脱色摇床的原理及使用
脱色摇床是一种工作方式为摇摆式的摇床，在同类产品中技术较先进，具有质量可靠，运行平稳，噪音小，无级调速等特点，是生化、生物工程、教学、微生物及医学等行业研究和生产中的优选设备。
脱色摇床主要是指跑电泳时染色、脱色，还有细胞培养等需要的，其主要就是较小，而且上面的台面一般是平的，做水平回旋（现在也有一些可以上下摇动，整体做旋转晃动，这样摇晃的均匀度和一致性比较好）；
脱色摇床是指台式小型，用于蛋白电泳的脱色过程，一般只有很低的转速，是开发性的，体积相对较小。
采用永磁直流电机作为动力，通过先进的电子调速电路，能够保持较为平稳的运动速度，同时具有使用寿命长，维护简单，操作方便的优点。
脱色摇床的用途：
1、脱色摇床，是作振荡振动的实验室设备。脱色方面：可用与电泳凝胶的固定，考马斯兰染色和脱色的振荡摇晃；
2、也可用与硝酸银染色时的固定、染色、显影等；
3、放射自显影中X光显影、定影；
4、电泳转移纤维素膜的进一步处理，抗原—抗体的反应和染色；
5、装上摇瓶架后，可用于细胞、微生物的培养及各种需振荡、混匀、培养的实验和研究。
脱色摇床的使用方法：
将需要振荡容器放置在托盘上，然后接通电源，打开电源开关，根据需要调节定时旋钮，顺时针缓慢调节速度旋钮，根据需要选择振荡速度。
使用完毕，先将调速旋钮调整到小状态，再关闭电源，取下振荡的容器即可。
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脱色摇床
实验室要求 1、实验室安全须知 ●实验室规定在进行任何实验操作时都应尽可能穿着实验服（白大褂），若因违反此 规定而导致的衣物损伤甚至于人身伤害应自己负责。涉及挥发性、刺激性及有毒试剂的操作必须在通风橱内进行，对违反此规定者任何人都有权指出并追究责任。 注意不要戴着手套接触电脑键盘、鼠标、照明开关、电梯开关等公共区域。 ●实验室的安全问题关系到每个人的切身利益。实验室危害源按大小区分如下：放 射线、病毒 >>氯仿> EB / acrylamide >臭氧。 ●特别需要关注的是氯仿，会导致肝肿大、肝硬化，如果瓶子的内塞不盖，会不知 不觉中挥发，不知不觉中实验室所有人都吸入了氯仿。新开瓶的氯仿要在上面加上0.5 cm厚的离子水，防止氯仿挥发。 ●EB在Ames test中显示有致突变活性，但实际上不能穿越表皮，因此即便沾在手 上也危害甚微。如果浓度比较高，可以用次氯酸钠等氧化剂擦手。 ●臭氧会导致肺气肿和肺纤维化，因此要尽量缩短开石英紫外灯的时间（只有石英 灯管才会发生臭氧），并尽量避免吸入臭氧； ●向下水道倒废液，要注意将危害大的物质做适当处理：如考马斯亮兰染色液应该 加入次氯酸钠将色素破坏后确认达到中和。 ●实验室所有成员都应熟悉实验室内水、电开关的分布，在遇到紧急情况的时候应 立刻关闭相应的开关。还应该熟悉大楼的各种应急措施，包括灭火器的位置及报告火情的警铃按钮 ●火情紧急对策。任何时候若发现火情，应立即呼叫救援。若是由电器产生的火情 应立即关闭总电源。若火情不大，可立即到走廊取灭火器进行扑救。若火情已不能由灭火器扑灭，迅速按下走廊墙壁上的红色火情警铃并拨119报火警 ●任何时间内最后离开实验室者都应检查水、电后锁门方能离开 2、实验记录 ●实验数据的记录：所有实验应标明实验目的、方法、结果和结论。实验结果、图 表等均应在笔记中标注清楚。和导师讨论后要记录讨论的时间和内容以及达成的共识。铭记――好记性不如烂笔头。
围绕siRNAs的相关实验详细步骤及总结 实验一：细胞传代培养 材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、培养瓶、含10%FBS 的RPMI—1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、PBS、trypsin等 步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（SKOV-3） 1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；含10%FBS的RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。 2、取一个生长良好的细胞培养瓶（密度适中，细胞成梭形连接，贴壁良好），弃旧培养基，PBS 2ml 清洗2次（切勿用力吹打）。 3、用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入，然后放平培养瓶，使贴壁细胞与trypsin充分接触，置于CO2培养箱2min左右（时间不能太长，以免损伤细胞）。 4、往培养瓶中加入1640 1~2ml，随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中，离心1000 r/min，5min。 5、弃上清液，加入少量10%FBS的1640培养基使成细胞悬液。 6、分装，按1:2~3传代，每瓶4~5ml。倒置显微镜下观察（细胞突起消失变圆形，细胞间隙等距），标记。 7、放入CO2培养箱中培养，第二天观察生长状况。 总结：1、在用离心机时，看清楚是RCF还是RPM；调节Temp.以及Time。 2、在用移液枪吸出trypsin充分消化后的细胞后，须知用少量培养液 清洗一下培养瓶，并将清洗液移入离心管中。 3、每取用一个容器，拧开或者拧上盖子时，注意在酒精灯上旋转一圈。另外，记住用酒精棉球经常擦拭台面。 4、在用移液枪或者吸管混匀细胞悬液过程中，动作轻柔，避免产生气泡等。 实验二：细胞冻存 材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、冻存管、RPMI —1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、FBS、PBS、trypsin、DMSO等步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（OVCAR-3） 1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；
细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min
↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)
免疫荧光双染 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法（double immu nofluoresce nee labeli ng method）也分为直接法和间接法。 冰冻切片荧光tunel +免疫荧光双标实验步骤 1、？冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固 定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 2、?修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走）， 在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织， 37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、？破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 4、？加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1? （TdT）? 和试剂2（dUTP）按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37 C恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。 5、?BSA封闭:将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次， 每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。 6、？加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗， 切片平放于湿盒内4 °孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、？加二
抗：玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min 。 8、？DAPI复染细胞核：切片用PBS( PH7.4)洗涤3次，每次5min。去除PBS 后在圈内滴加DAPI 染液，避光室温孵育10min。 9、封片：玻片置于PBS (PH7.4) 中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次 5min 。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。 10、?镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。 (紫 外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm， 发射波长515-555?nm；CY3 红光激发波长510-560，发射波长590nm) 石蜡切片荧光tunel +免疫荧光双标实验步骤 1、?石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I 15- 20min-二甲苯 n 15- 20min-无水乙醇I 10min-无水乙醇n 10min-95%酒精5min-90%酒精 5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗(冬天脱蜡时间稍微延长) 。 2、?修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止液体流走)， 在圈内滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释)覆盖组织， 37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次5min 。 3、?破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，将玻片置于PBS( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 4、？加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1?(TdT)? 和试剂2(dUTP)按2:29混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内， 37C恒温箱孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。 5、？BSA封闭:将玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次， 每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温圭寸闭30min。
Western-Blot操作流程 试剂配制 1.RIPA裂解液： 10mM Tris（MW121.14，PH7.5） 1%NP40 0.5%TritonX-100 0.2%脱氧胆酸钠 2 mM EDTA 1 mM PMSF 20%甘油 调pH值至7.5。 混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。 制胶用（1-6）： 1. 1.0mol/L Tris〃HCl （pH6.8） Tris (MW121.14) 12.114g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。 2. 1.5mol/L Tris〃HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 18.671g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。 3.10％SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml 如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。 如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 4.10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g
（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周） 5．四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4?C保存。 6．30%丙稀酰胺： 4?C保存。 10%下层胶，即分离胶（两块胶，15ml）：胶的浓度根据自己所做蛋白的大小确定依次加入去离子水 5.9ml 30%丙烯酰胺 5ml 1.5M Tris-HCl（pH8.8） 3.8ml 10%SDS 150μl 10%AP 150μl TEMED 6μl 每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。灌胶后加异丙醇（1ml）消泡 5%上层胶（两块胶，6ml）： 依次加入去离子水 4.1ml 30%丙烯酰胺 1ml 1M Tris-HCl（pH6.8） 0.75ml 10%SDS 60μl 10%AP 60μl TEMED 6μl 每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。 7．5X电泳液缓冲液 Tris（MW121.14） 15.1g 甘氨酸（MW75.07） 94g SDS 5.00g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。 8．10X转膜缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g
EMSA PROTOCOL IMPORTANT REAGENT Boitin-N4-CTP (invitrogen # 15918-18) TdT (NEB # M0252L) Poly(dI.dC) (sigma ＃P4929) Hybond-N+ 尼龙膜(Amersham ＃RPN303B) ECL发光液(Perkin Emor) BUFFER Buffer A(store at 4℃) Hepes (pH7.9) 10mM KCl 10mM EDTA 0.1mM DTT(fresh added) 1mM PMSF(fresh added) 0.5mM Buffer B (store at 4℃) 0.5M EDTA in PBS (pH7.4) Buffer C(store at 4℃) Hepes (pH7.9) 20mM NaCl 0.4M EDTA 1mM DTT(fresh added) 1mM PMSF(fresh added) 1Mm Buffer I (store at RT) Tris (pH7.5) 0.1M NaCl 1M MgCl2 2mM Buffer II (pH7.5) (store at RT) 马来酸100mM NaCl 150mM Buffer III (store at RT) Tris(pH9.5) 100mM NaCl 100mM MgCl2 50mM Blocking Buffer (store at 4℃) 0.3％Tween-20, 0.3%Triton X-100, 5%BSA in Buffer I
Wash Buffer 0.3％Tween-20 in Buffer II 20×SSC (1L pH7.0) NaCl 175.3g 柠檬酸钠88.2g Binding Buffer (store at -20℃) 1×10× 25mM HEPES (pH7.4) 250mM HEPES (pH7.4) 50mM KCl 500mM KCl 5mM MgCl 2 50mM MgCl 2 0.5mM EDTA 5mM EDTA 1mM DTT 10mM DTT 5% Glycerol 50% 0 Glycerol 10mg/ml BSA (TE, pH8.0, store at -20℃) Poly(dI.dC) (store at -20℃) SA-HRP(储存液store at -20℃工作液store at 4℃) 1mg/ml in 50%PBS (pH7.2) 50%Glycerin 5×TBE (1L) Tris 54g 硼酸27.5g EDTA 3.72g 20ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 5×TdT Reaction Buffer (store at -20℃) (pH7.2) Sodium cacodylate 0.5M CoCl210mM TCEP 1mM Biotin-N4-CTP (store at -20℃) Biotin-N4-CTP 50mM Tris (pH7.5) 10mM EDTA 1mM TE buffer 10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0
Western（试剂配制和操作步骤） 试剂配制：（一）母液（二）使用液 操作步骤：（一）蛋白样品制备（二）蛋白含量的测定（三） SDS－PAGE电泳 （四）转膜（五）免疫反应（六）化学发光，显影，定影（七）凝胶图象分析 关键词：印迹试剂Western 印迹法免疫反应蛋白样品制备SDS－PAGE电泳 这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。 耗材：硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸， 试剂配制： （一）母液 1.0mol/L Tris?HCl Tris(MW121.14) 30.29g 蒸馏水200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 PH HCl 7.4 约17ml 7.5 约16m 7.6 约15ml 8.0 约10ml
10％SDS SDS10g 蒸馏水至100ml 50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺0.1g 超纯水 1.0ml 溶解后，4℃保存，保存时间为1周。 1.5mol/L Tris?HCl（pH8.8） Tris(MW121.14) 45.43g 超纯水200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 0.5mol/L Tris?HCl（pH6.8） Tris(MW121.14) 15.14g 超纯水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。20％Tween20 Tween20 20ml 蒸馏水至100ml 混匀后4℃保存。
免疫荧光三重标记具体方法及步骤 即利用抗原抗体特异性结合原理，在同一张切片上3个抗原进行同时标记，从而实现定位，定性，半定量的分析 1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。 2、抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min停火8min转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织来确定) 3、画圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走) 4、血清封闭:在圈内滴加BSA孵育30min。(一抗若是山羊来源，则加兔血清) 5、加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发) 6、加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。
次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加CY3荧光增强剂，避光室温孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 8、微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。 9、加第二种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发) 10、加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 11、加FITC荧光增强剂：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加FITC荧光增强剂，避光室温孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 12、微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。 13、加第三种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)
（振荡器）摇床的基本分类参考介绍 摇床是一种常用的实验室设备，属于生化仪器，广泛用于对温度和振荡频率有较高要求的细菌培养、发酵、杂交、生物化学反应以及酶和组织研究等。实验室常用的液体摇匀，微生物、细菌和细胞培养。 其中分类： （1）常温摇床： 小型摇床，其中脱色摇床又有：往复回旋振荡器、往复式振荡摇床、往复式调速多用摇床、回旋式振荡器、多用途旋转摇床、圆周式震荡摇床等 （2）恒温摇床： 台式恒温振荡器、加热振荡器、冷冻振荡器摇床、气浴恒温摇床、水浴恒温摇床、数显恒温摇床、数显水浴摇床、大振幅大容量（光照）振荡器摇床、变频大型双层怛温摇床、新型精密经济型恒温摇床等.（3）培养摇床： 振荡培养摇床、全温培养摇床、恒温培养摇床、细胞培养摇床、液晶屏恒温（台式）培养摇床、变频恒温培养摇床、振荡摇床培养箱、水平摇床培养箱. （4）智能型摇床： 智能控制小型台式摇床、智能控制高精度小型台式恒温摇床、智能控制高精度大型全温光照恒温摇床、智能控制高精度恒温摇床、智能控制高精度双层恒温摇床. （5）其它： 微量振荡器摇床、粉剂溶解器摇床、梅毒旋转仪摇床、双层摇瓶机摇床、康氏摇床、小型微孔板振荡摇床、大振幅大容量振荡器摇床、大容量往复式普通摇床、大振幅大容量（光照）振荡器摇床、三层摇床、双层摇床、二维摇床、三维摇床、通用摇床、万向摇床等。 恒温摇床配件： 托盘、多功能弹簧架、烧瓶夹、混盒托盘 一、气浴恒温振荡器 气浴恒温振荡器（又称空气恒温摇床）：是一种温度可控的恒温水浴槽和振荡器相结合的生化仪器。 应用领域：该产品适用于环境保护、医疗、教学、卫生防疫、药检、动植物学、海洋科学、食品工程等科研、生产部门，是水体分析的BOD测定。细菌、病毒、霉菌、微生物的培养保存，植物栽培，育种试验的带振荡的专用恒温设备。 （一）气浴恒温振荡器（摇床） 1、主要特点 （1）温度控制采用集成运放系统 （2）LED显示
免疫荧光双染集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]
免疫荧光双染 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。 冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全 干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K 工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按 2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。 5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加 用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。 6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内 4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在 圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染 液，避光室温孵育10min。 9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用 抗荧光淬灭封片剂封片。 10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330- 380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555?nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm） 石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯Ⅱ15-20min-无水乙醇 Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗（冬天脱蜡时间稍微延长）。 2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K 工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
荧光显微镜检测方法（以96孔板，A549贴壁细胞为例） 细胞培养 取对数生长期细胞，以每孔4×103~1×105细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。 药物处理 （可选）客户可以根据实验需要进行各种药物处理。 EdU标记 1.1 用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μM EdU 培养基； 注：1）如果需配置10μM EdU培养基，需调整为5000：1稀释比例； 2）配置好的培养基的保存时间取决于培养基的性质，如LB培养基4℃可稳定保存两周。 1.2 每孔加入100μL 50μM EdU培养基孵育2小时，弃培养基； 注：1）EdU培养基用量以没过细胞为宜(表1)； 2）最佳孵育时间与细胞周期相关（表2），大多数细胞系可采用2小时孵育时间； 3）EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育（<30min）宜采用高浓度（50 μM），长时间孵育（>24h）宜采用低浓度（1 μM），最佳孵育浓度需要优化。 1.3 PBS清洗细胞1~2次，每次5分钟。 注：清洗目的是将未渗入DNA的EdU洗脱，清洗方式依据不同的细胞类型而定，贴壁不牢的细胞请降低清洗强度。 细胞固定化 2.1 每孔加入100μL 细胞固定液(即含4% 多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟； 注：1）低浓度的多聚甲醛有利于细胞结构的保持，当需要抗体染色时，需采用Triton X-100透化细胞以利于抗体染料进入细胞内。 2）可采用其他方式进行细胞固定。 2.2 每孔加入2 mg/mL 甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液； 注：作用是中和多聚甲醛，当采用其他方式进行细胞固定时可省略此步骤； 2.3 每孔加入100 μL PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS； 2.4 （加强）每孔加入100μL渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟；PBS 清洗1次，5分钟。 注：当实验需要进行其他抗体染色，或由于某些细胞类型对染料的吸附性较高，可能需要增强细胞膜通透性。 Apollo染色 3.1 每孔加入100 μL的1X Apollo?染色反应液（表3），避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液； 注：染色液用量与细胞培养体积相关，以覆盖细胞为宜（表1）。 3.2 加入100 μL渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS) 脱色摇床清洗2~3次，每次10分钟，弃渗透剂； 3.3 （加强）每孔每次加入100 μL 甲醇清洗1~2次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟。 注：由于某些细胞对染料的吸附性较高，需采用加强方式洗脱以降低染料背景。 DNA染色 4.1 用去离子水按100：1的比例稀释试剂F，制备适量1X Hoechst33342反应液，避光保存；
MTT试验方法 MTT法原理、步骤以及注意事项(2009-05-28 11:18:56)标签：杂谈分类：实验操作技能 MTT原理 MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处（也有用570nm波长的，我目前用的都是570nm)测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。 MTT 溶液的配制方法 通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。 MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。我自己操作一般是每次配制15ml,过滤后4℃避光保存，在两周内用完。 MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉. 配制MTT时用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：Nacl 8g ＋Kcl 0.2g ＋Na2HPO4 1.44g ＋KH2PO4 0.24g调pH 7.4,定容1L。 普通MTT法实验步骤： 1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细
免疫荧光双染 Prepared on 22 November 2020
免疫荧光双染 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。 冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固 定10min，待丙酮完全干后于PBS（）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走）， 在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，将玻片置于PBS（）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂 1(TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。 5、BSA封闭:将玻片置于PBS（）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次 5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 7、加二抗：玻片置于PBS（）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次 5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。 9、封片：玻片置于PBS（）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次 5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。 10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465- 495nm，发射波长515-555nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长 590nm） 石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯 Ⅱ15-20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精 5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗（冬天脱蜡时间稍微延长）。 2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
免疫沉淀（Immunoprecipitation IP ） 美国芝加哥大学分子肿瘤实验室提供 一、准备试剂：IP裂解液配制方法（100毫升体积）： 50mM Tris-HCl pH 7.5 1M 5ml 100mM NaCl 5M 2ml 0.5% NP-40 (10% stock) 10ml 0.3mM NaVO3 5.52mg 50mM Na F 210mg 20mM Na Pyrphosphate 892mg 1mM PMSF 17.42mg 加水至总体积达到100 ml 二、实验步骤：（本方法适用于从细胞培养来源的蛋白质） 1．将细胞培养液移去，加入裂解液-蛋白酶抑制剂混合液（IP-PI buffer）（T25培养瓶中加入1毫升，T75中加入3毫升），充分裂解后，将混合液转入微量离心管中。 2．冰上放置20分钟，偶尔轻微震荡。 3．4℃下，微量离心机最高速离心5分钟。将上清液转移至另一微量离心管中。 4．加入30ul protein G- Sepharose beads（与IP-PI buffer 1：1混合）至样品中，4℃下充分混合震荡反应1小时。 5．微量离心机最高速离心1分钟，将上清转移至另一微量离心管中。 6．加入抗需要沉淀的蛋白质的抗体（2-5ug/ 样品），4℃下充分混合震荡反应1小时。7．加入30ul protein G- Sepharose beads，4℃下充分混合震荡反应1小时。 8．微量离心机最高速离心1分钟，将上清吸弃，收集beads沉淀。 9．沉淀中加入2ul 2-巯基乙醇，煮沸10分钟，离心后取上清，行SDS-PAGE胶电泳及Wester-blotting 检测。
石蜡切片免疫荧光实验步骤 1、脱蜡至水：将组织切片室温放置10min后，依次将石蜡切片放 入二甲苯3min→无水乙醇5min—85%酒精5min—75%酒精5min—ddH2O洗5min。 2、抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复液（50X稀释至 1X使用)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（中火8min—停火8min—中低火7min）。此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min（具体修复液和修复条件根据组织来确定）。 3、画阻水圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，防止液体 流失。 4、BSA封闭：在圈内滴加3%-5%浓度BSA孵育30min（或二抗 同源血清封闭）。 5、一抗孵育：轻轻甩干封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的 一抗（溶于血清：PBS=1:19的抗体稀释液体系中），切片平放于湿盒（内加少量水防止抗体蒸发），4°C过夜。 6、二抗孵育：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每 次5min。切片稍甩干后在圈内滴加相应的荧光二抗，覆盖组织，避光RT孵育50min。 7、DAPI染核：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每 次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光RT孵育3-5min。 8、树脂封片：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每 次5min。切片稍甩干后用树脂封片剂封片（其间可滴加少量抗荧光淬灭剂）。 9、镜检拍照：切片于荧光显微镜/confocal/活细胞工作站中观察并 采集图像（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光； CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发橙光；CY5发红光）。 10、结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳 性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光，图片处理需使用Image J 软件。
考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液 货号：P1300 规格：500ml 组成：溶液A10ml、溶液B500ml 保存：2-8℃保存，1年有效。 产品简介： 考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液是一种即用型快速灵敏而且安全的染液，以考马斯亮蓝G-250为染料，可用于SDS-PAGE或者非变性电泳蛋白凝胶的快速染色，染色时间短，半小时内即可检测到蛋白电泳条带。使用方法： 工作液的配制，取100ml溶液B，加入2ml溶液A，混匀，此为工作液。此工作液配好后请在一周内使用完，过期效果会有一定的影响。 1.将电泳后的PAGE胶（以8cm×10cm大小为例）取下放入容器中，加入50ml双蒸水或去离子水，加热至沸腾后停止，（可选：继续在脱色摇床上摇动5分钟），弃去水溶液。 2.加入25ml快速染色工作液，加热至沸腾后保持沸腾状态30-60秒，停止加热后继续在脱色摇床上摇动5-10分钟，弃去染色液（此时蛋白条带应已可见）。 3.加入约50ml水，加热至沸腾后保持沸腾状态30-60秒，停止加热后继续在脱色摇床上摇动5-10分钟，换水即可完成脱色，观察结果。 注意事项： 1.染色前的清洗步骤（第一步）中，水的质量非常重要，质量越好灵敏度越高，研究证明若用自来水加热清洗，染色效果与灵敏度仅与常规甲醇考马斯亮蓝染色（分子克隆第二版）相同。 2.脱色时可用自来水清洗。
3.若要得到无背景的染色胶，可重复脱色步骤或将胶放在水中过夜。 4.经本产品染色的PAGE胶，胶的缩涨度小于5%，染色后的胶可在水中放置数月而无明显脱色。 5.每次加热后，继续在脱色摇床上摇动5分钟，可增强染色效果。 6.本染色液有轻微腐蚀性，请带手套操作。 相关产品： P10154×蛋白上样缓冲液（含DTT） P1305考马斯亮蓝染色套装（染色液+脱色液） A101030%丙烯酰胺(29:1) T10705×Tris-甘氨酸电泳缓冲液 SP1060SDS-PAGE凝胶制备试剂盒 P001210×丽春红染色液
一、原理 黄色的噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的针状Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。 二、实验步骤（实用于贴壁细胞） 1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔180μl，3000-10000个/孔。 2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁，培养6-24小时。 3）加入待筛样品20μl，继续培养44小时。 4）小心吸去上清，加入80μl新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。 6）然后吸掉上清，每孔加入150 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。 7）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。 8）计算抑制率＝[(对照-空白)-(给药-空白)]/(对照-空白)X100%.有依据吗 MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm 处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。 MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 MTT 步骤如下： 1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔