显微镜是一种现代光学显微镜。

对普通光学显微镜进行了以下技术改进：1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。

1.2利用共焦技术，在物镜的焦平面上放置一个带小孔的挡板，以阻挡焦平面外的杂散光，消除球差；并进一步消除色差1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。

而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。

这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。

1.4用计算机采集和处理光信号，用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。

而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。

由于综合利用了以上技术。

可以说ｌｓｃｍ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。

2lscm在生物医学研究中的应用目前,一台配置完备的ｌｓｃｍ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ｐｈ、微分干涉差显微镜(ｄｉｃ等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。

第29卷第2期2010年4月电子显微学报Journal of Chinese Electron Microscopy SocietyVol-29，No.22010-04文章编号：1000-6281（2010）02-0185-04激光共聚焦显微镜样品制备方法（一）———细胞培养样品余礼厚（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海200031）摘要：随着激光共聚焦显微镜在生物学研究中的广泛应用，绿色荧光融合蛋白能够提供蛋白质在细胞体内的精确时空信息。

因此免疫荧光样品的制备也成为基本的细胞生物学实验方法。

本文主要介绍在培养细胞中表达绿色荧光融合蛋白及免疫荧光样品的制备过程。

关键词：绿色荧光蛋白；细胞培养；免疫荧光；激光共聚焦显微镜中图分类号：Q336文献标识码：A收稿日期：2010-03-20作者简介：余礼厚（1982－），男（汉族），四川自贡人，博士，E-mail ：lhyu@.随着生物学研究的不断深入，越来越多的研究要求在细胞体内（in vivo ），甚至是动物体水平上研究蛋白质功能或动态变化。

而随着检测设备的提升、各种显微技术的发展和标记手段的提高，使得研究者能够迅速、准确地观察到蛋白质在细胞内的表达情况和定位。

通过激光共聚焦显微镜观察荧光标记细胞内的蛋白质和分子，为生物学的研究提供了更直观的观测手段。

因此免疫荧光样品的制备也成为生物学研究中的基本技术方法。

鉴于生物体内的复杂多样性，制备免疫荧光样品的方法也存在一些差异。

本文主要介绍构建绿色荧光融合蛋白表达载体，并在培养细胞中表达绿色荧光融合蛋白及免疫荧光样品的制备过程。

1绿色荧光融合蛋白表达载体的构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein ，GFP ）及其突变体能在各种不同的生物系统中表达，这对细胞生物学的研究具有重要意义［1］。

而荧光蛋白的折叠能力及其同细胞内蛋白的融合能力，使研究者能直接在细胞体内观察到蛋白质的特性。

第29卷第4期2010年8月电子显微学报Journal of Chinese Electron Microscopy SocietyVol.29，No.42010-08文章编号：1000-6281（2010）04-0399-04激光共聚焦显微镜样品制备方法（二）———组织切片样品边玮（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海200031）摘要：应用激光共聚焦显微镜技术对荧光标记的组织切片样品进行三维观察成像是生物学研究的常规手段。

本文主要介绍实验室制备用于激光共聚焦显微镜成像的冷冻组织切片及免疫荧光标记过程。

关键词：冷冻组织切片；免疫荧光；激光共聚焦显微镜成像中图分类号：Q336；TG115.21+5.3文献标识码：A收稿日期：2010-05-07作者简介：边玮（1964－），女（汉族），吉林蛟河人，高级工程师.E-mail ：weibian@.应用于激光共聚焦显微镜的组织切片样品多采用冷冻组织切片，可尽量保持组织样品的抗原活性。

组织采集后，经固定、冷冻包埋、冷冻切片、晾片，进行免疫荧光抗体标记。

1组织的采集、固定和保存不同来源的组织可依据实验条件和实验目的而采用不同的固定和保存方法。

实验室通常采用液氮冷冻法和多聚甲醛（PFA ）固定法。

液氮冷冻法：采取新鲜组织后，即可放入液氮中保存。

多聚甲醛固定法：小鼠、大鼠等实验动物经生理盐水和4%PFA 灌流，采取组织，组织块尽量小于1cm ˑ1cm ˑ1cm ，置于4%PFA 中进行后固定，后固定的时间可根据组织块的大小和致密程度而调整，可以4ħ固定过夜，或室温1 4h 。

之后，用0.01mol /L PBS 缓冲液洗3次，每次10 30min 。

在20%蔗糖中4ħ浸泡1h 以上，待组织块下沉后，即可进行冷冻切片。

组织块可置于4ħ冰箱保存于20%蔗糖（含0.05%NaN 3）中，一个月内完成切片。

表达荧光蛋白的实验动物组织，可遵循以上方法处理样品。

一、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。

Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA，能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合，与EGTA 不同的是Fura-2可发出荧光，并且结合Ca2+后荧光特性有改变，Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm和340 nm，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。

Fura-2为一极性很大的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。

后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2，与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。

并且，Fura-2与Ca2+解离容易，随着游离Ca2+的增加或减少，其荧光强度便随之变化。

因此，Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系，据此可以测定[Ca2+]i及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。

Fluo-3/AM是继Fura-2/AM等之后研制的新一代Ca2+ 荧光指示剂，与Fura-2/AM类似，Fluo-3/AM进入细胞后，酯基被水解掉，Fluo-3与细胞内游离Ca2+ 结合，因而其荧光强度可以反映细胞内游离Ca2+ 的浓度。

但优于Fura-2/AM的是，Fluo-3与Ca2+ 结合时的荧光强度较未结合Ca2+ 的游离形式高40 ~ 100倍，避免了自发荧光的干扰，因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映[Ca2+]i的变化。

此外，Fluo-3与Ca2+ 亲和力低，易解离，适合测定细胞内Ca2+ 的快速、微量变化。

Fluo-3 在可见光光谱激发，激发波长为488 nm，可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers, R., et al., 1996)。

非损伤性导入法：在正常的生理条件下加入Ca2+荧光探针与植物细胞共同孵育, 使探针渗入到细胞内的方法。

在培养液中加人荧光探针和增强膜透性的药物, 如去垢剂digitonin(毛地黄甘)、表面活性剂Pluronic F-127等, 药物使细胞膜通透性增强, 利于荧光探针的导入【1】。

周平等发现：在PH5.6条件下，绿豆、花生、水稻、烟草等细胞原生质体用5~10um ol/L Indo-1-K+或Fura-2-AM共同孵育1.5h,荧光探针可导入部分原生质体【2】。

样品的制备1：样品制备是上机检测前的关键步骤。

样品需经荧光探剂标记( 单标、双标、三标) 。

标本可以是固定的或活的组织, 也可以是固定的或活的贴壁培养, 细胞应培养在Confocal 专用小培养皿或盖玻片上, 悬浮细胞, 甩片或滴片后, 用盖玻片封片。

样品的最大厚度约1~ 2 mm, 使用的盖玻片厚度应小于0117mm, 载玻片厚度应在018~ 112 mm 之间, 而且表面光洁, 厚度均匀, 没有明显的干扰荧光。

固定样品常用封片剂进行封片,常用PH815- 9 的PBS 配制的甘油封片。

样品准备2：样品的最大厚度大约1~2mm(10×/ 0.4 物镜), 它取决于物镜的数值孔径(NA) 、物镜的工作距离、激光的穿透力以及样品的透明度。

一般要求是单层贴壁细胞, 可以是经荧光探针标记(单标、双标、三标)固定的或活的组织; 固定的或活的贴壁培养细胞(Confocal 专用小培养皿, 盖玻片); 用盖玻片封片的经甩片或滴片后的悬浮细胞。

对于非贴壁细胞的粘贴, 一般常用的粘贴剂有多聚赖氨酸﹑伴刀豆球蛋白﹑cell- tak﹑vectabond﹑琼脂凝胶等。

选择粘贴剂的标准是: 不影响实验目的, 对标本无损害[1]。

激光扫描共聚焦显微镜的样品制备技术3：3.1 取材组织标本：包括活检标本、手术切除标本、动物模型标本及尸检解剖标本等，应在标本离体后立即冰冻切片或贮存于-70℃冰箱备用，以充分保存组织的抗原性。

激光共聚焦拉曼显微镜检测标准在现代科学研究中，激光共聚焦拉曼显微镜（以下简称激光拉曼显微镜）已经成为一种常用的分析工具。

激光拉曼显微镜通过激发样品中的化学键振动，可以获得关于样品成分、结构和性质的信息，具有高灵敏度和高分辨率的特点。

然而，由于激光拉曼技术的复杂性和多样性，制定相应的检测标准显得尤为重要。

1. 激光拉曼技术的基本原理激光拉曼技术是一种非破坏性的光谱分析方法，通过使用激光和光谱仪来探测样品的分子振动信息。

当激光与样品相互作用时，部分光子被散射，而其余光子则会发生拉曼散射，从而获得特定频率的振动能级信息。

激光拉曼显微镜结合了共聚焦技术，可以实现光学显微镜和拉曼光谱仪的双重功能，不仅能够获得高分辨率的成像，还可以获得高灵敏度的拉曼光谱信息。

2. 制定激光拉曼显微镜检测标准的重要性由于激光拉曼技术的复杂性和多样性，制定相应的检测标准变得至关重要。

标准化的检测流程和方法可以保证实验数据的可靠性和准确性，同时也有利于不同实验室和研究机构之间的结果比对和交流。

制定检测标准还可以促进技术的进步和应用的普及，推动激光拉曼技术在不同领域的应用。

3. 激光拉曼显微镜检测标准的制定内容激光拉曼显微镜检测标准应包括样品制备、仪器校准、数据采集和分析等多个方面。

在样品制备方面，应该明确样品的准备方法、存放条件和处理步骤，以确保实验的可重复性和可比性。

仪器校准也是非常重要的环节，需要制定相应的校准方法和标准物质，以保证激光拉曼仪器的准确性和稳定性。

对于数据采集和分析，应该规定数据的采集参数、处理方法和结果解释的标准流程，以确保实验结果的可靠性和准确性。

4. 个人观点和总结在我看来，制定激光拉曼显微镜检测标准是非常必要的，可以保证激光拉曼技术在科研领域的可靠性和准确性。

我认为，在制定标准的过程中，应该充分考虑实际应用的需求和特点，同时也应该借鉴国际标准和先进经验，以期制定出通用、实用和可操作的检测标准。

激光共聚焦拉曼显微镜检测标准的制定对于推动该技术在不同领域的应用具有重要意义。

一、激光扫描共聚焦显微镜简介激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，简称CLSM）是近代生物医学图像仪器。

它是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针。

利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。

二、激光扫描共聚焦显微镜原理在普通宽视野光学显微镜中，整个标本全部都被水银弧光灯或氙灯的光线照明，图像可以用肉眼直接观察。

同时，来自焦点以外的其他区域的荧光对结构的干扰较大，尤其是标本的厚度在2um以上时，其影响更为明显。

激光共聚焦显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描。

组织样品中如果有可被激发的荧光物质，受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管（PMT）探测收集，并将信号输送到计算机，处理后在计算机显示器上显示图像。

在这个光路中，只有在焦平面的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不能通过小孔。

因此，非观察点的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。

由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔与探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦。

以激光作光源并对样品进行扫描，在此过程中两次聚焦，故称为激光扫描共聚焦显微镜。

三、激光扫描共焦显微镜的优点1.动态连续扫描及三维图像重组。

LSCM可以对对活细胞和组织或细胞切片样品的不同层面进行连续逐层扫描,来获得各个层面的图像，即所谓的“无损伤的光学切片”。

激光扫描共聚焦显微镜扫描的每个层面之间的间距可以达到0.1um甚至更小。

获得的图像通过计算机重组，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。