诺如病毒标本处理和实验室检测技术方案

诺如病毒感染的研究进展诺如病毒（Norovirus）是一种引起病毒性胃肠炎的病原体，属于杯状病毒科。

诺如病毒感染具有高度传染性，通常通过接触感染者的呕吐物、粪口途径传播。

全球范围内，诺如病毒感染的流行情况较为严重，每年导致数百万人患病，且在各种年龄段均可感染。

近年来，随着分子生物学和基因组学技术的快速发展，对诺如病毒的研究取得了显著进展。

研究人员已成功鉴定出多种诺如病毒血清型，并深入探讨了其遗传多样性和演化关系。

针对诺如病毒的预防与控制措施也取得了一定进展，例如通过改进饮食卫生、加强个人卫生习惯等手段有效降低感染风险。

尽管对诺如病毒的研究取得了一定成果，但在治疗方面仍存在许多问题。

目前尚无特效药物，主要以支持治疗为主，如补充水分和电解质等。

针对诺如病毒的疫苗研发也面临诸多挑战，如病毒变异快、免疫保护效果不持久等。

为应对诺如病毒感染存在的问题，未来的研究将更加注重以下几个方面：疫苗研发：通过深入研究诺如病毒的免疫机制，发掘有效的抗原靶点，研制出更加高效、持久的疫苗。

核酸检测：发展敏感、特异的核酸检测技术，以便更早地确诊感染，为临床治疗提供指导。

治疗策略：加强抗病毒药物的研究，发掘新型治疗策略，以提高治疗效果和降低并发症的发生。

流行病学研究：进一步了解全球不同地区诺如病毒的流行病学特征，为防控工作提供科学依据。

宣传教育与公众参与：加强公众对诺如病毒的认知教育，提高个人卫生意识，落实预防措施。

针对诺如病毒感染的研究仍需不断深入，未来将会有更多科研工作者致力于解决现存问题，共同应对这一全球性的公共卫生挑战。

单纯疱疹病毒（HSV）是一种常见的病毒感染，具有高度的传染性和致病性。

HSV可引起皮肤、黏膜和神经系统的炎症和感染，给患者带来极大的痛苦和不便。

因此，对HSV感染的研究具有重要意义，为预防、诊断和治疗该病毒感染提供了理论基础。

近年来，HSV感染的研究取得了显著的进展。

研究者们深入探讨了HSV的传播方式、发病机理、诊断方法以及治疗手段。

附件9广东省诺如病毒感染性腹泻样品检测工作指引诺如病毒的实验室检测方法主要包括核酸检测和抗原检测，核酸检测是目前国际上最常用的检测方法。

这些方法各有优缺点，在操作时可根据技术水平、经济条件和使用目的进行选择，对于检测结果应参照临床症状和流行病学特征进行分析。

一、标本处理（一）粪便将1ml PBS加入至1.5ml EP管或2ml 螺口管中，再加入0.1g 固体粪便标本或0.1ml液体粪便标本，臵于漩涡震荡器充分混匀，≥5000r/min离心5min，或≥3000r/min离心30min，吸上清，制成10%的便悬液，立即检测或臵-20℃冰箱保存备用。

注意便悬液如果过浓，可能导致提取的核酸中抑制物过多，影响核酸检测结果。

（二）肛拭子旋涡振荡器震荡15秒后，吸上清立即检测或臵-20℃冰箱保存备用。

（三）呕吐物臵于漩涡震荡器充分混匀，≥5000r/min离心5min，或≥3000r/min 离心30min，吸上清，立即检测或臵-20℃冰箱保存备用。

（四）环境涂抹标本经旋涡振荡器震荡15秒后，吸上清立即检测或臵-20℃冰箱保存备用。

二、标本检测（一）核酸检测- 38 -1.核酸提取目前有多种商业试剂可用于粪便等标本的核酸提取，可用病毒RNA提取试剂，也可用RNA&DNA总核酸提取试剂，具体提取方法按照试剂说明书。

采用总核酸提取试剂，在使用逆转录聚合酶链反应扩增核酸时容易受到来自人、细菌等非目标物种基因的影响，产生假阳性，因此以RNA提取试剂为佳。

核酸提取完成后，尽快放入冰箱保存，如果3天内开展核酸检测，10℃以下保存即可，超过这个时间需放入-70℃冰箱保存。

注意尽量不要让核酸被环境中、手套上的细菌、灰尘中含有的RNA酶降解，也不要反复冻融。

2．荧光逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)本方法是诺如病毒核酸检测的首选方法，特异性和敏感性较高，出现假阳性的机率也远低于传统RT-PCR，但受病毒核酸变异影响较RT-PCR大。

诺如病毒实验室检测诺瓦克病毒（Norwalk Viruses，NV）是人类杯状病毒科(Human Calicivirus，HuCV)中诺如病毒（Norovirus,NV）属的原型代表株。

NV是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。

诺瓦克病毒最早是从1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻的患者粪便中分离的病原。

2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病毒（Norovirus,NV）。

诺如病毒与在日本发现的札幌样病毒（Sapporo-like Virus，SLV），正式名称为札如病毒(Sapovirus,SV)，合称为人类杯状病毒。

诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。

诺如病毒抗体没有显著的保护作用，尤其是没有长期免疫保护作用，极易造成反复感染。

诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。

诺如病毒有许多共同特征：直径约为26～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称；从急性胃肠炎病人的粪便中分离，不能在细胞或组织中培养，也没有合适的动物模型；基因组为单股正链RNA；在氯化铯密度梯度中的浮力密度为1.36～1.41g/cm3；电镜下缺乏显著的形态学特征，负染色电镜照片显示，NV是具有典型的羽状外缘，表面有凹痕的小圆状结构病毒。

诺如病毒根据遗传性分为5个基因组，至少有29个基因群，其中基因组I （GGI）有8个基因群，基因组II（GGII）有17个基因群，基因组III（GGIII）有2个基因群，基因组IV（GGIV）和基因组V（GGV）各有1个基因群。

与人类有关的主要是GGI、GGII和GGIV。

一、标本采集注意事项：粪便标本应在发病首日采集，至多不能超过发病急性期(48～72h)，此时为稀、软便，病毒排出量最多。

病毒含量较高的样品浸出液或体液，可不经过病毒分离直接用于诊断鉴定。

病毒含量较少的样品，则需通过病毒的分离增殖来提高诊断的准确性和鉴定的可靠性。

病毒分离首先要对样品进行适当的处理，然后接种实验动物或培养的组织细胞。

(一) 组织器官样品的处理1.用无菌操作取一小块样品，充分剪碎，置乳钵中加玻璃砂研磨或用组织捣碎机制成匀浆，随后加1-2 ml Hank’s平衡盐溶液制成组织悬液，再加1-2 ml继续研磨，逐渐制成10%-20%的悬液；2.加入复合抗生素；3.以800×g离心15min；4.取上清液用于病毒分离。

必要时可用有机溶剂去除杂蛋白和进行浓缩（见下文）。

(二) 粪便样品的处理1.加4g的粪便于16ml Hank’s平衡盐容液中制成20%的悬液；2.于密闭的容器中强烈振荡30min，如果可能则加入玻璃球；3.以6000×g低温离心30min，取上清液再次重复离心；4.用450nm的微孔滤膜过滤；5.加二倍浓度的复合抗生素。

然后直接用于病毒分离或进行必要的浓缩后再行病毒分离。

(三) 无菌的体液（腹水、脊髓液、脱纤血液、水泡液等）和鸡胚液样品可不做处理，直接用于病毒分离。

注：Hank’s平衡盐溶液和复合抗生素的配制见细胞培养溶液的配制。

(四) 样品的特殊除菌处理样品经过上述一般处理即可用于病毒分离，但对某些样品用一般方法难以去除的污染，则应考虑配合如下方法进行处理。

1.乙醚除菌对有些病毒（如肠道病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、小RNA病毒等对乙醚有抵抗力）可用冷乙醚对半加入样品悬液中充分振荡，置4℃过液。

取用下层水相分离病毒。

2.染料普鲁黄（Proflavin）除菌由于其对肠道病毒和鼻病毒很少或没有影响，常用作粪或喉头样品中细菌的光动力灭活剂。

将样品用0.0001mol/L pH9.0的普鲁黄于37℃作用60min，随后用离子交换树脂除去染料，将样品暴露于白光下，即可使其中已经被光致敏的细菌或霉菌灭活。

诺如病毒感染及其实验室检查林迪;孙长贵【摘要】诺如病毒性胃肠炎是一组由诺如病毒感染引起，以恶心、呕吐、腹痛和腹泻为主要临床表现的肠道传染病，2006年美国疾病控制中心(CDC)将其列为生物恐怖B类因子。

诺如病毒性胃肠炎在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，我国历年病毒性腹泻监测数据显示，每年的11月至次年3月为诺如病毒性胃肠炎的高发季节。

2014年上半年我国嘉兴、北京、江苏等地区都相继出现了诺如病毒感染事件，2014年11月广州南洋理工职业学院再次暴发诺如病毒感染，受感染人数达274例,未有死亡病例。

本文就该病毒的结构、生物学特性、流行病学、临床表现、诊断与鉴别诊断和实验室检查等作简要综述。

【期刊名称】《实验与检验医学》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】3页(P1-3)【关键词】诺如病毒;诺如病毒性胃肠炎;感染;实验室检查【作者】林迪;孙长贵【作者单位】解放军第117医院检验科南京军区医学检验质控中心，浙江杭州310013;解放军第117医院检验科南京军区医学检验质控中心，浙江杭州310013【正文语种】中文【中图分类】R373.2;R446诺如病毒(Norovirus，NV)是世界范围内引起人类非细菌性急性胃肠炎的一种高度传染性病原菌[1]，该病毒具有高度感染性,传播途径广泛,人群普遍易感,容易在餐馆、学校、社区、医院、托儿所、养老院等聚集性场所引起集体暴发[2]。

在美国，据估计诺如病毒每年将造成2100万人感染，71000人住院治疗，800人死亡[3]。

诺如病毒原型株诺瓦克病毒(Norwalk virus)于1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻患者粪便中分离到，1972年Kapikian等人通过免疫电子显微镜从患者的粪便中检测到直径为27 nm的病毒颗粒，命名为诺瓦克病毒[4]。

2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病毒。

1995年，中国报道了首例诺如病毒感染，之后山西、北京、安徽、福州、武汉、广州、浙江嘉兴等地区先后发生多起诺如病毒感染性腹泻暴发疫情。

诺如病毒检验（食品微生物学检验）食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验1范围本标准规定了食品中诺如病毒(N o r o v i r u s)的实时荧光R T-P C R检测方法三本标准适用于贝类,生食蔬菜,胡萝卜二瓜二坚果等硬质表面食品,草莓二西红柿二葡萄等软质水果等食品中诺如病毒核酸的检测三2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1实时荧光P C R仪三2.2冷冻离心机三2.3无菌刀片或等效均质器三2.4涡旋仪三2.5天平:感量为0.1g三2.6振荡器三2.7水浴锅三2.8离心机三2.9高压灭菌锅三2.10低温冰箱:-80?三2.11微量移液器三2.12p H计或精密p H试纸三2.13网状过滤袋:400m L三2.14无菌棉拭子三2.15无菌贝类剥刀三2.16橡胶垫三2.17无菌剪刀三2.18无菌钳子三2.19无菌培养皿三2.20无R N a s e玻璃容器:见E.1.2三2.21无R N a s e离心管二无R N a s e移液器吸嘴二无R N a s e药匙二无R N a s e P C R薄壁管:见E.1.3三3试剂除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水均为无R N a s e超纯水:见E.2.1三3.1 GⅠ二GⅡ基因型诺如病毒的引物二探针:见A.1三3.2过程控制病毒的引物二探针:见A.1三3.3过程控制病毒:制备见附录C三3.4外加扩增控制R N A:制备见附录D三3.5 T r i s/甘氨酸/牛肉膏(T G B E)缓冲液:见E.2.2三3.65?P E G/N a C l溶液(500g/L聚乙二醇P E G8000,1.5m o l/LN a C l):见E.2.3三3.7磷酸盐缓冲液(P B S):见E.2.4三3.8氯仿/正丁醇的混合液:见E.2.5三3.9蛋白酶K溶液:见E.2.6三3.1075%乙醇:见E.2.7三3.11 T r i z o l试剂:见E.2.8三4检验程序诺如病毒检验程序见图1三图1诺如病毒检验程序5操作步骤5.1病毒提取注:样品处理一般应在4?以下的环境中进行运输三实验室接到样品后应尽快进行检测,如果暂时不能检测应将样品保存在-80?冰箱中,试验前解冻三样品处理和P C R反应应在单独的工作区域或房间进行三每个样品可设置2~3个平行处理三5.1.1软质水果和生食蔬菜5.1.1.1将25g软质水果或生食蔬菜切成约2.5c m?2.5c m?2.5c m的小块(如水果或蔬菜小于该体积,可不切)三5.1.1.2将样品小块移至带有400m L网状过滤袋的样品袋,加入40m LT G B E溶液(软质水果样品,需加入30U A.n i g e r果胶酶,或1140U A.a c u l e a t u s果胶酶),加入10μL过程控制病毒三5.1.1.3室温,60次/m i n,振荡20m i n三酸性软质水果需在振荡过程中,每隔10m i n检测p H,如p H 低于9.0时,使用1m o l/LN a O H调p H至9.5,每调整一次p H,延长振荡时间10m i n三5.1.1.4将振荡液转移至离心管,如体积较大,可使用2根离心管三10000r/m i n,4?,离心30m i n三取上清至干净试管或三角瓶,用1m o l/L H C l调p H至7.0三5.1.1.5加入0.25倍体积5?P E G/N a C l溶液,使终溶液浓度为100g/LP E G,0.3m o l/L N a C l三60s 摇匀,4?,60次/m i n,振荡60m i n三10000r/m i n,4?,离心30m i n,弃上清三10000r/m i n,4?,离心5m i n紧实沉淀,弃上清三5.1.1.6500μLP B S悬浮沉淀三如食品样品为生食蔬菜,可直接将悬浮液转移至干净试管,测定并记录悬浮液毫升数,用于后续R N A提取三如食品样品为软质水果,将悬浮液转移至耐氯仿试管中三加入500μL氯仿/丁醇混合液,涡旋混匀,室温静置5m i n三10000r/m i n,4?,离心15m i n,将液相部分仔细转移至干净试管,测定并记录悬浮液毫升数,用于后续R N A提取三5.1.2硬质表面食品5.1.2.1将无菌棉拭子使用P B S湿润后,用力擦拭食品表面(<100c m2)三记录擦拭面积三将10μL 过程控制病毒添加至该棉拭子三5.1.2.2将棉拭子浸入含490μLP B S试管中,紧贴试管一侧挤压出液体三如此重复浸入和挤压3~4次,确保挤压出最大量的病毒,测定并记录液体毫升数,用于后续R N A提取三硬质食品表面过于粗糙,可能会损坏棉拭子,可使用多个棉拭子三5.1.3贝类5.1.3.1戴上防护手套,使用无菌贝类剥刀打开至少10个贝类三5.1.3.2使用无菌剪刀二手术钳或其他等效器具在胶垫上解剖出贝类软体组织中的消化腺,置于干净培养皿中三收集2.0g三5.1.3.3使用无菌刀片或等效均质器将消化腺匀浆后,转移至离心管三加入10μL过程控制病毒三加入2.0m L蛋白酶K溶液,混匀三5.1.3.4使用恒温摇床或等效装置,37?,320次/m i n,振荡60m i n 三5.1.3.5将试管放入水浴或等效装置,60?,15m i n三室温,3000r/mi n,5m i n离心,将上清液转移至干净试管,测定并记录上清液m L数,用于后续R N A提取三5.2病毒R N A提取和纯化注:病毒R N A可手工提取和纯化,也可使用商品化病毒R N A提取纯化试剂盒三提取完成后,为延长R N A保存时间可选择性加入R N a s e抑制剂三操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套,并经常更换三提取出来的R N A立即进行反应,或保存在4?小于8h三如果长期储存建议-80?保存三5.2.1病毒裂解将病毒提取液加入离心管,加入病毒提取液等体积T r i z o l试剂,混匀,激烈振荡,室温放置5m i n,加入0.2倍体积氯仿,涡旋剧烈混匀30s(不能过于强烈,以免产生乳化层,也可用手颠倒混匀),12000r/m i n,离心5m i n,上层水相移入新离心管中,不能吸出中间层三5.2.2病毒R N A提取离心管中加入等体积异丙醇,颠倒混匀,室温放置5m i n,12000r/m i n,离心5m i n,弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)三5.2.3病毒R N A纯化5.2.3.1每次加入等体积75%乙醇,颠倒洗涤R N A沉淀2次三5.2.3.2于4?,12000r/m i n,离心10m i n,小心弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)三或小心倒去上清液,用微量加样器将其吸干,一份样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀,室温干燥3m i n,不能过于干燥,以免R N A不溶三5.2.3.3加入16μL无R N a s e超纯水,轻轻混匀,溶解管壁上的RN A,2000r/m i n,离心5s,冰上保存备用三5.3质量控制5.3.1空白对照以无R N a s e超纯水作为空白对照(A反应孔)三5.3.2阴性对照以不含有诺如病毒的贝类,提取R N A,作为阴性对照(B反应孔)三5.3.3阳性对照以外加扩增控制R N A,作为阳性对照(J反应孔)三5.3.4过程控制病毒5.3.4.1以食品中过程控制病毒R N A的提取效率表示食品中诺如病毒R N A的提取效率,作为病毒提取过程控制三5.3.4.2将过程控制病毒按5.2步骤提取和纯化R N A三可大量提取,分装为10μL过程控制病毒的R N A量,-80?保存,每次检测时取出使用三5.3.4.3将10μL过程控制病毒的R N A进行数次10倍梯度稀释(D~G反应孔),加入过程控制病毒引物二探针,采用与诺如病毒实时荧光R T-P C R反应相同的反应条件确定未稀释和梯度稀释过程病毒R N A 的C t值三5.3.4.4以未稀释和梯度稀释过程控制病毒R N A的浓度l g值为X轴,以其C t值为Y轴,建立标准曲线;标准曲线r2应?0.98三未稀释过程控制病毒R N A浓度为1,梯度稀释过程控制R N A浓度分别为10-1二10-2二10-3等三5.3.4.5将含过程控制病毒食品样品R N A(C反应孔),加入过程控制病毒引物二探针,采用诺如病毒实时荧光R T-P C R反应相同的反应体系和参数,进行实时荧光R T-P C R反应,确定C t值,代入标准曲线,计算经过病毒提取等步骤后的过程控制病毒R N A浓度三5.3.4.6计算提取效率,提取效率=经病毒提取等步骤后的过程控制病毒R N A浓度?100%,即(C反应孔)C t值对应浓度?100%三5.3.5外加扩增控制5.3.5.1通过外加扩增控制R N A,计算扩增抑制指数,作为扩增控制三5.3.5.2外加扩增控制R N A分别加入含过程控制病毒食品样品R N A(H反应孔)二10-1稀释的含过程控制病毒食品样品R N A(I反应孔)二无R N a s e超纯水(J反应孔),加入GⅠ或GⅡ型引物探针,采用附录C反应体系和参数,进行实时荧光R T-P C R反应,确定C t值三5.3.5.3计算扩增抑制指数,抑制指数=(含过程控制病毒食品样品R N A+外加扩增控制R N A)C t值-(无R N a s e超纯水+外加扩增控制R N A)C t值,即抑制指数=(H 反应孔)C t值-(J反应孔)C t值三如抑制指数?2.00,需比较10倍稀释食品样品的抑制指数,即抑制指数=(I反应孔)C t值-(J反应孔)C t值三5.4实时荧光R T-P C R实时荧光R T-P C R反应体系和反应参数详见附录B三反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整三可采用商业化实时荧光R T-P C R试剂盒三也可增加调整反应孔,实现一次反应完成GⅠ和GⅡ型诺如病毒的独立检测三将18.5μL实时荧光R T-P C R反应体系添加至反应孔后,不同反应孔加入下述不同物质,检测GⅠ或GⅡ基因型诺如病毒三A反应孔:空白对照,加入5μL无R N a s e超纯水+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;B反应孔:阴性对照,加入5μL阴性提取对照R N A+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;C反应孔:病毒提取过程控制1,加入5μL含过程控制病毒食品样品R N A+1.5μL过程控制病毒引物探针;D反应孔:病毒提取过程控制2,加入5μL过程控制病毒R N A+1.5μL过程控制病毒引物探针; E反应孔:病毒提取过程控制3,加入5μL10-1倍稀释过程控制病毒R N A+1.5μL过程控制病毒引物探针;F反应孔:病毒提取过程控制4,加入5μL10-2倍稀释过程控制病毒R N A+1.5μL过程控制病毒引物探针;G反应孔:病毒提取过程控制5,加入5μL10-3倍稀释过程控制病毒R N A+1.5μL过程控制病毒引物探针;H反应孔:扩增控制1,加入5μL含过程控制病毒食品样品R N A+1μL外加扩增控制R N A+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;I反应孔:扩增控制2,加入5μL10-1倍稀释的含过程控制病毒食品样品R N A+1μL外加扩增控制R N A+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;J反应孔:扩增控制3/阳性对照,加入5μL无R N a s e超纯水+1μL 外加扩增控制R N A+1.5μL GⅠ或GⅡ型引物探针;K反应孔:样品1,加入5μL含过程控制病毒食品样品R N A+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针; L反应孔:样品2,加入5μL10-1倍稀释的含过程控制病毒食品样品R N A+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针三6结果与报告6.1检测有效性判定6.1.1需满足以下质量控制要求,检测方有效:空白对照阴性(A反应孔);阴性对照阴性(B反应孔);阳性对照(J反应孔)阳性三6.1.2过程控制(C~G反应孔)需满足:提取效率?1%;如提取效率<1%,需重新检测;但如提取效率<1%,检测结果为阳性,也可酌情判定为阳性三6.1.3扩增控制(H~J反应孔)需满足:抑制指数<2.00;如抑制指数?2.00,需比较10倍稀释食品样品的抑制指数;如10倍稀释食品样品扩增的抑制指数<2.00,则扩增有效,且需采用10倍稀释食品样品R N A 的C t值作为结果;10倍稀释食品样品扩增的抑制指数也?2.00时,扩增可能无效,需要重新检测;但如抑制指数?2.00,检测结果为阳性,也可酌情判定为阳性三6.2结果判定待测样品的C t值大于等于45时,判定为诺如病毒阴性;待测样品的C t值小于等于38时,判定为诺如病毒阳性;待测样品的C t值大于38,小于45时,应重新检测;重新检测结果大于等于45时,判定为诺如病毒阴性;小于等于38时,判定为诺如病毒阳性三6.3报告根据检测结果,报告检出诺如病毒基因或未检出诺如病毒基因三附录A实时荧光R T-P C R引物和探针GⅠ二GⅡ型诺如病毒实时荧光R T-P C R引物和探针见表A.1三表A.1GⅠ二GⅡ型诺如病毒实时荧光R T-P C R引物和探针病毒名称序列扩增产物长度/b p序列位置诺如病毒GⅠQ N I F4(上游引物):5 -C G CT G G A T GC G N T T CC A T-3 ;N V1L C R(下游引物):5 -C C TT A G A C GC C AT C AT C AT T T A C-3 ;N V G G1p(探针):5 -F AM-T G G A C A G G A G A Y C G C R A T C T-T AM R A-386位于诺如病毒(G e n B a n k登录号m87661)的5291~5376诺如病毒GⅡQ N I F2(上游引物):5 -A T G T T CA G RT G GA T G A G RT T CT C W G A-3 ;C O G2R(下游引物):5 -T C G A C G C C A T C T T C A T T C A C A-3 ;Q N I F s(探针):5 -F AM-A G C A C G T G G G A G G G C G A T G G-T AM R A-389位于L o r d s d a l e病毒(G e n B a n k登录号x86557)的5012~5100附录 B实时荧光R T -P C R 的反应体系和参数B .1 实时荧光R T -PC R 反应体系见表B .1三表B .1 实时荧光R T -P C R 反应体系名称储存液浓度终浓度加样量/μL GⅠGⅡ过程控制病毒R T -P C R 缓冲溶液5?1?555M g S O 425mm o l /L 1mm o l /L 111d N T P s 10mm o l /L 0.2mm o l /L0.50.50.5正义引物50μm o l /L 1μm o l /L 0.50.50.5反义引物50μm o l /L 1μm o l /L 0.50.50.5逆转录酶5U /μL 0.1U /μL 0.50.50.5D N A 聚合酶5U /μL 0.1U /μL 0.50.50.5探针5μm o l /L 0.1μm o l /L0.50.50.5R N A 模板――555水(无R N a s e)――111111总体积――252525B .2 实时荧光R T -P C R 反应参数见表B .2三表B .2 实时荧光R T -P C R 反应参数步骤温度和时间循环数R T 55?,1h1预热95?,5m i n 1扩增变性95?,15s退火延伸60?,1m i n 65?,1m i n 45附录C过程控制病毒培养及引物二探针C.1概要本标准使用过程控制病毒进行过程控制,可使用门哥病毒或其他等效,不与诺如病毒交叉反应的病毒三门哥病毒是小核糖核酸病毒科的鼠病毒三门哥病毒株M C0是一种重组病毒,与野生型门哥病毒相比缺乏p o l y[C],是与野生型门哥病毒具有相似生长特性的无毒表型三门哥病毒株M C0是一种转基因生物,如果检测实验室不允许使用转基因生物,可以使用其他的过程控制病毒三也可使用商业化试剂或试剂盒中的过程控制病毒三C.2培养试剂和仪器C.2.1H e L a细胞推荐使用E a g l e最低必需培养液(E a g l e sm i n i m u me s s e n t i a lm e d i u m,M E M)培养,并将2m m o l/L L-谷氨酸和E a r l e sB S S调为1.5g/L碳酸氢钠,0.1mm o l/L非必需氨基酸,1.0mm o l/L丙酮酸钠, 1?链霉素/青霉素液,100m L/L(生长)或20m L/L(维持)胎牛血清三C.2.2仪器为确保细胞培养和病毒生长,需细胞培养所需的C O2浓度可调培养箱,细菌培养耗材(例如培养皿)等三C.3培养过程门哥病毒培养在铺满80%~90%单层H e L a(A T C C C C L-2T M)细胞中,置于50m L/LC O2的气氛中(开放培养箱)或不可调的气氛中(封闭培养箱),直至75%出现细胞病理效应三细胞培养器皿经过一个冻融循环,将培养物3000r/m i n离心10m i n三将细胞培养物离心上清留存用于过程控制三C.4引物二探针过程控制病毒(门哥病毒)实时荧光R T-P C R的引物二探针见表C.1三采用其他等效的过程控制病毒,需对应调整引物探针三表C.1过程控制病毒(门哥病毒)实时荧光R T-P C R的引物二探针病毒名称序列扩增产物长度/b p序列位置门哥病毒M e n g o110(上游引物):5 -G C G G G TC C T G C CG A A A G T-3M e n g o209(下游引物):5 -G A A G T A A C A T A T A G A C A G A C GC A C A C-3M e n g o147(探针):5 -F AM-A T CA C AT T AC T GG C CG A AG C-MG-B N F Q-3100位于门哥病毒缺失毒株M C0(详见附录D)的110~209;相当于门哥病毒非缺失毒株M(G e n B a n k登录号122089)的序列110~270附录D外加扩增控制R N A制备1)D.1概要通过将目标D N A序列连接至合适的质粒载体上,目标序列位于R N A聚合酶启动子序列的下游序列,从而表达出外部扩增控制R N A三GⅠ型外部扩增R N A序列位于诺如病毒(G e n B a n k登录号m87661)的5291~5376三GⅡ型外部扩增R N A序列位于L o r d s d a l e病毒(G e n B a n k登录号x86557)的5012~5100三D.2试剂和设备D.2.1限制性酶:用于连接及相关的缓冲液三D.2.2 D N A纯化试剂三D.2.3体外R N A转录试剂(R N A聚合酶,N T P s,缓冲液等)三D.2.4 R N a s e-f r e eD N a s e三D.2.5 R N A纯化试剂三D.2.6 D N A凝胶电泳试剂和设备三D.2.7培养箱:37?三D.3质粒D N A连接添加100n g~500n g纯化的目标D N A和质粒载体加入含有合适的限制酶和缓冲液的反应体系中,限制酶和缓冲液的使用按照酶厂家推荐,并确保目标序列位于质粒中R N A聚合酶启动子序列的下游三37?培养120m i n三D N A纯化使用D N A纯化试剂纯化三使用凝胶电泳检查连接情况,比较连接前与连接后目标D N A和质粒情况三D.4外加扩增控制R N A的表达添加连接后的质粒至转化体系三该体系按照转化体系提供厂家建议配置三使用R N A纯化试剂纯化R N A后,分装,-80?储存,每次检测前取出备用三1)可使用等效的商业化检测试剂盒中的外加扩增控制R N A储备液,或者请生物公司代为制备三。