细胞培养—传代—冻存—western blot等实验相关步骤

细胞培养实验步骤大全(精华版)细胞培养是生物学研究中常用的技术，在许多实验室中都扮演着重要角色。

下面是细胞培养的一般步骤，供参考。

材料准备1. 细胞培养基：根据实验需求选择适当的培养基，如DMEM、RPMI 1640等。

2. 细胞培养器具：培养皿、离心管、移液器等。

3. 细胞培养室：确保环境清洁、无菌。

细胞准备1. 细胞来源：选择要培养的细胞系或原代细胞。

2. 细胞传代：如果使用的是细胞系，根据需要进行传代，确保细胞状态良好。

细胞培养1. 细胞计数：使用显微镜和细胞计数仪等工具，准确计算细胞数目。

2. 细胞接种：按照实验要求，在含有培养基的培养皿中接种适量的细胞。

根据细胞类型的不同，可能需要预先涂覆培养皿。

3. 细胞培养条件：根据细胞类型的要求，提供适宜的培养条件，如温度、湿度和CO2浓度等。

4. 培养培养：定期更换培养基，保持细胞处于良好的生长状态。

5. 细胞观察：使用显微镜观察细胞形态和生长情况，检测是否存在异常。

细胞处理1. 细胞传代：根据细胞数量和状态，决定是否进行细胞传代。

传代可以延续细胞的寿命和维持细胞应答。

2. 细胞刺激：根据实验设计，给予细胞适当的刺激，如添加药物、因子或介质等。

3. 细胞采集：当需要获取细胞样本时，使用细胞剥离剂或胰蛋白酶等方法将细胞从培养皿中采集。

4. 细胞冻存：如果需要长期保存细胞，可以使用液氮冷冻保存的方法。

先加入冻存液，然后将细胞在适当条件下冷冻保存。

以上是细胞培养的一般步骤，根据具体实验和细胞类型，步骤可能会有所调整和细化。

在进行细胞培养实验时，请始终注意无菌操作和合理使用实验工具，以确保实验结果的准确性和可靠性。

细胞实验的基本操作方法
细胞实验的基本操作方法可以包括以下步骤：
1. 细胞培养：将待实验的细胞株从冷冻保存中取出，放入无菌培养皿内，并加入适宜的培养基。

设置适当的培养条件，如温度、湿度和二氧化碳浓度等。

定期观察细胞生长情况并进行细胞的传代。

2. 细胞传代：当细胞培养达到一定密度时，将细胞通过酶消化方法从培养皿中取出，然后转移到新的培养皿中重新培养。

该方法可以获得更多的细胞数量，以维持细胞培养的供应。

3. 细胞分离：对于某些实验需要用到单独的细胞的情况，可以采用细胞分离的方法，如通过胰蛋白酶消化细胞外基质、抑制细胞黏附等，使细胞单个分散。

4. 细胞检测：使用显微镜观察细胞的形态变化，细胞生长情况和细胞颜色等。

也可以利用荧光显微镜观察细胞内的特定荧光标记物，如细胞核染色剂、蛋白质荧光探针等。

5. 细胞培养基交换：定期更换细胞培养基，以保持细胞的生长状态和代谢活性。

6. 细胞处理：根据实验需要，在培养皿中添加不同浓度或种类的化合物，如药物、抗生素等，对细胞进行处理。

7. 细胞采集：根据实验需求，利用细胞刮刀、吸球等方法将细胞从培养皿中收集起来。

8. 细胞冻存：将细胞保存在液氮中，以便长时间保存和后续使用。

9. 细胞裂解：对于某些实验需要提取细胞内的特定分子或蛋白质，可以使用细胞裂解液将细胞内组分释放出来。

10. 细胞计数：通过显微镜或细胞计数仪等方法，对细胞数量进行计数和测定。

请注意，具体细胞实验的操作方法可能因不同的实验目的和细胞类型而有所差异，上述仅为一般的基本操作方法。

在进行细胞实验时，应严格遵守相关实验室规范和安全操作指南。

细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。

第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。

第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。

第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。

确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。

第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。

培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。

细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。

细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。

细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。

第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。

定期检查细胞的形态和生长状态。

第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。

确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。

第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。

冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。

细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。

细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。

降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。

第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。

定期检查液氮罐的液位和温度。

第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。

检查培养箱、显微镜等设备是否正常。

第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。

快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。

细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。

离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。

细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。

WB实验步骤详解Western blotting（简称WB）是一种常用的蛋白质检测技术，通过将蛋白质分离、转移和检测，可以用来确定特定蛋白质的存在和表达水平。

本文将详细介绍WB实验的步骤，以帮助读者了解该技术的操作流程。

1. 细胞培养和蛋白提取。

首先，需要培养细胞并收集细胞样本。

将细胞样本离心，去除培养基，然后用PBS洗涤细胞。

接下来，加入细胞裂解液并振荡离心，收集上清液，即为蛋白提取物。

2. 蛋白质浓度测定。

使用BCA或Bradford方法测定蛋白提取物的浓度，以确保后续实验中使用的蛋白质量一致。

3. SDS-PAGE凝胶电泳。

将蛋白提取物加入蛋白负载缓冲液，然后加入SDS-PAGE凝胶槽中。

进行电泳分离蛋白质，根据蛋白质大小和电荷不同，蛋白质会在凝胶中形成不同的条带。

4. 蛋白质转印。

将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到膜上，通常使用半湿式或全湿式转印。

将蛋白质从凝胶转移到膜上，使得蛋白质可以与抗体结合。

5. 阻塞。

将膜放入含有蛋白质的溶液中，如5%脱脂奶粉或蛋白质阻塞缓冲液中，阻塞非特异性结合位点。

6. 一抗孵育。

加入第一抗体，孵育过夜。

第一抗体与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。

7. 洗涤。

用TBST或PBS洗膜，去除未结合的抗体。

8. 二抗孵育。

加入HRP标记的二抗，孵育1小时。

二抗与第一抗体结合，形成复合物。

9. 洗涤。

用TBST或PBS洗膜，去除未结合的二抗。

10. 显色。

加入ECL显色液，使得膜上的蛋白质产生发光反应。

将膜放入暗室中，用X光片曝光，然后用显影液显影。

11. 图像获取和分析。

将X光片放入X光片扫描仪中，获取蛋白质条带的图像。

使用图像分析软件，如ImageJ，分析蛋白质的相对表达水平。

以上就是WB实验的详细步骤，每一步都至关重要，需要严格按照操作规程进行。

希望本文能够帮助读者更好地理解WB实验的操作流程，并在实验中取得准确、可靠的结果。

Western blot 步骤一、蛋白样品制备1.细胞样品：弃去培养基→预冷PBS洗涤3次→弃去PBS，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上轻摇裂解30min→将裂解液及细胞碎片移至离心管→4℃下12000rpm离心5min→取少量上清，BCA法测定蛋白浓度→其余上清加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性，-80℃保存。

2.组织样品：直径5mm组织放入1.5ml EP管→加入RIPA和蛋白酶抑制剂→冰上剪碎→电动匀浆器间歇匀浆1min→间断超声破碎2min→4℃下12000rpm离心5min→取少量上清，BCA法测定蛋白浓度→其余上清加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性，-80℃保存二、电泳、转膜1.组装制胶版，按目的蛋白分子量配制7ml对应浓度的分离胶液，摇匀后迅速灌胶至胶板2/3高度。

2.以ddH2O封闭胶液，室温下静置30分钟。

倾去覆盖水层，以滤纸小心吸去剩余的水。

3.配制5％积层胶3ml，迅速混匀，加到分离胶上至胶版上缘，小心插入梳子，室温下聚合时间1h。

4.将聚合好的两块胶安装至电泳槽中，倒入1×电泳缓冲液5.将取等质量蛋白样品及蛋白Ladder，每孔上样10-20μL。

6.接通电源，积层胶电压为60V。

7.待溴酚兰电泳至积层胶与分离胶分界处，将电压调为100V继续电泳，待溴酚兰电泳至底部时终止电泳，小心取胶，放置于转膜缓冲液中。

8.剪下同样大小的PVDF膜，甲醇浸泡30秒后转膜缓冲液轻漂洗。

9.组装“三明治”，以恒定电流350mA转膜2小时10.转膜完毕后，取出PDDF膜，蛋白面向上，5％脱脂奶粉室温下轻摇封闭2小时。

11.取出PVDF膜，吸去表面奶液后放入杂交袋，蛋白面向上，一抗TBS稀释后加入杂交袋，4℃孵育过夜。

12.取出PVDF膜，1×TBS摇床漂洗10分钟，漂洗3次后放入杂交袋。

13.二抗TBST稀释后加入杂交袋，室温孵育2小时。

14.以1×TBST洗膜三次，每次10分钟。

Westernblot实验操作详细步骤1.样本制备：a.收集细胞或组织样本并加入提取缓冲液，破碎细胞或组织以释放蛋白质。

b.用超声波破碎机或搅拌器处理样本，使其彻底破碎。

c.避免加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂以防止蛋白质的降解。

2.蛋白质分离：a.将样本加入离心管中，并用高速离心分离细胞碎片和细胞核。

b.收集上清液，其中包含溶解的蛋白质。

3.蛋白质浓度测定：a. 使用BCA或Bradford等方法测定提取的蛋白质浓度。

b.根据需要调整蛋白质浓度，以确保每个样本使用相同的蛋白质量。

4.准备SDS-凝胶：a.准备解聚凝胶和浓缩凝胶以进行垂直电泳。

b.根据需要选择合适的胶百分比和凝胶组装器。

c.制备足够的凝胶和凝胶缓冲液。

5.蛋白质电泳：a.将蛋白质样本加入加载缓冲液，并在煮沸过程中使其变性。

b.将蛋白质样本加载至凝胶槽中。

c.根据需要在凝胶中加入预定分子量标记物，以便于蛋白质分子量的确定。

d.以恒定电流进行电泳，直到预定分子量标记物到达所需位置。

6.蛋白质转膜：a.选择合适的膜材料（例如聚偏氟乙烯或硝酸纤维素）。

b.用蛋白质转膜装置将凝胶上的蛋白质转移到膜上。

c.确保膜与凝胶完全贴合，并尽量避免气泡的产生。

7.阻塞和抗体孵育：a.将膜放入含有5%非脂奶粉或1%牛血清蛋白的TBST缓冲液中进行阻塞。

b.在蛋白质靶向抗体中稀释贮存液，并使用适当的稀释倍数进行孵育。

c.将膜和抗体一起放入摇床或孵育箱中，在适当的温度下进行孵育。

8.洗涤：a.用TBST缓冲液洗涤膜以去除未结合的抗体。

b.进行3至5次洗涤，每次洗涤持续5到10分钟。

9.二次抗体孵育：a.将膜放入稀释过的二抗溶液中进行孵育。

b.孵育时间和温度根据抗体种类和需求进行调整。

10.再洗涤：a.用TBST缓冲液进行大约3至5次洗涤。

b.确保彻底洗涤以去除未结合的二抗。

11.信号检测：a.使用化学发光或荧光探针对膜上的蛋白质进行检测。

b.按照探针供应商的说明进行操作。

Western blot 实验步骤及注意事项1.细胞蛋白提取1)25ml培养瓶弃干净培养基，可倒置于吸水纸或正立使液流至瓶底，用枪头吸净；再用预冷的PBS清洗3次，枪头吸净。

2)配制细胞裂解液RIPA:PMSF=100:1（PMSF使用浓度为1mM，由17.4mg PMSF粉末和1ml异丙醇配制），每培养瓶加200μl细胞裂解液。

于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动。

3)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5ml 离心管中。

（整个操作尽量在冰上进行）4)于4℃下 12000rpm 离心 15min。

（提前开离心机预冷）5)将离心后的上清分装转移至0.5min 的离心管中放于－80℃保存。

6)蛋白变性：蛋白上清与5x SDS蛋白上样缓冲液按4:1混合（即每100μl蛋白中加25μl缓冲液），置于100℃水浴箱中水浴5min使之充分变性，置于－20℃保存。

2.制胶与上样1)清洗玻璃板：扣紧玻璃板用洗洁精轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水超纯水冲洗干净后立在筐里晾干。

a 测漏实验（那个玻璃板装好，再整体装在板子上）2)灌胶与上样：（从一侧加入胶液9混匀，匀速加入）①10% SDS--- SDS 10g+水100ml （将10g SDS加到90ml水中,加热溶解，然后定容至100ml，室温保存;常温放置若出现沉淀，可放37℃水浴箱中温浴）②10%过硫酸铵（AP）---过硫酸铵 0.1g+超纯水10ml (溶解后，4℃保存，保存时间为1w)③根据分离胶及浓缩胶表的浓度制胶，分离胶灌胶后用无水乙醇或水压胶，灌浓缩胶后马上放梳子。

（胶一定要平，不留气泡）④配制电泳液：1L纯水+3.03g Tris+18.77 Glycine+1g SDS，溶解后室温保存。

⑤将玻璃板放入电泳槽中（小玻璃板向内，大玻璃板向外）。

加入足够电泳液，最少没过小玻璃板，两手捏住梳子两边轻轻拔出。

蛋白质的提取（整个过程冰上进行）一．组织膜蛋白裂解液bufferA+1%蛋白酶抑制剂蛋白保存液40%SDS+60%RIPA+1%蛋白酶抑制剂1.-80°C冰箱中取出组织放入研磨管中（研磨管和配套的研磨棒事先用去离子水冲洗，用纸吸干水)按600-700μl/100mg组织加裂解液研磨（研磨后研磨管和研磨棒用去离子水冲洗，用纸吸干水）2.用1000枪转入1.5ml离心管中4°C离心，1500转15min3.用1000枪将上清转入差速离心专用离心管中（离心管事先用去离子水冲洗）用裂解液配平4.差速离心33000-35000转（45000g）30min5.弃上清，沉淀加入150μl左右蛋白保存液（根据沉淀的量调整）用枪来回吹打使沉淀溶解，枪头在液面下，尽量不要出沫6.将上述液体分装到0.5ml离心管中，每管20-25μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存二．组织总蛋白裂解液40%SDS+60%RIPA+1%蛋白酶抑制剂1.-80°C冰箱中取出组织放入研磨管中（研磨管和配套的研磨棒事先要用去离子水冲洗，用干净的纸擦干)按600-700μl/100mg组织加裂解液研磨（研磨后研磨管和研磨棒用去离子水冲洗，用纸吸干水）2.用1000枪转入1.5ml离心管中4°C离心，13500转30min3.取上清分装到0.5ml离心管中，每管20-25μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存三．细胞总蛋白裂解液RIPA+1%蛋白酶抑制剂1.将培养瓶中培养液倒掉，加入PBS冲洗5-6遍，倒掉PBS，用枪吸出倒不尽的PBS2.每瓶加100-150μl裂解液，用细胞刮刀尽量将细胞刮下来（刮刀用前去离子水冲洗，用纸吸干水，用完一样处理）用200枪转入1.5ml离心管中3.超声破碎细胞，频率80-100间，超声探头（用前用纸擦，用后用纸擦并盖上盖）插入液面下，超声3-5s停3-5s，总共20s左右，停止5min左右4.重复上步4-6次5.4°C离心13500转15min6.取上清分装到0.5ml离心管中，每管40μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存。

培养细胞的流程
细胞培养是生物学实验中非常重要的一项技术，它可以用于细胞生物学研究、药物筛选、疾病模型建立等多个领域。

下面将介绍一般细胞培养的流程。

首先，准备工作。

在进行细胞培养前，需要准备培养皿、培养基、细胞传代所需的胰酶等材料。

同时需要消毒工作台和培养箱，确保实验环境的无菌。

接着，解冻细胞。

如果是从冷冻状态中取出细胞进行培养，首先需要将冻存管放入37摄氏度的水浴中迅速解冻，解冻后将细胞转移到预先加热的培养基中。

然后，传代细胞。

当细胞生长到一定密度时，需要进行传代操作，以保证细胞的健康生长。

传代操作需要用到胰酶等酶类物质，可以将细胞从培养皿中剥离出来，然后转移到新的培养皿中。

接下来，细胞培养。

将细胞悬浮在培养基中，放入培养箱中进行培养。

培养箱中需要保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度，以提供良好的生长环境。

最后，细胞观察和实验。

在细胞培养的过程中，需要定期观察细胞的形态和生长状态，确保细胞的健康生长。

同时可以进行相关的实验，如药物处理、基因转染等。

综上所述，细胞培养是一个复杂而又重要的实验技术，需要严格控制实验条件，确保细胞的健康生长。

通过以上流程，可以有效地进行细胞培养，并为后续的实验提供可靠的细胞基础。

一、细胞蛋白的抽提6孔细胞培养板中细胞培养液弃去，加入80ul 1×loading buffer，置冰上用刮刀刮匀，吸入EP管煮沸5min。

冷却后12000rpm低温离心5min，上清分装冻存（27ul/支）。

二、Western blot 试剂配方（一）母液1、1 mol/L Tris.HCl pH HCl mlTris 30.29g 7.4 17水200ml * 7.5 16 浓盐酸调pH，完后加H2O定容至250ml. 7.6 158.0 102、10% SDSSDS 10g水100ml 50℃水浴溶解3、10% 过硫酸胺（AP）过硫酸胺0.1g水 1.0ml 4.℃保存,1周内使用.4、1.5mol/L Tris.HCl（pH 8.8）Tris 45.43g水200ml浓盐酸调pH.至8.8，完后加H2O定容至250ml.5、1.0mol/L Tris.HCl（pH 6.8）Tris 30.29g水200ml浓盐酸调pH.至6.8，完后加H2O定容至250ml.6、30%聚丙烯酰胺丙烯酰胺14.55g甲叉双丙烯酰胺0.45g水20ml搅拌后加水到50ml 、棕色瓶４℃保存（１个月／更久）7、20%Tween 20Tween 20 20ml加水至100ml，４℃保存.8、TEMED 直接取用9、G250 考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）考马斯亮蓝G250 100mg95%乙醇50ml磷酸100ml加水至1000ml注：乙醇先溶解，再加磷酸、水，混匀后过滤，４℃保存。

（二）胶的配制（现配）10% 12%（常用）分离胶（μl）5% 浓缩胶（μl）水4000 3300 270030%丙烯烯酰胺3300 4000 6701.5M Tris.HCl（pH 8.8）2500 1M Tris.HCl（pH 6.8）50010% SDS 100 4010% AP（最后加）100 40TEMED（最后加） 4 4步骤：1、分离胶灌胶至离梳子下缘1cm左右，上覆水100~200μl，30~60min聚合；2、用滤纸吸去水，配浓缩胶，灌入，插入梳子，注意赶净气泡，约30min聚合；3、放入电泳液中，拔去梳子。