原核表达 操作

外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程如下：
1. 设计引物：根据外源基因的序列，设计引物，其中至少包括一个启动子和一个终止子。

2. 基因克隆：使用PCR或其他克隆技术，将外源基因与载体DNA连接起来，形成重组质粒。

3. 转化：将重组质粒转化到适当的宿主细胞中，如大肠杆菌。

4. 筛选：通过选择性培养基或其他筛选方法，筛选出带有重组质粒的转化菌落。

5. 培养：将筛选出的转化菌落进行扩增培养，在适当的培养条件下培养细菌。

6. 表达：在培养过程中，外源基因会被宿主细胞转录和翻译，产生目标蛋白质。

7. 提取：收集细菌培养物，利用细胞破裂或其他细胞提取方法，提取目标蛋白质。

8. 纯化：通过各种纯化技术，如柱层析、电泳等，纯化目标蛋白质。

9. 鉴定：利用各种方法，如SDS-PAGE、Western blot等，对
目标蛋白质进行鉴定和定量分析。

10. 应用：利用纯化的目标蛋白质进行后续的研究或应用，如
功能鉴定、结构分析、抗原制备等。

这是一个基本的流程，根据不同的实验目的和具体情况，可能还会涉及到一些其他的步骤和操作。

原核诱导表达的标准操作程序（SOP）一．目的：使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程，并能实际动手进行原核诱导表达一系列实验。

二．适用范围：本SOP适用于对新基因克隆的表达，并针对新基因产生的可溶性蛋白。

三．实验原理：E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。

I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。

在启动序列P上游还有一个代谢物基因激活蛋白（CAP）结合位点。

由P序列、O序列和CAP 结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。

在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。

此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。

当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导。

在这个操纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。

乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。

后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。

异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。

四、试剂准备:（一）实验器材的灭菌：枪头的灭菌：1mL，200µL，20µL的枪头放入枪头盒，用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。

80℃烘箱中烘干，常温放置。

螺口管及离心管的灭菌：将螺口管和离心管分别放入铝制饭盒中（盖子要拧松，离心管的管盖打开），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。

80℃烘箱中烘干，常温放置。

50mL离心管的灭菌：将50mL离心管用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。

80℃烘箱中烘干，常温放置。

（二）LB培养基的配制液体LB培养基（1L）：蛋白胨10g氯化钠10g酵母提取物5g 调PH值到7.5，高压灭菌，4℃保存。

原核蛋白表达是一种常用的蛋白质生产方法，可以通过大肠杆菌等原核细菌表达目标蛋白。

以下是一个典型的原核蛋白表达流程：1. 选择表达系统和载体：选择适合的原核表达系统和载体。

常用的原核表达系统包括大肠杆菌系统（如E.coli），常用的载体包括pET、pGEX等。

2. 构建重组质粒：将目标基因克隆到选定的表达载体上，通常采用限制性内切酶切割和连接方法，确保目标基因正确插入载体。

3. 转化宿主菌：将构建好的重组质粒转化入宿主菌中，一般选择适当的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)等。

4. 培养菌液：将含有重组质粒的宿主菌接种到适当的培养基中，进行菌液的培养。

培养条件可根据所选的菌株和载体进行优化，包括温度、培养时间、培养基成分等。

5. 诱导表达：在适当的生长阶段，向培养基中加入适量的诱导剂，常用的诱导剂包括异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。

6. 细胞破碎：经过一定时间的表达后，收集培养菌液并将细菌进行破碎，释放目标蛋白。

破碎方法可以选择超声波破碎、高压破碎等。

同时添加适量的蛋白酶抑制剂，避免蛋白质的降解。

7. 蛋白纯化：通过一系列的蛋白纯化步骤，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，分离纯化目标蛋白。

此步骤可以根据目标蛋白的特性和需求进行优化。

8. 鉴定和确认：对纯化得到的蛋白进行鉴定和确认，如SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot等。

确保表达的目标蛋白符合预期。

9. 储存和应用：将纯化好的目标蛋白进行适当的保存和储存，确保其稳定性和活性。

根据需要，可以进行后续的功能研究、结构分析、制备抗体等应用。

需要注意的是，原核蛋白表达流程可以根据实验目的和具体要求进行调整和优化。

不同的表达系统和载体可能需要适应性调整。

此外，对特定蛋白的表达可能需要进一步优化培养条件和蛋白纯化步骤。

大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验一般分为以下几个步骤：
1. 构建表达载体：将待表达的基因克隆到适当的表达载体上,如常用的pET、pGEX等载体中。

2. 转化大肠杆菌：将表达载体转化到大肠杆菌细胞中。

可以通过化学方法、电转化、冷冻复苏、热激转化等方法进行。

3. 诱导表达：在大肠杆菌细胞进行生长至适当时期后,添加适宜浓度的诱导剂,如IPTG等,诱导待表达基因蛋白的合成。

4. 细胞收获和破碎：诱导一定时间后,收获大肠杆菌细胞并进行破碎,以获得待表达蛋白。

5. 蛋白提取：对细胞破碎物进行离心、超滤等步骤,去除残余细胞构成和杂质,得到含有待表达蛋白的上清液。

6. 纯化和分析：将上清液进行分离、纯化、鉴定,以确定表达蛋白相应的分子量、酶活性等。

在以上步骤中,实验者需要进行质控和评估,确认实验步骤是否正确和表达蛋白是否达到预期,以确保实验结果的可靠性和准确性。

原核表达步骤原核表达是指在原核生物体内将基因转录成RNA，再将RNA翻译成蛋白质的过程。

本文将详细介绍原核表达的步骤。

1. 转录DNA的双链结构被酶RNA聚合酶解开，从而形成mRNA链。

RNA聚合酶沿着DNA模板链移动，将mRNA链合成在一起。

在这个过程中，RNA聚合酶根据DNA模板链上的碱基序列，选择正确的核苷酸，将其加入到正在合成的mRNA链上。

2. 剪接在细胞核内，mRNA链是在原核生物上转录的。

这些mRNA链可能包含顺式调节区域（UTR）和内含子区域。

在剪接过程中，内含子被剪除，UTR被保留下来。

这个过程由小核RNA（snRNA）和蛋白质共同完成。

3. 翻译翻译是将mRNA链转化为氨基酸序列的过程。

翻译是在核糖体中完成的。

核糖体是由rRNA和蛋白质组成的复合体。

核糖体通过识别mRNA上的起始密码子来开始翻译过程。

起始密码子是AUG。

核糖体将氨基酸连接在一起，直到遇到终止密码子。

终止密码子分别是UAA，UAG和UGA。

翻译完成后，成品蛋白被释放出来。

4. 后翻译修饰在翻译完成后，蛋白质可能需要进行后翻译修饰。

这些修饰可以包括磷酸化，甲基化，硫化，酰化和糖基化等。

这些修饰可以改变蛋白质的结构和功能，从而影响其生物学活性。

5. 折叠蛋白质被合成后，需要进一步折叠成其最终形态。

这个过程由分子伴侣和蛋白酶等分子机器完成。

分子伴侣可以协助蛋白质正确地折叠。

蛋白酶可以降解不正确折叠的蛋白质，防止它们对细胞造成损害。

6. 定位在折叠完成后，蛋白质需要被定位到其最终的位置。

这个过程由信号肽和其他分子机器完成。

信号肽是一段氨基酸序列，可以将蛋白质定位到细胞膜，内质网，线粒体等亚细胞结构中。

原核表达是一个复杂的过程，包括转录，剪接，翻译，后翻译修饰，折叠和定位。

这些步骤需要各种不同的分子机器和分子信号来协同完成。

理解原核表达的步骤可以帮助我们更好地理解生物学过程，从而为生命科学的研究和应用提供基础。

实验方法与步骤1 表达质粒的构建及测序分析1.1 cofilin-1的片段的准备1.1.1 引物设计根据在GenBank上查找人源cofilin-1的基因序列，用Primer Premier 5.0软件进行上下游引物的设计，并送往上海生物工程技术服务有限公司合成的PCR 引物。

引物如下：引物名称序列F-cofilin-1 5′-AAGTCGACATATGGCCTCCGGTGTG-3′R-cofilin-1 5′-TCTCTCGAGGGCTCACAAAGGCTTG-3′将以上引物用灭菌的三蒸水稀释成10μmol/L，分装于Eppendorf管中，-20℃冰箱中保存备用。

1.1.2 cofilin-1片段PCR1 反应体系：2.5μlKOD polymerase(3’-5’核酸外切酶活性)KOD polymerase buffer 5μlMgSO4 2.5μlDMSO（“万能溶剂”） 2.5μldNTPMixture 5μlPrimerF（底物） 1.5μlPrimerR 1.5μlTemplate（模板）5μlddH2O 25μlTotal 50μl2PCR反应条件：①94℃预变性3min②94℃退火30s③65℃延伸40s④68℃40s⑤go to②30个循环⑥68℃5min⑦4℃forever3 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测（1）配置浓度为1%的凝胶。

称取琼脂糖0.3g，加入30ml 1×TAE电泳缓冲液（Tris-乙酸电泳缓冲液）中，用微波炉加热2min，待凝胶稍冷却，加入2μl EB（溴化乙锭，荧光染色剂）混匀后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，并用玻璃棒驱除气泡，待凝胶完全凝结后拔除梳子。

（2）把凝胶置于1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，加样孔置于负极一侧，然后依次在加样孔中加入50μl Marker、50μl样品＋10μl loading buffer(上样缓冲液，可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右)，盖上电泳盖，以100V电压进行电泳。

原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。

②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。

③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。

在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。

2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS 和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。

二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。

一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。

变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。

只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。

做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。

2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。

（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。

（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。

所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。

3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。

原核表达详细步骤Part I 选择表达的目的基因一、 基因序列1. 得到靶基因DNA (cDNA)序列，有几种方式寻找正确的读码顺序：① 利用生物信息学在NCBI 上blast 同源基因，找到同源蛋白，再在DNA 的ORF 中找到正确的读码。

② 实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在 DNA 上找到正确的读码。

③ 利用mRNA 的特征，找到启动子，编码区，终止子。

在编码区中找到翻译 起始密码子与终止密码子(cDNA 。

2. 注意事项：① 区别ORF 和CDS>ORF 一般在DNA 上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS 可以是DNA 上的定义，也可以是mRNA 上的定义，分为complete CDS 和partial CDS 是从第一个核酸开始读，连续读下去， complete CDS 读码是 “M、、、、、、、、、* ”，Partial CDS 的读码是相应的 AA② 在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。

二、 抗原决定簇的预测1、 原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。

一般抗原决定簇 是由6- 12氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列(蛋白质一级结构) 组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。

变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物， 用来免疫动物具有更强的抗原性。

只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会 暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的， 如果用来检 测天然蛋白，可能会有假阳性。

做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对 抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。

选择原则：亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。

处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。

有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。

所以一般来说蛋白 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。

2、 (1) (2) (3)质的 N3、选定抗原决定簇的步骤：(1) 预测：如软件预测DNAstar(Protean)预测，Dnaman 。

三、凝胶滞留试验(EMSA)凝胶迁移滞留试验(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)是研究核酸与蛋白质相互作用简单、快速、敏感的方法,目前已经成为转录因子研究的经典方法,并且用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合,电泳时这种复合物比无蛋白结合的自由探针在凝胶中泳动的速度慢,即表现为相对滞后。

(一)转录因子-标签融合蛋白和标签蛋白的原核表达纯化以GST标签为例。

裂解液:25mM pH7.8Tris-HCl、100mM NaCl、2 mM NaEDTA、1mM DTT和21×Complete Protease InhibitorCocktail。

洗脱液:50 mMpH7.8Tris-HCl、200mM NaCl、1mM DTT、0.02%(v/v)Triton X-100和10 mM还原性谷胱甘肽。

EDTA、1mM DTT和1×Complete 透析液:25mM pH8.0 Tris-HCl、1mM Na2Protease InhibitorCocktail。

1将转化了pGEX-4T-2载体或者pGEX-4T-2-目的基因重组载体的BL21大肠杆菌在5 mL含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中37℃、200 rpm震荡培养12 h。

2 取1 mL菌液加入100 mL 含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中,37℃、200 rpm震荡培养至OD600为0.5左右。

3 加入IPTG至终浓度为0.5 mM,28℃、200 rpm培养6 h。

4 冰上放置10 min,4℃、3000×g离心15 min,收集菌体并称重。

5 每克菌体加入3 mL裂解液,重悬菌体,加入溶菌酶至终浓度为0.5 mgmL-1,在冰上温和地搅动菌液30 min。

6 超声波破碎30 s(破碎10 s停10 s)。

原核表达流程： 第一步
pGEM-T载体
目的基因获取 PCR扩增
重组载体1 转化
DH5a感受态制备 DH5a感受态细胞
第二步
转化细胞1 抽取质粒进行电泳 酶切验证检验阳性
（阳性）转化细胞1 酶切，获取目的基因
Pet28a/DH5a载体 重组
重组载体2
重组载体2 转化
DH5a感受态细胞
转化细胞2 抽取质粒进行电泳 酶切验证检验阳性
(6) 4℃用JA转头（或与之相当的转头） 以2500rpm/min离心20min，以回收 细胞。倒去培养液，用25mL冰冷的10%甘油重悬沉淀。（甘油有保存 细胞的作用）
(7) 4℃用JA转头（或与之相当的转头） 以2500rpm/min离心20min，以回收 细胞。倒去培养液，用1mL冰冷的10%甘油重悬沉淀。（倾倒培养液时 要小心，10%甘油中的细菌沉淀附着力降低。）
3 ．方法
1 ）0.8%琼脂凝胶板的配制：取 0.6g 琼脂糖加80ml TAE（1 × ），
20ml水，微波炉加热融化3 分
(8) 将细胞按40μL等份装入微量离心管，直接使用或-80℃保存
(9) 感受态细胞的检测：取感受态细胞分别涂布含有氨苄青霉素和卡那 霉素抗性的LB平板，
37℃培养12－16小时，观察感受态细菌是否有污染；
(10) 取 1μ g 超螺旋质粒转化制备的感受态，检测转化效率(一般情况下，没 有必要精确计算，可用根据经验估计)。
电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿 孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于 DNA 等大分子进 入。同时 DNA 在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要 的。 实验材料
质粒DNA，pGEM-T载体或PET表达载体，T4DNA连接酶，连接酶缓冲液 10×

三、凝胶滞留试验（EMSA）凝胶迁移滞留试验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）是研究核酸与蛋白质相互作用简单、快速、敏感的方法，目前已经成为转录因子研究的经典方法，并且用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的自由探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。

（一）转录因子-标签融合蛋白和标签蛋白的原核表达纯化以GST标签为例。

裂解液：25mM pH7.8Tris-HCl、100mM NaCl、2 mM NaEDTA、1mM DTT和21×Complete Protease InhibitorCocktail。

洗脱液：50 mMpH7.8Tris-HCl、200mM NaCl、1mM DTT、0.02%（v/v）Triton X-100和10 mM还原性谷胱甘肽。

EDTA、1mM DTT和1×Complete 透析液：25mM pH8.0 Tris-HCl、1mM Na2Protease InhibitorCocktail。

1将转化了pGEX-4T-2载体或者pGEX-4T-2-目的基因重组载体的BL21大肠杆菌在5 mL含100 µg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中37℃、200 rpm震荡培养12 h。

2 取1 mL菌液加入100 mL 含100 µg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中，37℃、200 rpm震荡培养至OD600为0.5左右。

3 加入IPTG至终浓度为0.5 mM，28℃、200 rpm培养6 h。

4 冰上放置10 min，4℃、3000×g离心15 min，收集菌体并称重。

5 每克菌体加入3 mL裂解液，重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度为0.5 mgmL-1，在冰上温和地搅动菌液30 min。

２、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体,而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
CCＹ的IPＴG是1M的,用时进行１０00倍稀释。ﻫ二、操作步骤ﻫ（一)获得目的基因
1、通过PCＲ方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PＣR循环获得所需基因片段。ﻫ2、通过RT-ＰCR方法:用TＲIｚoｌ法从细胞或组织中提取总ＲNA，以mＲNA为模板，逆转录形成cDNＡ第一链,以逆转录产物为模板进行PＣＲ循环获得产物。
1２、用３mｌ 含40０ｍM咪唑洗脱目的蛋白。
１3、镍柱用20%的乙醇适量，4℃保存。
1４、SDS-ＰAGＥ电泳检测蛋白纯化效果（上柱前样本,上柱后样本，杂蛋白，目的蛋白，未诱导蛋白）
附相关试剂配制：
50mＭ ＰBS
NａＨ2PO4.2H2O 1．48g
Na2ＨＰO４.１2Ｈ２Ｏ 14.５046g
NａＣL 29.3g
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件:ﻫ(1）选择标志的编码序列；
(2）可控转录的启动子；ﻫ（3)转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点);
(４）一个多限制酶切位点接头;ﻫ(5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中(测序验证）-转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测,其中包括：ﻫ一、试剂准备ﻫ(1）ＬB培养基。ﻫ(2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）:2.３8g ＩPTG溶于１０ml ｄｄH2Ｏ中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。

原核表达步骤一、转录（Transcription）转录是指DNA转录为RNA的过程，即DNA的信息通过RNA的合成而表达出来。

转录是生物体中基因表达的第一步，也是生物体合成蛋白质的关键步骤之一。

在原核生物中，转录过程分为三个阶段：启动、延伸和终止。

启动阶段是指RNA聚合酶（RNA polymerase）与DNA的结合，并在DNA上找到起始转录位点。

延伸阶段是指RNA聚合酶沿DNA模板链向下滑动，并合成RNA链。

终止阶段是指RNA聚合酶在遇到终止信号时停止转录，释放出合成的RNA链。

二、剪接（Splicing）剪接是指在转录过程中，将RNA前体分子中的内含子（intron）剪切除去，将外显子（exon）连接起来的过程。

原核生物中的剪接方式相对简单，通常是直接将外显子连接起来，形成成熟的RNA分子。

剪接的主要作用是消除内含子的干扰，使RNA分子能够直接参与翻译过程。

通过剪接，原核生物能够快速生成成熟的RNA分子，提高基因表达效率。

三、翻译（Translation）翻译是指将RNA的信息翻译成蛋白质的过程。

在原核生物中，翻译过程发生在核糖体（ribosome）中，涉及到mRNA、tRNA和rRNA等多种分子。

翻译分为三个主要步骤：启动、延伸和终止。

启动阶段是指核糖体与mRNA的结合，并识别起始密码子（AUG）位置。

延伸阶段是指核糖体沿mRNA滑动，将氨基酸依次加入正在合成的多肽链中。

终止阶段是指核糖体在遇到终止密码子（UAA、UAG、UGA）时停止翻译，释放合成的多肽链。

四、调控（Regulation）调控是指控制基因表达水平的过程，包括转录调控和翻译调控两个方面。

原核生物通过调控转录和翻译过程中的各个环节来实现基因表达的精确调控。

转录调控主要通过转录因子（transcription factor）和启动子（promoter）之间的相互作用来实现。

转录因子能够结合到启动子上，促进或抑制RNA聚合酶的结合，从而调控基因的转录水平。

原核表达操作流程实验概要本实验介绍了原核表达的具体操作流程，包括：外源基因的诱导表达，大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化。

实验原理1. E. coli 表达系统E. coli 是重要的原核表达体系。

在重组基因转化入E. coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。

2. 外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。

常用的有温度诱导和药物诱导。

本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。

不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。

主要试剂1. 诱导表达材料1) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌2) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。

3) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2. 大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1) 酶溶法a. 裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaClb. 50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。

c. 10 mg / mL 溶菌酶。

d. 脱氧胆酸。

e. 1 mg / mL DNase I。

2) 超声破碎法a. TE 缓冲液。

原核表达及纯化-His tag一、原核表达1.挑取一个单菌落（重组表达载体），接种到10mL LB培养基中（注意抗生素抗性）。

37℃，过夜摇菌。

2.次日，将菌液接种到1L LB培养基中（1:50~1:100），继续培养至OD600=0.6时（0.6~0.8），加1×IPTG诱导4h。

（加IPTG前留样（诱导前全菌蛋白）200μL做SDS-PAGE）3.收菌：(1)200μL诱导后全菌；(2)小量表达：收集5mL诱导后全菌，12000g离心1min，裂解沉淀，分别收集上清（可溶性）和沉淀（包涵体）中的蛋白。

大量表达：收集1L诱导后全菌，4℃，4500g离心15~30min。

二、可溶性分析目的：重组蛋白是否表达，是可溶性的还是包涵体形式。

根据这个结果选择纯化方法。

（1）各用30μL 4×SDS Loading buffer重悬诱导前和诱导后的菌体（200μL）；用500μL 1×Binding Buffer重悬菌体（5mL），超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）；4℃，19000g离心15min，分离上清和沉淀；（2）用30μL 4×SDS Loading buffer重悬沉淀；（3）取10μL上清蛋白加10μL 4×SDS Loading buffer；（4）将诱导前全菌，诱导后全菌，上清蛋白和包涵体蛋白煮沸5~10min。

（5）各取10μL 用于SDS-PAGE检测（12%的胶）。

三、小量富集实验样品制备：取5mL诱导全菌，用500μL 1×Binding Buffer（8M Urea）溶解，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）。

4℃，19000g离心15min，取上清用于富集实验。

（留样做SDS-PAGE）富集：1.装柱：取30μL~50μL体积的Ni柱料（纯柱料）于1.5mL离心管中。

TAKARA DNA凝胶回收试剂盒1. 切胶：先用酒精灯消毒手术刀，在酶切仪中切胶，把片段放入1.5ml管中，用枪头搅碎。

2. 加GM试剂溶胶：加入700--800ul左右的GM，放进45℃水浴锅中溶胶。

3. 拿新的过滤柱和离心管，转移溶胶后液体进过滤柱，12000rpm.1min离心，把滤液重新倒进过滤柱，同样离心，后弃滤液。

4. 加WB（加乙醇）清洗：向过滤柱中心加700ulWB，同样条件下离心两次，弃滤液，最后空离30s。

5. 换新的1.5ml离心管，把柱子放入，加30ul的Elution Buffer/DDH2O.（注意要加在中央，不要碰壁）6. 离心1min，把滤液重新加入到过滤柱中，再离心，得到溶解的DNA液体，弃柱子。

7. 保存：-20℃LB培养液制备（1000ml）1. 称量：10g胰蛋白胨粉，5g酵母提取物，10gNacl于玻璃瓶，加DDH2O 1000ml。

2. 灭菌：把盖子拧松，高压蒸汽灭菌121℃，20min。

3. 置室温降温，后放4℃保存。

LB固体培养基制备1. 向100ml的液培中加入1.5g琼脂粉，高压灭菌20min。

2. 抗生素贮存液：卡那霉素（Kan）贮存液50 mg/ml、氨苄西林（Amp）贮存液100 mg/ml (均经过0.22µm 滤膜过滤除菌），-20℃储存，使用浓度卡那（k+）0.05mg/ml，氨苄（A+）0.1mg/ml。

3. 取出培养液，待其温度降至45—50℃时（不烫手），按照1:1000比例加入抗生素，充分混匀。

4. 倒入6cm一次性培养皿中，静置30—60min（等待平板冷却）。

5. 封口胶封口，倒置保存在4℃，期限为30D。

纯化PCR 产物（胶回收）（天根试剂盒）1. 在紫外灯下准确切取含有目的DNA片段的凝胶（体积尽可能小），放入干净的1.5 ml EP 管（预先称取空管重量）中，称取凝胶的重量。

2. 按每0.1 g凝胶加入100 ul PC溶液的比例往EP管中加入溶液PC，50℃水浴放置约10 min，期间不断温和晃动，确保凝胶完全溶解，此时溶液呈现黄色。

原核表达步骤总结原核表达步骤总结原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。

本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109菌株中。

一( 鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达制样 (一)1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加入0.7ul Ampo(100mg/mL)，37C200r/min摇床培养，过夜活化。

2. 以1:50比例(200ul)，将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中，o加入10uLAmp(100mg/ml)，37C200r/min摇床扩大培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。

(一般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照(CK)，其余ul IPTG(储存浓度为0.5mol/l)，使IPTG终浓度达到0.5mmol/l。

7ml菌液加入7o以200r/min的转速，37C摇床培养3h。

4. 以5000r/min离心2min收集菌体，倾倒上清，每个离心管收集3ml培养物。

5. 加入1ml dHO，将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min离心2min，2倾倒上清。

6. 重复步骤5。

将离心管中的水倒干净。

(二)菌落SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加入200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，一般200ul比较合适)。

用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。

2. 将样品于100?恒温加热器上开盖加热10min(Marker也要加热)。