诺如病毒标本处理和室检测技术方案

附件9广东省诺如病毒感染性腹泻样品检测工作指引诺如病毒的实验室检测方法主要包括核酸检测和抗原检测，核酸检测是目前国际上最常用的检测方法。

这些方法各有优缺点，在操作时可根据技术水平、经济条件和使用目的进行选择，对于检测结果应参照临床症状和流行病学特征进行分析。

一、标本处理（一）粪便将1ml PBS加入至1.5ml EP管或2ml 螺口管中，再加入0.1g 固体粪便标本或0.1ml液体粪便标本，臵于漩涡震荡器充分混匀，≥5000r/min离心5min，或≥3000r/min离心30min，吸上清，制成10%的便悬液，立即检测或臵-20℃冰箱保存备用。

注意便悬液如果过浓，可能导致提取的核酸中抑制物过多，影响核酸检测结果。

（二）肛拭子旋涡振荡器震荡15秒后，吸上清立即检测或臵-20℃冰箱保存备用。

（三）呕吐物臵于漩涡震荡器充分混匀，≥5000r/min离心5min，或≥3000r/min 离心30min，吸上清，立即检测或臵-20℃冰箱保存备用。

（四）环境涂抹标本经旋涡振荡器震荡15秒后，吸上清立即检测或臵-20℃冰箱保存备用。

二、标本检测（一）核酸检测- 38 -1.核酸提取目前有多种商业试剂可用于粪便等标本的核酸提取，可用病毒RNA提取试剂，也可用RNA&DNA总核酸提取试剂，具体提取方法按照试剂说明书。

采用总核酸提取试剂，在使用逆转录聚合酶链反应扩增核酸时容易受到来自人、细菌等非目标物种基因的影响，产生假阳性，因此以RNA提取试剂为佳。

核酸提取完成后，尽快放入冰箱保存，如果3天内开展核酸检测，10℃以下保存即可，超过这个时间需放入-70℃冰箱保存。

注意尽量不要让核酸被环境中、手套上的细菌、灰尘中含有的RNA酶降解，也不要反复冻融。

2．荧光逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)本方法是诺如病毒核酸检测的首选方法，特异性和敏感性较高，出现假阳性的机率也远低于传统RT-PCR，但受病毒核酸变异影响较RT-PCR大。

诺如病毒消毒隔离措施（必看）根据卫生部《消毒技术规范(2002 年版)》，针对诺如病毒建议采取如下消毒隔离措施：1.物体表面的消毒：对经常接触的地方和物品如门窗、桌椅、水龙头、灯开关、地面等，用1000mg/L 有效氯含氯消毒剂溶液喷洒或擦拭消毒，作用60min 后，再用清水清洗。

如患者将呕吐物排在教室环境中，应先用卫生纸覆盖在呕吐物上，将呕吐物用漂白粉（1升加50克）混合均匀，放置1小时后处理。

2.空气的消毒：加强室内的通风换气，每天定时通风换气1h~2h。

3.织物的消毒：被诺如病毒污染的患者被服与工作服，应立即更换，采用浓度为1000mg/L 有效氯含氯消毒剂溶液浸泡30min 后，清水清洗。

注意含氯消毒剂有漂白作用。

耐热、耐湿的织物也可煮沸消毒30min。

4.清洁用具的消毒：使用过的抹布、拖把采用浓度为2500mg/L 有效氯含氯消毒剂溶液浸泡30min 后，清水清洗。

未经消毒处理的抹布、拖把严禁拿到别处使用。

5.餐（饮）具消毒：首选煮沸消毒30 min，或流通蒸汽消毒30 min。

也可用250mg/L～500 mg/L 有效氯含氯消毒剂溶液浸泡30min 后，再用清水洗净。

6.勤洗手，注意个人清洁卫生：教育师生饭前便后用肥皂流动水彻底洗净双手。

必要时可用0.5%氯己定醇溶液消毒双手。

尤其食物加工者使用洗手间后和加工食物之前更应彻底洗净双手，防止污染食物或饮料。

7.注意个人防护：接触排泄、呕吐物时应戴外科口罩和手套，处理完毕应及时脱卸手套，避免戴有污染的手套触摸环境物表。

8.班级发现疫情及时向卫生室汇报诺如病毒感染性腹泻诺如病毒（Norovirus）是一组杯状病毒属病毒，其原型株诺瓦克病毒（Norwalk-like viruses）于1968年在美国诺瓦克市被分离发现，由于该组病毒极易变异，此后在其他地区又相继发现并命范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，主要发生在秋冬季，多发生在学校等人群聚集的单位，及时采取控制措施可避免疫情扩散。

诺如病毒实验室检测诺如病毒实验室检测诺瓦克病毒（Norwalk Viruses，NV）是人类杯状病毒科(Human Calicivirus，HuCV)中诺如病毒（Norovirus,NV）属的原型代表株。

NV是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。

诺瓦克病毒最早是从1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻的患者粪便中分离的病原。

2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病毒（Norovirus,NV）。

诺如病毒与在日本发现的札幌样病毒（Sapporo-like Virus，SLV），正式名称为札如病毒(Sapovirus,SV)，合称为人类杯状病毒。

诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。

诺如病毒抗体没有显著的保护作用，尤其是没有长期免疫保护作用，极易造成反复感染。

诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。

诺如病毒有许多共同特征：直径约为26～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称；从急性胃肠炎病人的粪便中分离，不能在细胞或组织中培养，也没有合适的动物模型；基因组为单股正链RNA；在氯化铯密度梯度中的浮力密度为1.36～1.41g/cm3；电镜下缺乏显著的形态学特征，负染色电镜照片显示，NV是具有典型的羽状外缘，表面有凹痕的小圆状结构病毒。

诺如病毒根据遗传性分为5个基因组，至少有29个基因群，其中基因组I （GGI）有8个基因群，基因组II（GGII）有17个基因群，基因组III（GGIII）有2个基因群，基因组IV（GGIV）和基因组V （GGV）各有1个基因群。

与人类有关的主要是GGI、GGII和GGIV。

一、标本采集注意事项：粪便标本应在发病首日采集，至多不能超过发病急性期(48～72h)，此时为稀、软便，病毒排出量最多。

食品安全国家标准食品微生物学检验食品中诺如病毒检测1 范围本标准本标准规定了食品中诺如病毒的测定方法。

本标准适用于食品中诺如病毒总数的测定。

2 术语和定义2.1 实时荧光RT-PCR real-time fluorescence在普通RT-PCR的基础上加了一条特殊性的荧光探针。

该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

2.2 C值 cycle thresholdt每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。

3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1无菌平皿，直径90mm；3.2无菌手术剪；3.3无菌镊子；3.4无菌50ml离心管，耐氯仿，可高速离心；3.5无菌85ml离心管，耐氯仿，可高速离心；3.6无菌胶头滴管；3.7无菌移液管，10ml；3.8移液枪，1-1000ul；3.9匀浆机；3.10超净工作台；3.11天平，精密度为0.01g；3.12高速冷冻离心机，10000g；3.13恒温摇床；3.14荧光定量PCR仪。

4 试剂4.1 含0.3mol/lNaCl的甘氨酸缓冲溶液，配制方法见A.1；4.2 PEG8000，配制方法见A.2；4.3 病毒RNA提取试剂盒；4.4 Nuclisens裂解液；4.5逆转录试剂盒；4.6荧光PCR定量试剂盒；4.7 缓冲液1×TAE，配制方法见A.3；4.8溴化乙锭（EB）溶液10ug/uL，配制方法见A.4；4.9琼脂糖凝胶，配制方法见A.5。

5 检验程序6 操作步骤6.1诺如病毒的富集6.1.1在无菌平皿中进行无菌取样，取食品5g，加入25ml含0.3mol/lNaCl的甘氨酸缓冲溶液，匀浆3min，为避免匀浆过程产生的高温破坏病毒，分两次匀浆，中间停顿1min。

诺如病毒检验（食品微生物学检验）食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验1范围本标准规定了食品中诺如病毒(N o r o v i r u s)的实时荧光R T-P C R检测方法三本标准适用于贝类,生食蔬菜,胡萝卜二瓜二坚果等硬质表面食品,草莓二西红柿二葡萄等软质水果等食品中诺如病毒核酸的检测三2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1实时荧光P C R仪三2.2冷冻离心机三2.3无菌刀片或等效均质器三2.4涡旋仪三2.5天平:感量为0.1g三2.6振荡器三2.7水浴锅三2.8离心机三2.9高压灭菌锅三2.10低温冰箱:-80?三2.11微量移液器三2.12p H计或精密p H试纸三2.13网状过滤袋:400m L三2.14无菌棉拭子三2.15无菌贝类剥刀三2.16橡胶垫三2.17无菌剪刀三2.18无菌钳子三2.19无菌培养皿三2.20无R N a s e玻璃容器:见E.1.2三2.21无R N a s e离心管二无R N a s e移液器吸嘴二无R N a s e药匙二无R N a s e P C R薄壁管:见E.1.3三3试剂除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水均为无R N a s e超纯水:见E.2.1三3.1 GⅠ二GⅡ基因型诺如病毒的引物二探针:见A.1三3.2过程控制病毒的引物二探针:见A.1三3.3过程控制病毒:制备见附录C三3.4外加扩增控制R N A:制备见附录D三3.5 T r i s/甘氨酸/牛肉膏(T G B E)缓冲液:见E.2.2三3.65?P E G/N a C l溶液(500g/L聚乙二醇P E G8000,1.5m o l/LN a C l):见E.2.3三3.7磷酸盐缓冲液(P B S):见E.2.4三3.8氯仿/正丁醇的混合液:见E.2.5三3.9蛋白酶K溶液:见E.2.6三3.1075%乙醇:见E.2.7三3.11 T r i z o l试剂:见E.2.8三4检验程序诺如病毒检验程序见图1三图1诺如病毒检验程序5操作步骤5.1病毒提取注:样品处理一般应在4?以下的环境中进行运输三实验室接到样品后应尽快进行检测,如果暂时不能检测应将样品保存在-80?冰箱中,试验前解冻三样品处理和P C R反应应在单独的工作区域或房间进行三每个样品可设置2~3个平行处理三5.1.1软质水果和生食蔬菜5.1.1.1将25g软质水果或生食蔬菜切成约2.5c m?2.5c m?2.5c m的小块(如水果或蔬菜小于该体积,可不切)三5.1.1.2将样品小块移至带有400m L网状过滤袋的样品袋,加入40m LT G B E溶液(软质水果样品,需加入30U A.n i g e r果胶酶,或1140U A.a c u l e a t u s果胶酶),加入10μL过程控制病毒三5.1.1.3室温,60次/m i n,振荡20m i n三酸性软质水果需在振荡过程中,每隔10m i n检测p H,如p H 低于9.0时,使用1m o l/LN a O H调p H至9.5,每调整一次p H,延长振荡时间10m i n三5.1.1.4将振荡液转移至离心管,如体积较大,可使用2根离心管三10000r/m i n,4?,离心30m i n三取上清至干净试管或三角瓶,用1m o l/L H C l调p H至7.0三5.1.1.5加入0.25倍体积5?P E G/N a C l溶液,使终溶液浓度为100g/LP E G,0.3m o l/L N a C l三60s 摇匀,4?,60次/m i n,振荡60m i n三10000r/m i n,4?,离心30m i n,弃上清三10000r/m i n,4?,离心5m i n紧实沉淀,弃上清三5.1.1.6500μLP B S悬浮沉淀三如食品样品为生食蔬菜,可直接将悬浮液转移至干净试管,测定并记录悬浮液毫升数,用于后续R N A提取三如食品样品为软质水果,将悬浮液转移至耐氯仿试管中三加入500μL氯仿/丁醇混合液,涡旋混匀,室温静置5m i n三10000r/m i n,4?,离心15m i n,将液相部分仔细转移至干净试管,测定并记录悬浮液毫升数,用于后续R N A提取三5.1.2硬质表面食品5.1.2.1将无菌棉拭子使用P B S湿润后,用力擦拭食品表面(<100c m2)三记录擦拭面积三将10μL 过程控制病毒添加至该棉拭子三5.1.2.2将棉拭子浸入含490μLP B S试管中,紧贴试管一侧挤压出液体三如此重复浸入和挤压3~4次,确保挤压出最大量的病毒,测定并记录液体毫升数,用于后续R N A提取三硬质食品表面过于粗糙,可能会损坏棉拭子,可使用多个棉拭子三5.1.3贝类5.1.3.1戴上防护手套,使用无菌贝类剥刀打开至少10个贝类三5.1.3.2使用无菌剪刀二手术钳或其他等效器具在胶垫上解剖出贝类软体组织中的消化腺,置于干净培养皿中三收集2.0g三5.1.3.3使用无菌刀片或等效均质器将消化腺匀浆后,转移至离心管三加入10μL过程控制病毒三加入2.0m L蛋白酶K溶液,混匀三5.1.3.4使用恒温摇床或等效装置,37?,320次/m i n,振荡60m i n 三5.1.3.5将试管放入水浴或等效装置,60?,15m i n三室温,3000r/mi n,5m i n离心,将上清液转移至干净试管,测定并记录上清液m L数,用于后续R N A提取三5.2病毒R N A提取和纯化注:病毒R N A可手工提取和纯化,也可使用商品化病毒R N A提取纯化试剂盒三提取完成后,为延长R N A保存时间可选择性加入R N a s e抑制剂三操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套,并经常更换三提取出来的R N A立即进行反应,或保存在4?小于8h三如果长期储存建议-80?保存三5.2.1病毒裂解将病毒提取液加入离心管,加入病毒提取液等体积T r i z o l试剂,混匀,激烈振荡,室温放置5m i n,加入0.2倍体积氯仿,涡旋剧烈混匀30s(不能过于强烈,以免产生乳化层,也可用手颠倒混匀),12000r/m i n,离心5m i n,上层水相移入新离心管中,不能吸出中间层三5.2.2病毒R N A提取离心管中加入等体积异丙醇,颠倒混匀,室温放置5m i n,12000r/m i n,离心5m i n,弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)三5.2.3病毒R N A纯化5.2.3.1每次加入等体积75%乙醇,颠倒洗涤R N A沉淀2次三5.2.3.2于4?,12000r/m i n,离心10m i n,小心弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)三或小心倒去上清液,用微量加样器将其吸干,一份样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀,室温干燥3m i n,不能过于干燥,以免R N A不溶三5.2.3.3加入16μL无R N a s e超纯水,轻轻混匀,溶解管壁上的RN A,2000r/m i n,离心5s,冰上保存备用三5.3质量控制5.3.1空白对照以无R N a s e超纯水作为空白对照(A反应孔)三5.3.2阴性对照以不含有诺如病毒的贝类,提取R N A,作为阴性对照(B反应孔)三5.3.3阳性对照以外加扩增控制R N A,作为阳性对照(J反应孔)三5.3.4过程控制病毒5.3.4.1以食品中过程控制病毒R N A的提取效率表示食品中诺如病毒R N A的提取效率,作为病毒提取过程控制三5.3.4.2将过程控制病毒按5.2步骤提取和纯化R N A三可大量提取,分装为10μL过程控制病毒的R N A量,-80?保存,每次检测时取出使用三5.3.4.3将10μL过程控制病毒的R N A进行数次10倍梯度稀释(D~G反应孔),加入过程控制病毒引物二探针,采用与诺如病毒实时荧光R T-P C R反应相同的反应条件确定未稀释和梯度稀释过程病毒R N A 的C t值三5.3.4.4以未稀释和梯度稀释过程控制病毒R N A的浓度l g值为X轴,以其C t值为Y轴,建立标准曲线;标准曲线r2应?0.98三未稀释过程控制病毒R N A浓度为1,梯度稀释过程控制R N A浓度分别为10-1二10-2二10-3等三5.3.4.5将含过程控制病毒食品样品R N A(C反应孔),加入过程控制病毒引物二探针,采用诺如病毒实时荧光R T-P C R反应相同的反应体系和参数,进行实时荧光R T-P C R反应,确定C t值,代入标准曲线,计算经过病毒提取等步骤后的过程控制病毒R N A浓度三5.3.4.6计算提取效率,提取效率=经病毒提取等步骤后的过程控制病毒R N A浓度?100%,即(C反应孔)C t值对应浓度?100%三5.3.5外加扩增控制5.3.5.1通过外加扩增控制R N A,计算扩增抑制指数,作为扩增控制三5.3.5.2外加扩增控制R N A分别加入含过程控制病毒食品样品R N A(H反应孔)二10-1稀释的含过程控制病毒食品样品R N A(I反应孔)二无R N a s e超纯水(J反应孔),加入GⅠ或GⅡ型引物探针,采用附录C反应体系和参数,进行实时荧光R T-P C R反应,确定C t值三5.3.5.3计算扩增抑制指数,抑制指数=(含过程控制病毒食品样品R N A+外加扩增控制R N A)C t值-(无R N a s e超纯水+外加扩增控制R N A)C t值,即抑制指数=(H 反应孔)C t值-(J反应孔)C t值三如抑制指数?2.00,需比较10倍稀释食品样品的抑制指数,即抑制指数=(I反应孔)C t值-(J反应孔)C t值三5.4实时荧光R T-P C R实时荧光R T-P C R反应体系和反应参数详见附录B三反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整三可采用商业化实时荧光R T-P C R试剂盒三也可增加调整反应孔,实现一次反应完成GⅠ和GⅡ型诺如病毒的独立检测三将18.5μL实时荧光R T-P C R反应体系添加至反应孔后,不同反应孔加入下述不同物质,检测GⅠ或GⅡ基因型诺如病毒三A反应孔:空白对照,加入5μL无R N a s e超纯水+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;B反应孔:阴性对照,加入5μL阴性提取对照R N A+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;C反应孔:病毒提取过程控制1,加入5μL含过程控制病毒食品样品R N A+1.5μL过程控制病毒引物探针;D反应孔:病毒提取过程控制2,加入5μL过程控制病毒R N A+1.5μL过程控制病毒引物探针; E反应孔:病毒提取过程控制3,加入5μL10-1倍稀释过程控制病毒R N A+1.5μL过程控制病毒引物探针;F反应孔:病毒提取过程控制4,加入5μL10-2倍稀释过程控制病毒R N A+1.5μL过程控制病毒引物探针;G反应孔:病毒提取过程控制5,加入5μL10-3倍稀释过程控制病毒R N A+1.5μL过程控制病毒引物探针;H反应孔:扩增控制1,加入5μL含过程控制病毒食品样品R N A+1μL外加扩增控制R N A+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;I反应孔:扩增控制2,加入5μL10-1倍稀释的含过程控制病毒食品样品R N A+1μL外加扩增控制R N A+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;J反应孔:扩增控制3/阳性对照,加入5μL无R N a s e超纯水+1μL 外加扩增控制R N A+1.5μL GⅠ或GⅡ型引物探针;K反应孔:样品1,加入5μL含过程控制病毒食品样品R N A+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针; L反应孔:样品2,加入5μL10-1倍稀释的含过程控制病毒食品样品R N A+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针三6结果与报告6.1检测有效性判定6.1.1需满足以下质量控制要求,检测方有效:空白对照阴性(A反应孔);阴性对照阴性(B反应孔);阳性对照(J反应孔)阳性三6.1.2过程控制(C~G反应孔)需满足:提取效率?1%;如提取效率<1%,需重新检测;但如提取效率<1%,检测结果为阳性,也可酌情判定为阳性三6.1.3扩增控制(H~J反应孔)需满足:抑制指数<2.00;如抑制指数?2.00,需比较10倍稀释食品样品的抑制指数;如10倍稀释食品样品扩增的抑制指数<2.00,则扩增有效,且需采用10倍稀释食品样品R N A 的C t值作为结果;10倍稀释食品样品扩增的抑制指数也?2.00时,扩增可能无效,需要重新检测;但如抑制指数?2.00,检测结果为阳性,也可酌情判定为阳性三6.2结果判定待测样品的C t值大于等于45时,判定为诺如病毒阴性;待测样品的C t值小于等于38时,判定为诺如病毒阳性;待测样品的C t值大于38,小于45时,应重新检测;重新检测结果大于等于45时,判定为诺如病毒阴性;小于等于38时,判定为诺如病毒阳性三6.3报告根据检测结果,报告检出诺如病毒基因或未检出诺如病毒基因三附录A实时荧光R T-P C R引物和探针GⅠ二GⅡ型诺如病毒实时荧光R T-P C R引物和探针见表A.1三表A.1GⅠ二GⅡ型诺如病毒实时荧光R T-P C R引物和探针病毒名称序列扩增产物长度/b p序列位置诺如病毒GⅠQ N I F4(上游引物):5 -C G CT G G A T GC G N T T CC A T-3 ;N V1L C R(下游引物):5 -C C TT A G A C GC C AT C AT C AT T T A C-3 ;N V G G1p(探针):5 -F AM-T G G A C A G G A G A Y C G C R A T C T-T AM R A-386位于诺如病毒(G e n B a n k登录号m87661)的5291~5376诺如病毒GⅡQ N I F2(上游引物):5 -A T G T T CA G RT G GA T G A G RT T CT C W G A-3 ;C O G2R(下游引物):5 -T C G A C G C C A T C T T C A T T C A C A-3 ;Q N I F s(探针):5 -F AM-A G C A C G T G G G A G G G C G A T G G-T AM R A-389位于L o r d s d a l e病毒(G e n B a n k登录号x86557)的5012~5100附录 B实时荧光R T -P C R 的反应体系和参数B .1 实时荧光R T -PC R 反应体系见表B .1三表B .1 实时荧光R T -P C R 反应体系名称储存液浓度终浓度加样量/μL GⅠGⅡ过程控制病毒R T -P C R 缓冲溶液5?1?555M g S O 425mm o l /L 1mm o l /L 111d N T P s 10mm o l /L 0.2mm o l /L0.50.50.5正义引物50μm o l /L 1μm o l /L 0.50.50.5反义引物50μm o l /L 1μm o l /L 0.50.50.5逆转录酶5U /μL 0.1U /μL 0.50.50.5D N A 聚合酶5U /μL 0.1U /μL 0.50.50.5探针5μm o l /L 0.1μm o l /L0.50.50.5R N A 模板――555水(无R N a s e)――111111总体积――252525B .2 实时荧光R T -P C R 反应参数见表B .2三表B .2 实时荧光R T -P C R 反应参数步骤温度和时间循环数R T 55?,1h1预热95?,5m i n 1扩增变性95?,15s退火延伸60?,1m i n 65?,1m i n 45附录C过程控制病毒培养及引物二探针C.1概要本标准使用过程控制病毒进行过程控制,可使用门哥病毒或其他等效,不与诺如病毒交叉反应的病毒三门哥病毒是小核糖核酸病毒科的鼠病毒三门哥病毒株M C0是一种重组病毒,与野生型门哥病毒相比缺乏p o l y[C],是与野生型门哥病毒具有相似生长特性的无毒表型三门哥病毒株M C0是一种转基因生物,如果检测实验室不允许使用转基因生物,可以使用其他的过程控制病毒三也可使用商业化试剂或试剂盒中的过程控制病毒三C.2培养试剂和仪器C.2.1H e L a细胞推荐使用E a g l e最低必需培养液(E a g l e sm i n i m u me s s e n t i a lm e d i u m,M E M)培养,并将2m m o l/L L-谷氨酸和E a r l e sB S S调为1.5g/L碳酸氢钠,0.1mm o l/L非必需氨基酸,1.0mm o l/L丙酮酸钠, 1?链霉素/青霉素液,100m L/L(生长)或20m L/L(维持)胎牛血清三C.2.2仪器为确保细胞培养和病毒生长,需细胞培养所需的C O2浓度可调培养箱,细菌培养耗材(例如培养皿)等三C.3培养过程门哥病毒培养在铺满80%~90%单层H e L a(A T C C C C L-2T M)细胞中,置于50m L/LC O2的气氛中(开放培养箱)或不可调的气氛中(封闭培养箱),直至75%出现细胞病理效应三细胞培养器皿经过一个冻融循环,将培养物3000r/m i n离心10m i n三将细胞培养物离心上清留存用于过程控制三C.4引物二探针过程控制病毒(门哥病毒)实时荧光R T-P C R的引物二探针见表C.1三采用其他等效的过程控制病毒,需对应调整引物探针三表C.1过程控制病毒(门哥病毒)实时荧光R T-P C R的引物二探针病毒名称序列扩增产物长度/b p序列位置门哥病毒M e n g o110(上游引物):5 -G C G G G TC C T G C CG A A A G T-3M e n g o209(下游引物):5 -G A A G T A A C A T A T A G A C A G A C GC A C A C-3M e n g o147(探针):5 -F AM-A T CA C AT T AC T GG C CG A AG C-MG-B N F Q-3100位于门哥病毒缺失毒株M C0(详见附录D)的110~209;相当于门哥病毒非缺失毒株M(G e n B a n k登录号122089)的序列110~270附录D外加扩增控制R N A制备1)D.1概要通过将目标D N A序列连接至合适的质粒载体上,目标序列位于R N A聚合酶启动子序列的下游序列,从而表达出外部扩增控制R N A三GⅠ型外部扩增R N A序列位于诺如病毒(G e n B a n k登录号m87661)的5291~5376三GⅡ型外部扩增R N A序列位于L o r d s d a l e病毒(G e n B a n k登录号x86557)的5012~5100三D.2试剂和设备D.2.1限制性酶:用于连接及相关的缓冲液三D.2.2 D N A纯化试剂三D.2.3体外R N A转录试剂(R N A聚合酶,N T P s,缓冲液等)三D.2.4 R N a s e-f r e eD N a s e三D.2.5 R N A纯化试剂三D.2.6 D N A凝胶电泳试剂和设备三D.2.7培养箱:37?三D.3质粒D N A连接添加100n g~500n g纯化的目标D N A和质粒载体加入含有合适的限制酶和缓冲液的反应体系中,限制酶和缓冲液的使用按照酶厂家推荐,并确保目标序列位于质粒中R N A聚合酶启动子序列的下游三37?培养120m i n三D N A纯化使用D N A纯化试剂纯化三使用凝胶电泳检查连接情况,比较连接前与连接后目标D N A和质粒情况三D.4外加扩增控制R N A的表达添加连接后的质粒至转化体系三该体系按照转化体系提供厂家建议配置三使用R N A纯化试剂纯化R N A后,分装,-80?储存,每次检测前取出备用三1)可使用等效的商业化检测试剂盒中的外加扩增控制R N A储备液,或者请生物公司代为制备三。

核酸标本检测实施方案范文本实施方案旨在规范核酸标本检测工作流程，保障检测结果准确性及工作人员及社会公众的安全。

一、标本采集1.1 核酸标本采集人员需经过专业培训，持有资质证书，并且需严格遵守操作规范。

1.2 核酸标本采集应在符合卫生标准的环境下进行，采集器具需经过严格消毒处理。

1.3 采集过程中应做好个人防护，避免交叉感染。

二、标本运输2.1 采集完成的标本需在规定时间内送达实验室，避免标本变质影响检测结果。

2.2 标本运输车辆及运输工作者需符合相关规定，并做好防护措施。

三、实验室处理3.1 实验室需具备相应的检测设备和资质，操作人员需持有相关资质证书。

3.2 实验室内部应严格区分不同标本，并严禁交叉污染。

3.3 实验室人员应做好个人防护，避免接触标本液体。

四、检测流程4.1 检测操作人员需按照标准操作程序进行，避免操作失误引起结果误差。

4.2 检测结果应由专业人员进行审核确认，确保结果准确性。

五、结果反馈5.1 检测结果需及时反馈给采样单位或个人，避免拖延造成不必要的风险。

六、废弃物处理6.1 废弃的标本管及其他医疗废弃物应按规定进行分类、处理和处置，避免对环境及他人造成危害。

七、其他7.1 核酸标本检测工作需遵循相关卫生法规和标准，确保工作的安全性和准确性。

7.2 如有相关疫情防控文件，需按文件要求执行核酸检测工作。

八、监督检查8.1 定期对核酸标本检测工作进行内部审核和外部监督，及时发现问题并采取措施。

8.2 对违反操作规范的人员及时进行处理，确保工作质量和安全。

以上为核酸标本检测实施方案，在工作中需严格按照实施方案执行，确保核酸检测工作的准确性和安全性。

九、应急预案9.1 针对实验室环境、设备、人员等突发情况，制定相应的应急预案，及时组织人员进行应急处置，避免事故发生及扩大。

十、信息保密10.1 严格遵守个人隐私和信息保密原则，确保检测结果及个人信息安全。

十一、员工健康管理11.1 实验室应建立并严格执行员工健康管理制度，对员工进行定期体检、健康监测，确保员工体检健康。

微生物样品处置方案模板一、背景在实验室和医疗机构中，经常进行微生物的检测和分离工作。

针对不同的微生物类型，也需要采取不同的处置方案，在处理微生物样品时需要注意以下事项：•避免交叉污染•遵守相关法律法规•防止微生物泄漏本文档旨在提供一个微生物样品处置方案模板，帮助工作人员在处理微生物样品时做到规范、科学、安全、高效。

二、微生物样品处置方案针对不同的微生物类型，可以确定不同的处置方案。

以下是一个常见的处置方案模板：1. 常规细菌样品处置方案1.1 样品处理1.液体培养基样品：在处理前需对标本进行标注，标注信息应包括标本名称、采集部位、采集日期等基本信息。

2.固体培养基样品：在处理前需按照样品来源、类型、特性、采集日期等信息编制标本清单。

1.2 微生物处理1.现场检测快速处理：对微生物样品进行涂片或直接荧光染色，检查结果直观明了。

2.传统处理——菌落计数方法–确认生长菌种合适的寿命、温度和环境。

–取适量菌液或菌落用适量生理盐水混合制成细胞悬液。

–调制混合物用于稀释组织和液体样品。

2. 病毒样品处置方案2.1 样品处理1.标本采集前应了解病毒信息及传送方式、采集方法、储存条件等方面知识。

2.样本采集应做好标记标识，标注项目应涵盖样品名称、采集日期、采集人员等信息。

2.2 微生物处理1.试验室卫生管理：每日检查实验室洁净度，养护实验室设备，并做好实验室人员口罩、手套的配给、更换和消毒工作。

2.样本制备：对于敏感病毒样品，应优先选择生命科学级别氧環类气体封装系统处理。

3. 真菌样品处置方案3.1 样品处理1.真菌样品采集应选择在接触气氛污染少的空气处理间内完成，避免接触到有害微生物和其他污染源。

2.对于带有真菌的样品，在处理前应当将其分开贮存，并加外包装，避免样品污染，标注样品名称、时间等信息。

3.2 微生物处理1.样品制备：选用光学显微镜观察菌落的生长，确保识别有相关基础的实验员上岗工作；切勿将真菌种类混在一起制作。

附件2诺如病毒消毒方法一、病人呕吐物、粪便用一次性吸水材料（如纱布、抹布等）沾取5000mg/L～10000mg/L的含氯消毒液完全覆盖污染物，小心清除干净。

清除过程中避免接触污染物，清理的污染物按医疗废物集中处置，或用含有效氯5000mg/L消毒剂溶液浸泡消毒30min后处理。

厕所马桶或容器内的污染物，可小心倒入足量的5000mg/L～10000mg/L 的含氯消毒液，作用30min以上，排入有消毒装置的污水处理系统。

清洁中使用的拖把、抹布等工具，盛放污染物的容器都必须用含有效氯5000mg/L消毒剂溶液浸泡消毒30min后彻底冲洗，才可再次使用。

厕所、卫生间的拖把应专用。

二、地面、墙壁及物体表面用于消毒地面、墙壁及物体表面的消毒液，应含有效氯1000mg/L。

有肉眼可见污染物时应先清除污染物再消毒。

无肉眼可见污染物时，家具和生活设施用消毒液进行浸泡、喷洒或擦拭消毒，作用30分钟后用清水擦拭干净。

墙壁可直接用消毒剂按100mL/ m2～300mL/ m2用量擦拭或喷洒消毒。

地面消毒先由外向内喷洒一次，喷药量为100mL/ m2～300mL/ m2，待室内消毒完毕后，再由内向外重复喷洒一次。

消毒作用时间应不少于15 分钟。

三、衣物、被褥等织物收拾被污染的衣物、被褥等织物时应避免产生气溶胶。

先将固体污秽物移除后浸在有效氯为500mg/L的含氯消毒剂溶液内30分钟，然后清洗。

也可用流通蒸汽或煮沸消毒30分钟。

若不能即时消毒，应把它们放置在密封的袋内，并尽快处理。

四、食品用具餐（饮）具和食品加工工具清除食物残渣后，煮沸消毒30分钟，也可用有效氯为500mg/L含氯消毒液浸泡或擦拭，作用30分钟后，再用清水洗净。

五、皮肤、粘膜皮肤被污染物污染时，应立即清除污染物，然后用一次性吸水材料沾取0.5%碘伏消毒液擦拭消毒3 分钟以上，使用清水清洗干净；粘膜应用大量生理盐水冲洗或0.05%碘伏冲洗消毒。

六、医疗废物患者产生的生活垃圾、一次性诊疗用品采用双层医疗废物袋，按医疗废物集中收集处置。

病毒标本收集与处理用于分离或检测病毒及其核酸的标本应尽可能在发病的初期、急性期采集，越早越能提高病毒的阳性检出率。

疾病的后期，由于机体产生免疫力，病毒数量减少或消失，不易检出。

同时病毒感染的晚期常并发细菌性感染，增加了判断的困难。

（一）接种标本标本接种前，必须进行适当的处理，其目的是除去标本中的杂质和杂菌，以及将病毒释放出来，以利于检测或保存。

常用的方法是高速离心法，如人乳头瘤病毒的临床标本的处理方法为：用刮板或生理盐水侵润的棉棒从阴道和宫颈外口去分泌物和细胞，将标本放入5ml还有0.05%硫柳汞的PBS中，细胞悬液提取DNA用于检测病毒。

还可加抗生素处理，检测单纯疱疹病毒时标本须注入病毒运送液中用于病毒分离或置-70℃冰箱保存。

如用血清或血浆标本应注意避免溶血，如为血浆标本要合理选择抗凝剂，标本为全血时，须及时分离出血浆。

组织标本须先加入无菌生理盐水或缓冲液，在研磨器中充分研磨，若为结缔组织应加入适量铝氧粉，以便将病毒释放出来，制成悬液，经离心后接种。

（二）取材部位取材部位也是决定分离成功与的关键。

呼吸道感染最重要的取材部位是咽部，用棉花拭子在鼻咽部檫拭或取鼻咽分泌物。

肠道感染通常取粪便标本。

全身形感染一般取全血，疾病早期也是病毒血症期，白细胞内通常可查出病毒。

其他标本也是病毒分离的理想材料。

根据感染的特点，选择相应部位采集标本，可采集血液、脑脊液、粪便、含漱液、尿液和咽、喉拭子等。

由于病毒在室温中很易被灭活，应在采集和运送中注意冷藏。

处理标本时应考虑病毒的特性，如有包膜病毒冻融易灭活。

一些病毒如麻疹病毒吸附在白细胞上，因此，血液应加抗凝剂。

（三）一般要求采集标本要求做到下面4个字：1.早特别是对病毒分离、抗原或核酸检测。

2.近用于病毒分离、抗原或核酸检测的标本应尽量取自病变部位或接近病变部位（如脑炎取闹脊液，腹泻取粪便，呼吸道感染取鼻咽分泌物或支气管灌洗液）。

3.多标本的量不能太少，如有可能一次取多种标本，在病程急性期和恢复期都取标本。