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ICS67.050B 50 DB1301 石家庄市地方标准DB 1301/T 283—2018水产品中呋喃西林代谢物的快速检测荧光免疫层析法Determination of nitrofurazone metabolites in aquatic products—Fluorescence immunochromatography2018-05-18发布2018-07-20实施前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准由石家庄市农业畜牧局提出。
本标准起草单位：石家庄市畜产品质量监测中心。
本标准主要起草人: 肖妙、赵义良、李云、崔荣飞、张蕾、王志恒、高景报、房灿。
水产品中呋喃西林代谢物的快速检测荧光免疫层析法1 范围本标准规定了水产品中呋喃西林代谢物（Nitrofurazone metabolite，SEM）的荧光免疫层析快速检测方法。
本标准适用于水产品中呋喃西林代谢物的快速筛选检测，本方法的检出限为0.5μg/kg。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 原理本法应用竞争抑制免疫层析原理。
样品中残留的呋喃西林代谢物在酸性条件下衍生，碱性条件下经乙酸乙酯萃取、正己烷去脂净化后，样品溶液中的呋喃西林代谢物的衍生物与铕乳胶标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和硝酸纤维素膜检测线上呋喃西林代谢物-BSA偶联物的结合。
使检测线荧光强度低于控制线荧光强度或检测线无荧光。
4 试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
4.1 浓盐酸(HCl)。
4.2 氢氧化钠（NaOH）。
4.3 磷酸氢二钾（K2HPO4•3H2O）。
4.4 磷酸氢二钠（Na2HPO4）。
4.5 磷酸二氢钾（KH2PO4）。
呋喃妥因快速检测试纸条使用说明书本产品用于快速检测水产（鱼、虾）组织中的呋喃妥因代谢物残留，整个检测过程需要2小时左右，适用于各类企业及检测机构。
本产品检测限为 1.0 μg/kg。
1、检测原理呋喃妥因代谢物快速检测卡应用了竞争抑制免疫层析的原理，样本中的呋喃妥因代谢物在流动的过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和NC膜检测线上呋喃妥因代谢物－BSA偶联物的结合。
如果样本中呋喃妥因代谢物含量大于1.0 μg/kg，检测线T比质控线C浅或者T线不显色，结果为阳性。
反之，检测线T显色与质控线C线相当或者比C线深，结果为阴性。
2、产品组成3、样品收集及处理鱼、虾等水产收集于干净的容器或自封袋中；若不能及时送检，样本应该去除脂肪，用剪刀剪碎或者用绞肉机搅碎后，分装保存于-20℃下，忌反复冻融。
样本处理⑴取一定的组织（鱼、虾）去除脂肪后，用剪刀剪碎或者用绞肉机搅碎；⑵取2 g已处理待测样品于50 mL离心管中，依次加入4 mL去离子水，0.5 mL 1M盐酸，0.2 mL衍生化试剂，震荡混匀3分钟；⑶60℃水浴条件下孵育1小时；⑷取出后，依次加入5 mL提取剂，0.4 mL 1M氢氧化钠，1瓶萃取剂，震荡混匀1分钟；⑸4000转离心5分钟，取上层液3 mL至10 mL离心管中，于60 ℃下，利用氮气或空气将溶液吹干；⑹加入1 mL正己烷，震荡混匀1分钟，再移液器准确加入500 µL样品复溶液震荡混匀1分钟；⑺4000转离心1分钟（如果分层不明显可延长离心时间至5分钟）或静置至明显分层，下层液待测。
4、操作步骤以及结果判读⑴测试前将未开封的检测卡及待检样品溶液恢复至室温；⑵从原包装铝箔袋中取出检测卡和酶标孔，在半小时内使用；⑶用移液器吸取待检样品溶液100 μL于酶标孔，反复吹打至孔内红色物质完全溶解，等待反应5分钟；⑷将检测卡平放，吸取孔内所有溶液滴加到加样孔中，加样后开始计时；⑸反应5-8分钟根据示意图判断结果，其它时间判读无效；阴性结果: T线比C线深，或一样深，表示样品呋喃妥因代谢物浓度低于其灵敏度；阳性结果: T线比C线淡，表示样品呋喃妥因代谢物浓度高于其灵敏度；无效反应: 如果测试结果C线未出现，表示此试剂已失效。
关于水产快速检测卡的使用说明（组织）--以呋喃西林SEM代谢物为例本产品为定性检测，应用于鱼、虾、禽肉等里面的呋喃西林代谢物残留检测。
本产品整个检测过程只需约60min，适于现场监控和各类检测机构，检测限为1ppb。
【检测原理】呋喃西林代谢物快速检测卡应用了竞争抑制免疫层析的原理，样品中的呋喃西林代谢物在流动的过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和NC膜检测线（T）上呋喃西林代谢物－蛋白偶联物的结合。
如果样品中呋喃西林代谢物含量大于1ppb，检测线（T）不显颜色或者检测线（T）比质控线（C）浅两个色差以上（含两个），结果为阳性；反之，检测线（T）显红色，结果为阴性。
【产品组成】另需自备设备：搅拌器振荡器电子天平离心机空气吹干仪移液器【样品处理】1.取一定量组织样本，用搅拌器混匀，称取2±0.05g均质物至15ml离心管中。
2.然后依次加入4ml SEM 提取液1、0.5ml SEM提取液2和0.5ml SEM提取液3，用手用力剧烈振荡混匀，在60℃空气吹干仪加热孔中孵育30min。
3.孵育完成后依次加入1ml SEM提取液4、0.4ml SEM提取液5和4ml SEM提取液6，用力振荡混匀。
4.室温下（20-25℃）4000r/min离心5min，然后取2ml上层有机相至15ml离心管中，在65℃下用空气吹干仪吹干（10分钟内可吹干）；5.向吹干的离心管中加入1ml正己烷溶解干燥物，再加入0.3ml SEM复溶液，用手用力剧烈振荡混匀，室温下（20-25℃）4000r/min离心5min，吸取全部的下层澄清溶液到1.5ml离心管中，待检。
【使用步骤】1、在进行测试前请完整阅读使用说明书，使用前将检测卡和待测样品溶液恢复至室温（20-30℃）。
2、从包装袋中取出检测卡，平放；3、吸取待检样品溶液70ul滴到加样孔中（或滴管加3滴），结果在3-5分钟判读，其它时间判读无效。
液相色谱－串联质谱法测定水产品中硝基呋喃类代谢物残留量广东省珠海市斗门区动物卫生监督所 孟轩 梁可昌【摘 要】本文介绍液相色谱-串联质谱法测定水产品中硝基呋喃类药物（呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林）代谢物残留方法。
试样中加入2-硝基苯甲醛溶液，在酸性条件下衍生，乙酸乙酯提取，涡旋离心提取，以乙酸胺和甲醇溶液进行梯度洗脱。
在浓度0.5～20.0纳克/毫升范围内，4种硝基呋喃类代谢物呈良好线性关系，相关系数均不小于0.995，检出限为0.5微克/千克。
在0.5微克/千克,1.0微克/千克,5.0 微克/千克添加水平下，目标分析物的加标回收率为82.0%～103%，相对标准偏差为0.996%～4.46%。
该方法具有操作简单、快捷、灵敏度高等特点，可用于水产品中硝基呋喃类等药物残留的批量检测。
【关键词】水产品；液相色谱-串联质谱法；硝基呋喃类硝基呋喃类药物是通过影响细菌体内的氧化还原酶体系，干扰细菌正常代谢的一类广谱抗生素，曾普遍应用于水产、畜牧业养殖等行业中疾病的预防和治疗。
后续学者陆续研究发现，该类药物对对人体具有致畸胎作用，可能诱发癌症等重大疾病。
为此，2019年12月农业农村部发布的第250号公告中将其归类为食品动物中禁止使用的药物。
硝基呋喃类常用的有４种：呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林。
硝基呋喃类药物进入鱼体后的代谢产物分别为：3-氨基-2-恶唑烷基酮（AOZ）、5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮（AMOZ）、1-氨基-2-内酰脲（AHD）、氨基脲（SEM），由于这些代谢产物与蛋白质结合而相当稳定，所以目前主要通过检测代谢物的残留量，反映硝基呋喃类药物的残留状况。
目前检测兽药残留常见的方法主要有：高效液相色谱－串联质谱法、液相色谱法、常规理化检测法、酶联免疫法、毛细管电泳法等。
本研究基于《国家标准GB31656.13-2021食品安全国家标准水产品中硝基呋喃类代谢物多残留的测定液相色谱-串联质谱法》，结合实验室设备及当地检测需求，建立了准确、高效、快速的硝基呋喃代谢残留量检测方法。
呋喃西林代谢物（SEM）快速检测试一、原理本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测水产和鸡肉等组织样本中的SEM，在微孔条上预包被上偶联抗原，利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的原理来进行的，样本中的SEM和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗呋喃西林代谢物的衍生物抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样品中的SEM含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出呋喃西林代谢物含量。
二、试剂盒技术指标：试剂盒灵敏度： 0.1ppb样本检测下限：组织、蜂蜜—————— 0.2ppb回收率：鱼/虾水产组织—————85%±10%蜂蜜/鸡肉/肝脏样本————75%±15%交叉反应率：呋喃西林代谢物————— 100%呋喃它酮代谢物—————＜0.1%呋喃妥因代谢物—————＜0.1%呋喃唑酮代谢物—————＜0.1%三、试剂盒组成1．微量测试孔：每条8孔，一板12条2．标准液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb 3．酶标记物12ml………………红色帽4．抗体浓缩液1ml…………….. 蓝色帽5．底物A液7 ml………………白色帽6．底物B液7 ml ……………. 黑色帽7．终止液7 ml ………………黄色帽8．20X浓缩洗涤液40 ml……… 白色帽9．2X浓缩复溶液50 ml……… 透明帽10．10ml衍生化试剂………….. 白色帽（不能与其它衍生化试剂混用）11. 样本提取液500ml………… 黑色帽（不能与其它试剂混用）四、所用仪器、试剂具备的仪器：微孔酶标仪、打印机、均质器、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道250µl试剂：氢氧化钠、正己烷、浓HCl、磷酸氢二钾、邻硝基苯甲醛、亚硝基铁氰化钾（K2Fe（CN）5•NO•3H2O）ZnSO4•7H2O五、样本前处理步骤样本处理前须知处理任何样本时，都必须注意：（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
附件5水产品中硝基呋喃类代谢物的快速检测胶体金免疫层析法1范围本方法规定了水产品中硝基呋喃类代谢物快速检测方法。
本方法适用鱼肉、虾肉、蟹肉等水产品中呋喃唑酮代谢物（AOZ）、呋喃它酮代谢物（AMOZ）、呋喃西林代谢物（SEM）、呋喃妥因代谢物（AHD）的快速测定。
2原理待测样中硝基呋喃类代谢物经衍生处理后，其衍生物与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和硝酸纤维素膜检测线上硝基呋喃类代谢物-BSA偶联物的免疫反应，使检测线颜色变浅，通过检测线与对照线颜色深浅比较，对样品中硝基呋喃类代谢物的含量进行定性判定。
3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1试剂3.1.1盐酸。
3.1.2三水合磷酸氢二钾。
3.1.3氢氧化钠。
3.1.4甲醇。
3.1.5乙醇。
3.1.6乙腈。
3.1.7邻硝基苯甲醛。
3.1.8三羟甲基氨基甲烷。
3.1.9乙酸乙酯。
3.1.10正己烷。
3.1.11固相萃取柱（强阴离子交换型）：规格1mL，填装量为60mg。
3.1.12邻硝基苯甲醛溶液（10 mmol/L）:准确称取0.150g邻硝基苯甲醛，用甲醇（3.1.4）溶解并定容至100mL。
3.1.13磷酸氢二钾溶液（0.1mol/L）：准确称取22.822g三水合磷酸氢二钾（3.1.2）,用水溶解并定容至1000mL。
3.1.14氢氧化钠溶液（1mol/L）：准确称40g氢氧化钠（3.1.3）,用水溶解并稀释至1000mL。
3.1.15盐酸溶液（1 mol/L）：取10mL盐酸（3.1.1）加入到110mL水中。
3.1.16三羟甲基氨基甲烷溶液（Tris，10mmol/L）：准确称取1.211g三羟甲基氨基甲烷（3.1.8），溶于80mL水中，加入盐酸（约42mL）调pH至8.0后用水定容至1L。
3.2参考物质3.2.1硝基呋喃类代谢物参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度＞99%。
蜂蜜中呋喃西林代谢物的标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：蜂蜜一直以来被人们誉为天然的营养佳品，含有丰富的营养物质和抗氧化剂，对人体健康有着很多好处。
最近有研究表明蜂蜜中可能会含有一些潜在的有害物质，如呋喃西林代谢物。
呋喃西林是一类抗生素，通常用于治疗细菌感染，但在蜂蜜中发现呋喃西林代谢物，可能会对人体健康造成潜在危害。
制定一份关于蜂蜜中呋喃西林代谢物的标准显得尤为必要。
要明确呋喃西林代谢物是一种什么物质。
呋喃西林是一类广谱抗生素，通常用于治疗细菌感染。
当动物或植物体内代谢呋喃西林时，会产生一些代谢产物，这些产物可能对人体健康产生潜在危害。
在蜂蜜中检测呋喃西林代谢物的含量，对于保障消费者的健康至关重要。
制定蜂蜜中呋喃西林代谢物的标准应当结合蜂蜜的生产和存储环境以及加工工艺等因素进行考量。
蜂蜜是一种天然食品，其含有的水分、葡萄糖、蔗糖等成分容易受到外界条件的影响。
在蜂蜜生产过程中，如果环境卫生条件不佳，可能会导致细菌感染，从而产生呋喃西林代谢物。
对于生产蜂蜜的农户和加工企业来说，加强生产过程的卫生管理，提高生产环境的卫生水平，可以有效降低蜂蜜中呋喃西林代谢物的含量。
蜂蜜在加工、储存和运输过程中也容易污染，这些都可能导致蜂蜜中呋喃西林代谢物的产生。
对蜂蜜的加工、储存和运输环节进行严格管理，确保蜂蜜的质量和安全性也是非常关键的。
在标准的制定过程中，需要考虑到不同蜂蜜种类和产地的特点。
不同种类的蜂蜜可能受到不同的环境和生产条件的影响，从而呋喃西林代谢物的含量也会有所不同。
在制定标准时应当根据不同种类和产地的蜂蜜进行分类管理，针对不同情况进行具体规定。
制定蜂蜜中呋喃西林代谢物的标准是十分必要和紧迫的，这既有利于生产企业改进生产工艺和管理水平，保障蜂蜜质量和安全性，也有利于消费者的健康和安全。
在未来的工作中，我们应当进一步加强研究和监测，完善蜂蜜中呋喃西林代谢物的相关标准和管理措施，确保蜂蜜产品的质量和安全性，为人民群众提供更加健康的食品选择。
附件5水产品中硝基呋喃类代谢物的快速检测胶体金免疫层析法1范围本方法规定了水产品中硝基呋喃类代谢物快速检测方法。
本方法适用鱼肉、虾肉、蟹肉等水产品中呋喃唑酮代谢物（AOZ）、呋喃它酮代谢物（AMOZ）、呋喃西林代谢物（SEM）、呋喃妥因代谢物（AHD）的快速测定。
2原理待测样中硝基呋喃类代谢物经衍生处理后，其衍生物与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和硝酸纤维素膜检测线上硝基呋喃类代谢物-BSA偶联物的免疫反应，使检测线颜色变浅，通过检测线与对照线颜色深浅比较，对样品中硝基呋喃类代谢物的含量进行定性判定。
3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1 试剂3.1.1盐酸。
3.1.2三水合磷酸氢二钾。
3.1.3氢氧化钠。
3.1.4甲醇。
3.1.5乙醇。
3.1.6乙腈。
3.1.7邻硝基苯甲醛。
3.1.8三羟甲基氨基甲烷。
3.1.9乙酸乙酯。
3.1.10正己烷。
3.1.11固相萃取柱（强阴离子交换型）：规格1mL，填装量为60mg。
3.1.12邻硝基苯甲醛溶液（10 mmol/L）:准确称取0.150g邻硝基苯甲醛，用甲醇（3.1.4）溶解并定容至100mL。
3.1.13磷酸氢二钾溶液（0.1mol/L）：准确称取22.822g三水合磷酸氢二钾（3.1.2），用水溶解并定容至1000mL。
3.1.14氢氧化钠溶液（1mol/L）：准确称40g氢氧化钠（3.1.3），用水溶解并稀释至1000mL。
3.1.15盐酸溶液（1 mol/L）：取10mL盐酸（3.1.1）加入到110mL水中。
3.1.16三羟甲基氨基甲烷溶液（Tris，10mmol/L）：准确称取1.211g三羟甲基氨基甲烷（3.1.8），溶于80mL水中，加入盐酸（约42mL）调pH至8.0后用水定容至1L。
3.2 参考物质3.2.1硝基呋喃类代谢物参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥99%。
呋喃西林代谢物（SEM）快速检测试
一、原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测水产和鸡肉等组织样本中的SEM，在微孔条上预包被上偶联抗原，利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的原理来进行的，样本中的SEM和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗呋喃西林代谢物的衍生物抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样品中的SEM含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出呋喃西林代谢物含量。
二、试剂盒技术指标：
试剂盒灵敏度：0.1ppb
样本检测下限：
组织、蜂蜜—————— 0.2ppb
回收率：
鱼/虾水产组织————— 85%±10%
蜂蜜/鸡肉/肝脏样本————75%±15%
交叉反应率：
呋喃西林代谢物————— 100%
呋喃它酮代谢物—————＜0.1%
呋喃妥因代谢物—————＜0.1%
呋喃唑酮代谢物—————＜0.1%
三、试剂盒组成
1．微量测试孔：每条8孔，一板12条
2．标准液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb 3．酶标记物12ml………………红色帽
4．抗体浓缩液1ml…………….. 蓝色帽
5．底物A液7 ml………………白色帽
6．底物B液7 ml ……………. 黑色帽
7．终止液7 ml ………………黄色帽
8．20X浓缩洗涤液40 ml……… 白色帽
9．2X浓缩复溶液50 ml……… 透明帽
10．10ml衍生化试剂………….. 白色帽
（不能与其它衍生化试剂混用）
11. 样本提取液500ml………… 黑色帽
（不能与其它试剂混用）
四、所用仪器、试剂
具备的仪器：微孔酶标仪、打印机、均质器、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）
微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道250µl
试剂：氢氧化钠、正己烷、浓HCl、磷酸氢二钾、邻硝基苯甲醛、亚硝基铁氰化钾（K2Fe（CN）5•NO•3H2O）ZnSO4•7H2O
五、样本前处理步骤
样本处理前须知
处理任何样本时，都必须注意：
（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。
样本前处理需配制：
1．用去离子水将2×浓缩复溶液按1：1 稀释，用于提取后的样本复溶
2．C液：（供奶样用）称12.5g亚硝基铁氰化钾用去离子水定溶至100ml。
D液：（供奶样用）称29.8g 硫酸锌用去离子水溶解定溶至100ml。
3．0.1MK2HPO4 称22.8g K2HPO4•3H2O
加去离子水溶解定溶至1L
4．1M HCl取8.6ml浓HCl加水定溶至100ml。
5．1M NaOH称取4g NaOH加水定溶至100ml。
样本的处理
(a) 肉样或鱼虾
用均质器均质样本,接（d）的描述方法
(b) 奶样
1. 取出5ml的奶样本到玻璃离心管中,分别加入C液和D液各250µl。
2. 用振荡器充分混合样本,用恒温离心机4000r/min以上离心10min(4-12℃).若没有恒温离心机,则先将样本降温至大约8℃,然后离心。
3. 接(d)的描述方法
(c) 蜂蜜
1. 取1±0.05g样本到离心管中。
2. 加入4ml的去离子水溶解,再加入0.5ml 1M HCl和100µl衍生化试剂,充分振荡。
3. 接(d)第2步描述方法
(d)接上面的方法
1.取1±0.05g的均质样本(肉样/鱼虾)、牛
奶的离心上清液1.1ml（相当1ml奶样），
分别加入4ml的去离子水，0.5ml1M HCl
和100µl衍生化试剂，充分振荡。
2.置于37℃过夜孵育（大约16h）。
3.分别加入5ml 0.1M K2HPO4，0.4 ml 1M
NaOH和5ml的样本提取液，充分振荡30s；
4.在室温下（20-25℃）4000r/min以上离心
10min。
5.取出2.5ml的样本提取液到另一洁净容器中
于50℃氮气/空气吹干。
6.用1ml正己烷溶解干燥物，用1ml已稀释
好的复溶液充分混合；在室温下（20-25℃）
4000r/min以上离心10min。
7.取50µl下层相用于分析。
样本稀释倍数：2
六、酶标免疫分析程序
1．从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2．取出需要数量的微孔及框架，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3．配液：将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用蒸馏水或去离子水稀释至800ml 备用（或按需要量稀释）。
4．编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5. 将浓缩抗体用已稀释好的复溶液11倍稀释（1份抗体加入10份稀释液）6．加标准品/样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。
37℃环境中反应30min。
7．取出将孔内液体甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次间隔10秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
8．每孔加入酶标记物100µl，盖板膜盖板后置37℃环境中反应30min。
将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗，4-5遍（同上），用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
9．显色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，轻轻振荡混匀，37℃环境中避光显色15min。
10．测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。
七、结果判定
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。
注意样本吸光值与SEM的含量成负相关。
1、定性判定：
用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含SEM浓度范围
（ng/ml）。
假设样品1的吸光度值为0.268，样品2的吸光度值为1.230，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.671；0.1ppb为1.425；0.3ppb为1.103；0.9ppb 为0.567； 2.7ppb为0.205；8.1ppb为0.104。
则样品1的浓度范围是
0.9ppb-2.7ppb；样品2的浓度范围是0.1ppb-0.3ppb。
（再乘以相应的稀释倍数）
2、定量判定：
所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
百分吸光度值（%）＝ B ×100%
B0
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值
以标准品百分吸光率为纵坐标，以SEM标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。
将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中SEM实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。
八、注意事项
1．用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。
2．用之后立即将所有试剂放回2-8℃冰箱。
3．在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是ELISA测定程序中的要点。
4.所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。
5．室温低于37℃或试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD 值偏低。
6．在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。
所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
7．混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。
8．反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
9．不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释
或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。
不要交换使用不同批号的盒中试剂。
10.不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
11．显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。
0标准的吸光度值小于0.5时，表示试剂可能变质。
九、储藏条件和保质期
储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，不要冷冻。
保质期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。
